使用高通量形状的RNA二级结构预测

Summary

的高通量选择性2'羟基的酰化反应分析的引物延伸（SHAPE）利用了一种新的化学探测技术，反转录，毛细管电泳确定结构的RNA二级结构预测软件从几百到几千个核苷酸，单核苷酸分辨率。

Abstract

了解RNA的功能涉及生物过程，需要全面了解的RNA结构。为此，该方法被称为“引物延伸”，或形状分析的高通量选择性的2'羟基的酰化，允许预测RNA二级结构的单核苷酸分辨率。这种方法利用化学探测剂，优先酰化的RNA在水溶液中的单链或柔性区域。化学修饰的位点被检测到的修饰的RNA的反转录，并在此反应中的产品是通过自动毛细管电泳（CE）分馏。由于修改后由SHAPE试剂在这些RNA的核苷酸逆转录酶暂停，由此产生的cDNA文库间接映射的上下文中的折叠的RNA的核糖核苷酸的单链。使用的电泳软件ShapeFinder，产生的自动化CE的处理和转换成菜单核苷酸反应表转换成伪能量约束在RNAStructure（V5.3）预测算法。二维形状探测在硅片 RNA二级结构预测相结合所获得的RNA结构被认为是比单独使用这两种方法得到的结构更准确。

Introduction

要了解催化和非编码RNA的功能，参与调控拼接，翻译，病毒的复制和癌症，RNA结构的详细知识是必需的^1,2。不幸的是，准确预测RNA折叠提出了一个严峻的挑战。古典探测剂遭受许多缺点，如毒性，不完整覆盖核苷酸和/或每100-150个核苷酸实验吞吐量有限。肉眼二级结构预测算法同样是不利的，因为不准确，致使他们无法有效区分大力相似的结构。特别大的RNA也常耐火材料，如X-射线晶体学和核磁共振（NMR）谱，由于它们的构象灵活性和大量的这些技术所需的高纯度的样品的三维结构的测定方法。

ħIGH-吞吐量形状可以解决许多这些问题提供一个有效的，简单的方法来探测的大RNA的结构，单核苷酸分辨率。此外，该试剂用于形状是安全的，易于处理，在大多数其他化学探测试剂相比，所有四个核糖反应。这些试剂也可以穿透细胞膜，使得有可能探测的RNA在其体内上下文（次^）3。最初⁴周实验室开发的，形状已经用于分析各种各样的RNA〜9 KB HIV-1 RNA基因组的完整的二级结构的测定，最显着的例子。其他显着的成果，使用形状感染类病毒^6，人长非编码RNA ^7，酵母核糖^8，9和核糖开关以及确定蛋白质结合位点的病毒体相关的HIV-1 RNA的结构，包括澄清。瓦其他地方^10-12法兰西岛大区的原件和高通量的变化形状协议已经公布，目前的工作提供了详细的说....

Protocol

引物设计和RNA的3'端延伸

要通过高通量的形状的长链核酸分析，应选择这样，他们属于（i）分离的〜300个核苷酸，（ⅱ）是20-30个核苷酸的长度，及（iii）RNA /引物杂交位点的一系列DNA杂交所产生的DNA退火站点有一个预期的熔融温度> 50℃。此外，高度结构化的，预测的核糖核酸的分类应该被避免，虽然作出这样的判断需要一定的预知的RNA结构，这通常是不可用的。 DNA引物杂交到这些网站，然后应设计，照顾，以确保他们预计不会形成稳定的二聚体或链内二级结构。

一旦设计，引物必须购买（ 例如集成DNA技术，爱荷华州Ames）或合成^24,25。 5'-标记引物用Cy5，Cy5.5标记，WellRedD2（Beckman Coulter公司），IRDye800（Lycor）/ WellRedD1（Beckman Coulter公司）的最适合于Beckman Coulter公司8000 CEQ，提供良好的信号强度，同时最大限度地减少串扰。标记的寡核苷酸可无限期存储小，10微米等分在-20°C，避免反复冷冻/解冻周期。

通过使用以这种方式设计的引物，它是寻找任意长度的一个完整的RNA未能获得形状数据。但是，该序列的RNA的3'末端处或附近总是无法访问SHAPE，除非工程包含（ 例如，一个“结构的磁带盒”）的3'末端延伸的引....

