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方法文章

大规模非靶向血清代谢组学分析：超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS）

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⸱

DOI：

10.3791/50242

⸱

2013年3月14日

 ,  , 
1Proteomics and Metabolomics Facility, Colorado State University

本文内容

摘要

采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）进行非靶向代谢物谱型分析是研究代谢的重要手段。本文概述了用于血清非靶向代谢物谱型分析的典型工作流程，包括样本组织与制备、数据采集、数据分析、质量控制以及代谢物鉴定。

摘要

采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）进行非靶向代谢物谱分析是研究代谢的有力方法。该方法可提供无偏倚且深入的分析，有助于诊断检测方法的开发、新型疗法的探索，并进一步加深我们对疾病过程的理解。代谢组固有的化学多样性带来了显著的分析挑战，目前尚无单一实验方法能够检测所有代谢物。此外，个体代谢存在生物学差异，且代谢受环境因素影响，因此需要较大的样本量，以获得足够的统计效能，实现有意义的生物学解释。为应对这些挑战，本教程概述了一种基于UPLC-MS对血清进行大规模非靶向代谢物谱分析的分析工作流程。该流程包括样本组织与制备、数据采集、质量控制以及代谢物鉴定等方面的指导，可确保大规模实验获得可靠的数据，并为初次开展UPLC-MS非靶向代谢物谱分析的研究实验室提供起点。

引言

“代谢组学”这一术语可涵盖多种含义。例如，代谢组学实验可采用多种分析平台进行，如核磁共振（NMR）以及与质谱联用的气相和/或液相色谱技术。此外，代谢组学实验可采用靶向、非靶向或两者结合的方式进行。靶向代谢组学实验涉及对与特定生物学问题相关的一组分子进行定向分析（例如，分析三羧酸循环中的小分子可实现对该代谢通路的精确定量）。在此情况下，生物学假设决定了分析中所靶向的代谢物种类，且分析步骤也针对这些分子的检测进行了优化。相比之下，非靶向代谢组学实验则用于生成假设。此类实验以广泛且无偏倚的方式进行，旨在尽可能多地检测出代谢物。非靶向实验的结果将指导后续研究步骤（在许多情况下可能包括靶向代谢组学流程）。此外，也可将两种方法结合使用，即在以非靶向方式开展实验的同时，在数据中同步监测一组已知分子。

本文介绍的教程重点针对血清的非靶向代谢物谱分析。如上所述，非靶向方法能够无偏倚地呈现可检测的代谢物，可产生大量信息，并最终促进新发现。该方法的应用，特别是采用超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS），正日益广泛1, 2, 3，其流程包括以下步骤：（1）实验设计；（2）样品采集；（3）样品前处理；（4）通过UPLC-MS进行数据采集；（5）数据预处理（峰检测、积分、对齐与归一化）；（6）统计学数据分析（包括单变量与多变量分析）；（7）代谢物鉴定；以及（8）生物学解释。

目前，基于超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）的非靶向代谢物谱分析及其后续数据预处理步骤尚无公认的标准化方法。这种缺乏标准化的情况部分源于代谢物谱分析的主要分析挑战之一：代谢物组的化学多样性。由于这种多样性，单一的提取方法或质谱采集方法无法在一次分析中全面覆盖所有代谢物。理论上，通过采用多种提取方法可最大化代谢物的覆盖范围（例如 水、甲醇、氯仿:甲醇 等等。）结合不同的色谱条件（例如 反相，亲水相互作用液相色谱 等等。）以及各种电离模式（例如 正离子，负离子，化学电离 等等。然而，研究人员通常对特定化学类别并无预先设定的偏好，因此进行多次提取和仪器检测的高昂成本往往并不必要，尤其是在大规模实验中。因此，本视频教程旨在提供一种利用超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS）对血清进行大规模非靶向代谢物谱分析的通用实验流程。该方法可使新建或已有实验室均能开展此类实验，并为拓展适用于不同样本类型、特定化学类别或靶向分析的研究奠定基础。具体而言，本方案包含以下步骤：血清样本制备、大规模研究的样本组织、UPLC-MS数据采集、质量控制（QC）程序以及代谢物鉴定。同时，本文也介绍了数据预处理与统计分析的策略。

本方案不涉及实验设计、样本采集或生物学数据分析的步骤，因为这些内容超出了本教程的范围。然而，文献中已有大量资源可供参考这些主题，作者鼓励刚进入代谢组学领域的研究人员充分查阅相关资料4, 5, 6, 7, 8, 9。特别是实验设计极为重要，是非靶向代谢组学实验成功的关键。必须考虑诸如适当的生物学重复、样本采集过程的一致性（例如台面放置时间、储存温度、储存时间、冻融次数、等等）等因素，以确保研究的可行性，并促进对数据进行恰当的生物学解释。

