高通量选择性2'羟基酰化结合引物延伸分析（SHAPE）利用一种新型化学探针技术，结合逆转录、毛细管电泳和二级结构预测软件，以单核苷酸分辨率测定长度从数百到数千个核苷酸的RNA结构。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
要理解RNA在生物过程中的功能，必须全面了解其结构。为此，一种名为“高通量选择性2'羟基乙酰化引物延伸分析”（SHAPE）的方法，能够以单核苷酸分辨率预测RNA的二级结构。该方法利用化学探针，在水溶液中优先乙酰化RNA的单链区域或柔性区域。通过逆转录检测RNA的化学修饰位点，反应产物经自动毛细管电泳（CE）分离。由于逆转录酶会在被SHAPE试剂修饰的RNA核苷酸处暂停，因此生成的cDNA文库可间接反映在折叠RNA结构中处于单链状态的核糖核苷酸位置。利用ShapeFinder软件，将自动毛细管电泳产生的电泳图谱处理并转化为核苷酸反应活性表，这些数据进一步转化为伪能量约束，输入RNAStructure（v5.3）预测算法中。结合SHAPE化学探针与in silico RNA二级结构预测所获得的二维RNA结构，其准确性显著高于单独使用任一方法所得的结构。
引言
为了理解参与剪接、翻译、病毒复制和癌症调控的催化性与非编码RNA的功能，需要对RNA结构有深入的了解1,2。然而，准确预测RNA折叠仍面临巨大挑战。传统的结构探针存在多种缺点，例如具有毒性、对核苷酸的覆盖不完全，以及每次实验通量仅限于100–150个核苷酸。未经辅助的二级结构预测算法同样存在不足，因其无法有效区分能量相近的结构而导致预测不准确。特别是对于较大的RNA分子，由于其构象灵活性以及X射线晶体学和核磁共振（NMR）波谱技术所需的大量高纯度样品，常常难以适用这些三维结构测定方法。
高通量SHAPE通过提供一种高效且简便的方法，在单核苷酸分辨率上探测大型RNA的结构，解决了上述诸多问题。此外，SHAPE所用试剂安全、易于操作，并且与大多数其他化学探针试剂不同，能够与全部四种核糖核苷酸发生反应。这些试剂还能穿透细胞膜，使得在体内环境中探测RNA结构成为可能3。SHAPE最初由Weeks实验室开发4，已被用于分析多种RNA，其中最著名的例子是确定了约9 kb的HIV-1 RNA基因组的完整二级结构5。其他利用SHAPE取得的重要成果包括解析感染性类病毒的结构6、人类长链非编码RNA7、酵母核糖体8以及核糖开关9的结构，并用于鉴定病毒颗粒相关HIV-1 RNA中的蛋白质结合位点3。尽管原始版本及高通量版本的SHAPE实验方案已在其他文献中发表10-12，但本文详细描述了使用荧光寡核苷酸、Beckman Coulter CEQ 8000遗传分析仪以及SHAPEfinder和RNAStructure（v5.3）软件进行高通量SHAPE测定RNA二级结构的具体流程。文中还包含了此前未发表的技术细节和故障排除建议。
SHAPE 的各种变体
SHAPE 及其变体方法的核心原理是将 RNA 水溶液暴露于亲电性酸酐，后者可选择性地酰化核糖的 2'-羟基（2'-OH）基团，在修饰位点形成体积较大的加合物。该化学反应可用于探究 RNA 局部结构动态特性，因为单链核苷酸更易形成有利于这些试剂发生亲电攻击的构象，而碱基配对或空间结构受限的核苷酸则反应性较低或不具反应性10通过从与修饰RNA特定位置杂交的荧光或放射性标记引物（“(+)”引物延伸反应）启动逆转录，可检测加合物形成位点。当逆转录酶（RT）无法通过酰化核糖核苷酸时，将产生一组cDNA产物，其长度对应于修饰位点。同时需进行对照实验，即使用未暴露于试剂的RNA进行“(-)”引物延伸反应，以排除DNA合成提前终止即 由于RNA结构或非特异性RNA链断裂而引起的“停顿”） 等等最后，使用从相同引物起始的两个双脱氧测序反应作为标记，通过电泳后将反应性核苷酸与RNA的一级序列进行比对定位。
在SHAPE技术的原始应用中，使用相同的32P末端标记引物进行(+)、(-)以及两个测序反应。这些反应的产物被加载到5-8%聚丙烯酰胺板胶的相邻加样孔中，并通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分离（图1）。可使用SAFA（半自动足迹分析软件）对传统SHAPE生成的凝胶图像进行定量分析13。
