采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）进行非靶向代谢物谱型分析是研究代谢的重要手段。本文概述了用于血清非靶向代谢物谱型分析的典型工作流程，包括样本组织与制备、数据采集、数据分析、质量控制以及代谢物鉴定。
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本文内容
摘要
摘要
采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）进行非靶向代谢物谱分析是研究代谢的有力方法。该方法可提供无偏倚且深入的分析，有助于诊断检测方法的开发、新型疗法的探索，并进一步加深我们对疾病过程的理解。代谢组固有的化学多样性带来了显著的分析挑战，目前尚无单一实验方法能够检测所有代谢物。此外，个体代谢存在生物学差异，且代谢受环境因素影响，因此需要较大的样本量，以获得足够的统计效能，实现有意义的生物学解释。为应对这些挑战，本教程概述了一种基于UPLC-MS对血清进行大规模非靶向代谢物谱分析的分析工作流程。该流程包括样本组织与制备、数据采集、质量控制以及代谢物鉴定等方面的指导，可确保大规模实验获得可靠的数据，并为初次开展UPLC-MS非靶向代谢物谱分析的研究实验室提供起点。
引言
“代谢组学”这一术语可涵盖多种含义。例如，代谢组学实验可采用多种分析平台进行，如核磁共振（NMR）以及与质谱联用的气相和/或液相色谱技术。此外，代谢组学实验可采用靶向、非靶向或两者结合的方式进行。靶向代谢组学实验涉及对与特定生物学问题相关的一组分子进行定向分析（例如，分析三羧酸循环中的小分子可实现对该代谢通路的精确定量）。在此情况下，生物学假设决定了分析中所靶向的代谢物种类，且分析步骤也针对这些分子的检测进行了优化。相比之下，非靶向代谢组学实验则用于生成假设。此类实验以广泛且无偏倚的方式进行，旨在尽可能多地检测出代谢物。非靶向实验的结果将指导后续研究步骤（在许多情况下可能包括靶向代谢组学流程）。此外，也可将两种方法结合使用，即在以非靶向方式开展实验的同时，在数据中同步监测一组已知分子。
本文介绍的教程重点针对血清的非靶向代谢物谱分析。如上所述，非靶向方法能够无偏倚地呈现可检测的代谢物，可产生大量信息，并最终促进新发现。该方法的应用，特别是采用超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS），正日益广泛1, 2, 3，其流程包括以下步骤：（1）实验设计；（2）样品采集；（3）样品前处理；（4）通过UPLC-MS进行数据采集；（5）数据预处理（峰检测、积分、对齐与归一化）；（6）统计学数据分析（包括单变量与多变量分析）；（7）代谢物鉴定；以及（8）生物学解释。
目前，基于超高效液相色谱-质谱....
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方案
1. 样本准备
- 在电子表格中创建样品制备的板图时，第一列按上样顺序输入样品列表。在第二列中使用与您的自动进样器软件相匹配的正确命名方式，输入96孔板的位置信息。
- 每块板中预留一个孔用于质控（QC）样品。
- 如果您的液相色谱自动进样器可同时处理两块板，则将样品列表分为每批190个的批次，并将此信息保存在第二个工作表中。
- 在每个批次内，使用随机化功能 [注：Excel 中为 "=rand()"] 对进样顺序进行随机化。然后将随机化后的进样顺序复制并粘贴至液相质谱（LC-MS）样品队列软件系统中。随机化应在批次间、批次内进行，并在不同进样重复之间保持唯一性。
2. 血清和质控（QC）样本制备步骤
- 配制10 ml质控（QC）样品储备液，其中至少包含四种已知质量和保留时间的化合物，这些化合物应覆盖实验的色谱洗脱范围。（注：每种化合物浓度均为2 μg/ml，可选用咖啡因、利血平、磺胺二甲氧嘧啶和特非那定）。
- 将血清样品置于冰上解冻，并轻轻涡旋约5秒。
- 使用甲醇预润洗12通道移液器的吸头，以帮助防止在加样过程中出现滴漏。然后向96孔板的每个孔中加入370 μl冷甲醇。
- 根据板图将每个样品100 μl转移至对应的孔位。盖上封板膜，并在-80 °C下孵育30分钟，以沉淀蛋白质。
- 将板置于4 °C离....