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方案

1. 样本准备

  1. 在电子表格中创建样品制备的板图时，第一列按上样顺序输入样品列表。在第二列中使用与您的自动进样器软件相匹配的正确命名方式，输入96孔板的位置信息。
  2. 每块板中预留一个孔用于质控（QC）样品。
  3. 如果您的液相色谱自动进样器可同时处理两块板，则将样品列表分为每批190个的批次，并将此信息保存在第二个工作表中。
  4. 在每个批次内，使用随机化功能 [注：Excel 中为 "=rand()"] 对进样顺序进行随机化。然后将随机化后的进样顺序复制并粘贴至液相质谱（LC-MS）样品队列软件系统中。随机化应在批次间、批次内进行，并在不同进样重复之间保持唯一性。

2. 血清和质控（QC）样本制备步骤

  1. 配制10 ml质控（QC）样品储备液，其中至少包含四种已知质量和保留时间的化合物，这些化合物应覆盖实验的色谱洗脱范围。（注：每种化合物浓度均为2 μg/ml，可选用咖啡因、利血平、磺胺二甲氧嘧啶和特非那定）。
  2. 将血清样品置于冰上解冻，并轻轻涡旋约5秒。
  3. 使用甲醇预润洗12通道移液器的吸头，以帮助防止在加样过程中出现滴漏。然后向96孔板的每个孔中加入370 μl冷甲醇。
  4. 根据板图将每个样品100 μl转移至对应的孔位。盖上封板膜，并在-80 °C下孵育30分钟，以沉淀蛋白质。
  5. 将板置于4 °C离心机中，以3,200 × g离心30分钟。取250 μl上清液转移至新的96孔板中，并重复离心步骤。
  6. 将上清液60 μl等分转移至三个适用于UPLC或LC自动进样器的96孔板中。
  7. 向板中预留的孔位加入100 μl质控（QC）样品混合液。
  8. 用粘性封板膜密封每块板。由于穿刺后孔内溶剂可能迅速挥发，因此每块板仅可进行一次进样。样品队列中的板可在短期内存放于-20 °C条件下。

3. UPLC-MS 数据采集

  1. 将自动进样器设置为 4 °C，并将前两块板放入自动进样器中。
  2. 使用两种可选的反相梯度之一建立采集方法。梯度A偏向于非极性分子，而梯度B可提高对中等极性分子的覆盖度。
    1. 梯度A：
      时间（min）%A%B曲线
      0.01000 
      0.110006
      1.060406
      3.030706
      11.001006
      17.001006
      17.110006
      23.010006
    2. 梯度B
      时间（min）%A%B曲线
      0.01000 
      110006
      135956
      165956
      16.0510006
      2010006
  3. 将质谱仪设置为正离子模式，扫描范围为50-1,200 m/z。其他具体仪器参数将根据所使用的系统而有所不同。以下为我们所使用的Waters Xevo G2 Q-TOF质谱仪的参数设置：碰撞能量 = 6 V；扫描时间 = 0.2 秒/次；毛细管电压 = 2,200 V；离子源温度 = 150 °C；去溶剂化温度 = 350 °C；去溶剂化气体流速（N₂）= 800 L/hr。
  4. 每个样品批次（包含2块板）开始时，先连续注射质控（QC）样品5次。前两次进样用于UPLC-MS系统的平衡，之后监测峰面积（<25% 相对标准偏差（RSD）、保留时间（±0.05 分钟）和质量精度（±3 ppm）的第三至第五次进样结果。这些参数可能需要根据用于数据采集的仪器的具体性能进行调整。
  5. 若质控样本通过，则对这两块板的血清样本进行数据采集。若质控样本未通过，则在问题解决且质控样本通过之前，不收集样本数据。在我们的实验室中，我们发现这些参数在连续三天的进样过程中均保持稳定即 注射2块96孔板）。如果发现系统在此期间不稳定，则可能需要更频繁地进行质控注射。质控样本的使用目的并非校正低质量数据，而是防止采集到低质量数据。

4. 峰检测、积分、对齐与归一化

执行这些步骤有多种可选方法，包括免费软件和厂商专用工具。本步骤在视频教程中已跳过，但以下将举例说明我们的方法。

对于每个样本，此类实验生成的分析数据是一组离子谱图，由保留时间、质荷比（m/z）值和谱图强度来描述。非靶向代谢物谱分析实验包含多个样本，因此必须进行峰检测、保留时间校正和归一化处理，以实现对数据集的后续统计分析。