相比之下，高通量SHAPE技术采用荧光标记的引物和自动化毛细管电泳。具体而言，针对每个待研究的RNA区域，需要合成或购买一组四个具有相同序列但5'端带有不同荧光标记的DNA引物。这些带有不同标记的寡核苷酸用于启动两个SHAPE反应和两个测序反应，反应产物混合后通过自动化毛细管电泳（CE）进行分离和检测。使用原始方法，通过四组反应可获得100–150个核苷酸（nt）RNA的反应活性图谱，而高通量SHAPE则可从单个混合样品中解析出300–600 nt的RNA结构3。最多可同时分离8组反应，而在连续进行的12次毛细管电泳运行过程中，最多可制备96个样品用于分离分析（图2）。此外，为处理和分析CEQ及其他基因分析仪产生的数据而开发的SHAPEfinder软件，相比SAFA13或其他凝胶分析软件包，自动化程度更高，所需人工干预显著减少。
近年来出现了一些更先进的高通量方法，例如 PARS（RNA 结构的并行分析）14 和 Frag-Seq（片段测序）15，这些方法使用结构特异性酶而非烷基化试剂，并结合下一代测序技术来获取 RNA 结构信息。尽管这些技术具有吸引力，但核酸酶探针固有的诸多局限性仍然存在16。这些问题可在 SHAPE 测序（SHAPE-Seq）17 方案中得到克服，该方案在下一代测序之前，通过化学修饰和逆转录 RNA 的方式处理 RNA，类似于传统 SHAPE 中的操作。尽管这些方法可能代表了 RNA 结构测定的未来方向，但必须认识到下一代测序成本高昂，目前仍有许多实验室无法获得。
SHAPE 数据分析
遗传分析仪产生的数据以电泳图谱的形式呈现，其中通过毛细管检测器的样品荧光强度随迁移时间的变化被绘制为曲线图。该图谱由对应于四种用于检测不同荧光染料的荧光通道的重叠轨迹组成，每条轨迹包含对应于单个cDNA或测序产物的峰。电泳图谱数据以制表符分隔的文本文件形式从遗传分析仪导出，并导入到ShapeFinder转换与分析软件18中。
首先使用 ShapeFinder 对数据进行一系列数学变换，以确保迁移时间和峰面积分别准确反映反应产物的身份和数量。随后对峰进行比对和积分，并将结果与原始 RNA 序列一起制表。通过从每个 RNA 核苷酸对应的（+）值中减去对照值，并按如下所述对数据进行归一化，从而获得相应 RNA 片段的“反应活性图谱”。该图谱被导入 RNAstructure（v5.3）软件19,20，该软件将归一化的反应活性值转换为伪能量约束，并将其整合到 RNA 二级结构折叠算法中。将化学探针技术与折叠算法结合，可显著提高结构预测的准确性，优于单独使用任一方法的效果12,21。RNAstructure（v5.3）的输出结果包括以 SHAPE 反应活性图谱进行颜色编码的最低能量 RNA 二级结构图像，以及以文本形式表示的点括号（dot-bracket）结构。后者可进一步导出至专门用于展示 RNA 二级结构的图形化软件，如 Varna22 和 PseudoViewer23。
图1. 通过 SHAPE4,10 进行 RNA 结构测定的流程图。 (A) RNA 可来源于生物样本或通过体外转录获得。(B) 根据 RNA 来源，将其进行折叠或其他处理，并用 SHAPE 试剂进行修饰。(C) 使用荧光或放射性标记的引物进行逆转录。(D) 通过毛细管电泳或平板凝胶电泳对 cDNA 产物进行分离。(E) 片段分析。(F) RNA 结构预测。点击此处查看高清大图。
图2. 基于毛细管电泳的SHAPE技术具有高通量特性，可实现对多种RNA和/或同一种RNA的多个区段的快速分析。 （A） 表示一段RNA可被分为300-600个核苷酸的片段（以绿色、蓝色和红色进行颜色编码） （B） 使用不同组的荧光引物（黑色箭头）分别对RNA的不同区段进行探针检测 （C） 将多组反应混合后分别加入 A1、B1、C1 孔中， 等等分别对约3 kb的RNA1实现完全覆盖。RNA2、RNA3、RNA4等的反应产物可类似地制备，并在连续的电泳运行中进行分级分离。 单击此处查看大图。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