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结果
采用UPLC-MS进行非靶向代谢物谱分析实验的基本分析步骤如图1所示。每个样本的原始数据可呈现为基峰色谱图。图2展示了本教程中梯度洗脱条件（a）下分析人血清样本的一个基峰色谱图示例。在完成上述统计分析后，将尝试对所有具有统计学显著性的分子特征进行代谢物鉴定。可靠的鉴定（1级）需要在相同的分析仪器上，实验获得的分子特征与假定代谢物的真实标准品在色谱保留时间、精确质量和碎片裂解模式三个方面均相匹配。图3展示了一个在人血清中对咖啡因进行1级鉴定的示例。
本文所述方案主要关注样本的组织与制备、超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）数据采集与质量控制，以及代谢物的分析鉴定。峰检测、峰对齐、归一化及统计分析等步骤对于非靶向代谢物谱分析实验的结果至关重要，然而，由于这些步骤存在多种可选方法和工具，本视频教程中未予涵盖。许多工具依赖于特定仪器厂商，尽管也有免费软件可供选择。上述方案中已展示了我们对这些步骤的处理方法示例。
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讨论
本教程旨在为通过超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS）开展大规模非靶向代谢物分析提供一个起点。该实验流程主要针对可使用甲醇水溶液提取、在C8或C18超高效液相色谱柱上保留，并以正离子模式检测的代谢物。当研究中无预先设定的特定代谢物类别偏向，且希望获得可用于提出假设的全局性代谢谱时，本方案具有重要价值，因其能够检测出多种化学类别（即 中等极性至非极性化合物）的血清代谢物中的大部分。若预算和时间允许，可通过引入多种提取方法、色谱分离条件及电离模式来轻松扩展代谢物的覆盖范围13,14 15。
在大规模实验中，数据可能需要在数周或数月内持续收集，因此数据随时间的稳定性是一个重要的分析考量因素。由于该方法具有无偏性和整体性，引入内标物（或一组内标物）进行数据归一化并不合适，甚至可能导致数据偏差，因为内标物能够代表整个代谢组这一假设并不成立。此外，鉴于血清本身存在天然的生物学变异，使用内源性内参对照应谨慎对待。通过规范的样本制备和随机化处理，并结合下文所述的归一化策略，可确保数据集的整体正态性。此外，在数据采集过程中使用易于量化且可追溯的质量控制指标.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
本教程由科罗拉多州立大学的蛋白质组学与代谢组学中心开展并开发，该中心部分资金由科罗拉多州立大学研究管理学术项目资源资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96 孔板 - 500 μl 孔 | VWR | 40002-020 | 用于样品制备 |
| 96 孔板封口膜 | VWR | 89026-514 | 用于样品制备 |
| 96 孔板 - 350 μl 孔 | Waters Corporation | WAT058943 | 用于样品进样 |
| 96 孔板封口膜 | Waters Corporation | 186000857 | 用于样品进样 |
| 96 孔板热封膜 | Waters Corporation | 186002789 | 可用于样品进样或长期储存 |
| 96 孔板热封仪 | Waters Corporation | 186002786 | |
| LC-MS 级甲醇 | Fluka | 34966 | |
| LC-MS 级乙腈 | Fluka | 34967 | |
| LC-MS 级水 | Fluka | 39253 | |
| LC-MS 级甲酸 | Fluka | 56302 | |
| 多通道电子移液器 | VWR | 89000-674 | |
| 移液器吸头 | Eclipse（通过 Light Labs 购买） | B-5061/B-4061 | |
| 冷冻离心机 - Allegra X-12R | Beckman Coulter | N/A - 联系 Beckman Coulter | |
| Acquity 超高效液相色谱（UPLC）系统 | Waters Corporation | N/A - 联系 Waters Corporation | |
| UPLC C8 色谱柱（梯度选项 a） | Waters Corporation | 186002876 | |
| UPLC T3 色谱柱（梯度选项 b） | Waters Corporation | 186003536 | |
| Xevo G2 Q-TOF 质谱仪 | Waters Corporation | N/A - 联系 Waters Corporation |
参考文献
- Theodoridis, G., Gika, H. G., Wilson, I. D. Mass Spectrometry-Based Holistic Analytical Approaches for Metabolite Profiling in Systems Biology Studies. Mass Spectrom. Rev. 30, 884-906 (2011).
- Zelena, E., et al.
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