  1. 使用 Waters DataBridge 软件将原始数据导出为 .cdf 格式。使用 XCMS 软件包10（可在 http://metlin.scripps.edu/xcms/ 免费获取）进行峰检测和保留时间对齐，该软件在 R 统计环境中运行11。网站提供了有关如何下载和运行该软件的文档。
  2. 在 XCMS 中使用“matchedfilter”方法，参数设置如下：半峰全宽 = 8 秒，信噪比（S/N）= 3，每个提取离子色谱图最多提取 100 个峰。执行特征分组、保留时间校正、重新分组和 fillPeaks 步骤。XCMS 软件的输出是一个数据矩阵，其中所有可检测的特征作为行列出，每个实验样品作为一列，每个单元格填充该样品中各特征的峰面积。为便于后续统计分析流程的整合，可能需要对该数据集进行转置。
  3. 在 R 中对数据矩阵进行归一化处理，即将每个样品中各特征的峰面积除以该样品的提取离子峰面积总和（即总离子流，TIC），再乘以 100,000，以便于数据的可视化解释。
  4. 去除异常值。数据中的异常值可能来源于良好样品的不良进样，或不良样品的良好进样。
    1. 在 R 中使用 outliers 软件包进行异常值检测，参数设置如下：(1) TIC 值和 (2) 主成分（PC）得分，置信水平为 99.9%。
    2. 若存在异常值，则删除相应的数据文件，并重新执行峰检测、对齐和归一化步骤。
  5. 根据样品标识符对归一化后的峰面积进行平均（以合并多次进样的数据）。此步骤必须在进行统计分析之前完成（注意：进样重复用于评估分析变异，但不能作为真正的生物学重复使用）。

5. 统计分析

在代谢组学实验中，多变量和单变量统计分析方法对于数据解读均是必需的。常用的两种技术包括主成分分析（Principal Component Analysis）和方差分析（Analysis of Variance, ANOVA）。数据的统计分析有多种实现方式，既有开源软件工具，也有商业软件可供选择。本步骤在视频教程中已被省略，但以下将举例说明我们的分析方法。

  1. 在 R 中将 aov 函数应用于数据集，执行方差分析（ANOVA）。
  2. 使用 Benjamini-Hochberg 方法（R 中的 p.adjust 函数）校正假阳性结果。
  3. 对经过帕累托缩放（也可使用单位方差缩放）和均值中心化的数据集进行主成分分析（PCA）。PC 得分和载荷均使用 R 中的 pcaMethods 软件包计算。
  4. 结合方差分析 p 值、载荷得分和倍数变化参数，确定最能描述实验处理相关变异的分子特征。
  5. 手动检查每个感兴趣的分子特征，判断其是否对应分子离子、加合物（例如 钠、钾或二聚体）或中性丢失。

6. 代谢物鉴定

本文展示的工作流程具有很强的通用性，可适用于任何仪器平台所得结果。替代策略将在讨论部分中介绍。

  1. 针对所有具有统计学显著性的特征（由第6步分析确定），检查原始数据，确认母离子、钠加合物、同位素峰及碎片离子在整套数据中呈现相似的变化趋势。例如，母离子的ANOVA分析所得p值应与其同位素峰相近，这表明这些分子特征来源于同一代谢物。
  2. 将具有统计学显著性的分子特征的精确质量测定值和/或中性丢失值（若多个同位素均显著，则选择C12同位素）与内部数据库（如有）或公开可用的代谢物数据库进行比对，例如：
    1. 人类代谢组数据库（http://www.hmdb.ca/）
    2. Metlin（http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php）
    3. Mass Bank（http://www.massbank.jp/?lang=en）
    4. Lipid Maps（http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html）
    5. 美国国家标准与技术研究院质谱检索（http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/）
  3. 使用软件根据显著分子特征的精确质量及同位素分布预测其分子式。在Waters软件中，可通过MassLynx软件包中的Elemental Comp工具完成此步骤。
  4. 根据以下因素对候选代谢物鉴定结果进行筛选：质量误差（应符合所用仪器平台的性能）、预测的分子式、在实验设计背景下观察到的趋势中的生物学相关性，以及保留时间（e.g. 在反相色谱中，脂质及其他非极性化合物的保留时间较长）。
  5. 开展后续实验，获取具有统计学显著性分子特征的MS/MS碎裂谱图。在条件允许的情况下，代谢物的鉴定应基于其实测碎裂峰和保留时间与同一仪器上测得的真实标准品的匹配结果。或者，也可将实验获得的碎裂谱图与谱图数据库进行比对。
  6. 所有报告的代谢物鉴定结果均应依据代谢组学标准倡议（metabolomics standards initiative）的建议进行置信度分级12。
    1级：基于与真实标准品在正交分析参数（精确质量、保留时间及MS/MS碎裂）上的匹配，实现高置信度的分子鉴定。
    2级：基于理化性质和/或与文献或谱图库的谱图相似性，进行初步鉴定。
    3级：基于理化性质或谱图相似性，对化合物类别进行初步鉴定。
    4级：未知化合物。