Results

RNA含有HIV-1转应答元件（RRE）和一个3'端结构的盒⁴从线性化的质粒进行体外转录，之后，将其折叠通过加热，冷却，和孵育在37℃下，在存在的MgCl _2。 RNA的暴露NMIA，然后从5'-末端标记的DNA杂交的引物的3'末端结构的磁带盒反转录。由此产生的形状的cDNA文库，连同控制和定序的反应，然后分馏使用Beckman Coulter公司CEQ 8000自动毛细管电泳系统，以产生图4中所示的电泳图谱。四个重叠，彩色编码的痕迹是由四组反应产物通过毛细管迁移的，如下所示：蓝（Cy5标记的RT产物产生的逆转录的NMIA修饰RNA），绿（Cy5.5标记RT产物从折叠，但除此之外unmodifi的编的RNA），黑色（WellRed D2-标记的DNA测序梯使用DDG）和红色（Lycor800标记的测序梯，DDT）。

原料CE痕迹分离，加工对准和集成使用ShapeFinder软件^18。相应的RRE SLII地区跟踪（次）的区域是描绘在图5

Discussion

我们在座的详细协议为高吞吐量形状，一种技术，使任何规模的RNA的单核苷酸分辨率为二级结构的测定。此外，耦合形状实验数据与二级结构预测算法有利于RNA二维模型生成具有更高的准确度可能比单独的任一方法。荧光标记的引物和自动CE的结合，提供了显着优于传统的基于凝胶的形状在一次实验中，有利于解决长的RNA序列，以及相当高的速度和通过多个实验。权宜之计此方法，并提供合适的数据分析工具，使形状非常适合于以往棘手的病毒，完整的使者，非编码RNA的结构分析。随着这些有趣的RNA的二维结构，变得更清晰，使用的羟自由基的探测，通过水疗CE裂解方法和分子模拟应该有助于阐明复杂的三级相互作用，并最终在三个方面，让研究人员能够确定这些RNA的结构。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂
N-甲基哌酸酐 （NMIA）	Life technologies	M25	溶于无水 DMSO
1-甲基-t-亚硝基酸酐 （1M7）	参见参考文献 22
上标 III 逆转录酶	Life 技术	18080044	10,000 单位
Thermo sequenase 循环测序试剂盒	Affymetrix	78500
材料由用户提供
感兴趣的			每次反应 6 pmol（检测限将由仪器决定）
四套 5' 标记引物（Cy5、Cy5.5、WellRed D2 和 WellRed D1/Licor IR800）			引物与 RNA 互补，用于逆转录和测序反应。列出的荧光基团最适合 Beckman Coulter 8000 CEQ。引物可以在内部购买或合成。
DNA 模板			DNA 用于测序反应，并且必须包含正在研究的 RNA 的序列 - 包括任何 3' 末端延伸（如果存在）。在适用的情况下，使用 RNA 转录模板通常很方便。
缓冲液
10x RNA 复性缓冲液			100 mM Tris-HCl pH 8.0,1 M KCl，1 mM EDTA
5X RNA 折叠缓冲液			200 mM Tris-HCl pH 8.0,25 mM MgCl2，2.5 mM EDTA，650 mM KCl。（该缓冲液可能会根据情况而变化（例如 pH， EDTA、Mg、RNase 抑制剂）
2.5X RT 混合物			4 &μ;l 5X 缓冲液，1 &μ;l 100 mM DTT，1.5 &μ;l 水，1 μl 10 mM dNTP，0.5 &μ;l SuperScript III.请注意，5X 缓冲液和 100 mM DTT 随购买 SuperScript III （Invitrogen） 提供。
GenomeLab 样品上样溶液 （Beckman Coulter）			注意： 避免多次冻融循环
EQUIPMENT
毛细管电泳	Beckman	CEQ8000
热循环仪	变化