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结果

采用UPLC-MS进行非靶向代谢物谱分析实验的基本分析步骤如图1所示。每个样本的原始数据可呈现为基峰色谱图。图2展示了本教程中梯度洗脱条件（a）下分析人血清样本的一个基峰色谱图示例。在完成上述统计分析后，将尝试对所有具有统计学显著性的分子特征进行代谢物鉴定。可靠的鉴定（1级）需要在相同的分析仪器上，实验获得的分子特征与假定代谢物的真实标准品在色谱保留时间、精确质量和碎片裂解模式三个方面均相匹配。图3展示了一个在人血清中对咖啡因进行1级鉴定的示例。

本文所述方案主要关注样本的组织与制备、超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）数据采集与质量控制，以及代谢物的分析鉴定。峰检测、峰对齐、归一化及统计分析等步骤对于非靶向代谢物谱分析实验的结果至关重要，然而，由于这些步骤存在多种可选方法和工具，本视频教程中未予涵盖。许多工具依赖于特定仪器厂商，尽管也有免费软件可供选择。上述方案中已展示了我们对这些步骤的处理方法示例。

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讨论

本教程旨在为通过超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS）开展大规模非靶向代谢物分析提供一个起点。该实验流程主要针对可使用甲醇水溶液提取、在C8或C18超高效液相色谱柱上保留，并以正离子模式检测的代谢物。当研究中无预先设定的特定代谢物类别偏向，且希望获得可用于提出假设的全局性代谢谱时，本方案具有重要价值，因其能够检测出多种化学类别（即 中等极性至非极性化合物）的血清代谢物中的大部分。若预算和时间允许，可通过引入多种提取方法、色谱分离条件及电离模式来轻松扩展代谢物的覆盖范围13,14 15。

在大规模实验中，数据可能需要在数周或数月内持续收集，因此数据随时间的稳定性是一个重要的分析考量因素。由于该方法具有无偏性和整体性，引入内标物（或一组内标物）进行数据归一化并不合适，甚至可能导致数据偏差，因为内标物能够代表整个代谢组这一假设并不成立。此外，鉴于血清本身存在天然的生物学变异，使用内源性内参对照应谨慎对待。通过规范的样本制备和随机化处理，并结合下文所述的归一化策略，可确保数据集的整体正态性。此外，在数据采集过程中使用易于量化且可追溯的质量控制指标...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

本教程由科罗拉多州立大学的蛋白质组学与代谢组学中心开展并开发，该中心部分资金由科罗拉多州立大学研究管理学术项目资源资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96 孔板 - 500 μl 孔VWR40002-020用于样品制备
96 孔板封口膜VWR89026-514用于样品制备
96 孔板 - 350 μl 孔Waters CorporationWAT058943用于样品进样
96 孔板封口膜Waters Corporation186000857用于样品进样
96 孔板热封膜Waters Corporation186002789可用于样品进样或长期储存
96 孔板热封仪Waters Corporation186002786
LC-MS 级甲醇Fluka34966
LC-MS 级乙腈Fluka34967
LC-MS 级水Fluka39253
LC-MS 级甲酸Fluka56302
多通道电子移液器VWR89000-674
移液器吸头Eclipse（通过 Light Labs 购买）B-5061/B-4061
冷冻离心机 - Allegra X-12RBeckman CoulterN/A - 联系 Beckman Coulter
Acquity 超高效液相色谱（UPLC）系统Waters CorporationN/A - 联系 Waters Corporation
UPLC C8 色谱柱（梯度选项 a）Waters Corporation186002876
UPLC T3 色谱柱（梯度选项 b）Waters Corporation186003536
Xevo G2 Q-TOF 质谱仪Waters CorporationN/A - 联系 Waters Corporation

参考文献

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