引物设计与RNA 3'末端的延伸
为了通过高通量SHAPE分析长链RNA，应选择一系列引物杂交位点，使其满足以下条件：（i）彼此间隔约300个核苷酸，（ii）长度为20–30个核苷酸，（iii）将DNA与这些位点退火后形成的RNA/DNA杂交体具有预期的熔解温度 >50 °C此外，应避免选择预测具有高度结构化的RNA区段，尽管做出此类判断需要对RNA结构有一定预先了解，而这种信息通常难以获得。应针对这些位点设计DNA引物，并需注意确保引物不会形成稳定的二聚体或分子内二级结构。
设计完成后，引物序列需进行采购（例如 来自 Integrated DNA Technologies，Ames，Iowa）或合成24,25Cy5、Cy5.5、WellRedD2（Beckman Coulter）和IRDye800（Lycor）/WellRedD1（Beckman Coulter）标记的引物最适合用于Beckman Coulter 8000 CEQ，可在提供良好信号强度的同时最大限度减少串扰。标记的寡核苷酸可长期储存于小量 10 μM -80°C 分装保存20 °C；避免反复冻融循环。
通过使用以此方式设计的引物，几乎可以获得任意长度RNA的完整SHAPE数据。然而，RNA的3'末端或其附近序列始终无法被SHAPE检测到，除非对该RNA进行改造以包含一个3'末端延伸结构例如 一个“结构卡盒”，引物可与之杂交4.
通过毛细管电泳进行RNA制备
尽管可使用生物样品中的RNA进行高通量SHAPE分析，但此处提供的方案已针对体外转录生成的RNA进行优化 体外 转录。使用商品化转录试剂盒（如Ambion的MegaShortScript）并结合MegaClear RNA纯化柱（Ambion），非常适合大量制备高纯度RNA。RNA应保存在TE缓冲液中，置于-20 °C 和 -80 °C为获得最佳结果，RNA 在变性及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中均应呈现均一状态。
1. RNA 折叠
- 在0.5 ml的微量离心管中，将12 pmol的RNA用水稀释至18 μl，加入2 μl的10X复性缓冲液，充分混匀。
- 在85 °C加热1分钟，然后以0.1 °C/秒的速率冷却至4 °C。
- 加入100 μl水和30 μl的5X折叠缓冲液。
- 在37 °C孵育30–60分钟，具体时间取决于所折叠的RNA。通常情况下，较长且结构更复杂的RNA的Mg2+依赖性折叠需要更长的孵育时间。
- 取72 μl等分样品，分别加入两个0.5 ml的微量离心管中：修饰组（+）和对照组（-）。
2. RNA的化学修饰
经过充分表征的亲电性SHAPE试剂包括异咯嗪酸酐（IA）、N-甲基异咯嗪酸酐（NMIA）、1-甲基-7-硝基异咯嗪酸酐（1M7）26和苯甲酰氰（BzCN）27其中，高通量SHAPE最常用的试剂是1M7和NMIA，仅有后者可商业购买（Life Technologies）。每种RNA的修饰试剂终浓度均需优化，以获得“单次撞击”修饰动力学。 即 溶液中大多数RNA在被分析的RNA区域仅发生一次修饰的状态11. 最佳浓度可通过在下方第2.1节表格所示浓度范围内设置多个不同试剂浓度的反应来确定。应选择能够产生易于检测信号、同时最小化长链与短链DNA合成产物之间信号强度差异的试剂浓度例如 图3).
图3. 由约360 nt RNA在（A）0、（B）2.5 mM或（C）10 mM 1M7处理后生成的SHAPE电泳图谱。 所有电泳图谱均以相同尺度显示。蓝色、绿色、红色和黑色曲线分别对应于（+）反应产物（Cy5）、（-）反应产物（Cy5.5）以及两个测序梯度（WellRed D2和IRDye800）。用于生成图像（B）的RNA经最优浓度1M7处理，显示出良好的峰分辨率和强度，且在整个图谱中信号衰减最小（左侧）。在此条件下，读长达到最大。相比之下，（A）中缺乏中等强度且分辨良好的峰，表明1M7浓度不足。相反，（C）中明显的信号衰减表明未达到单次撞击动力学，RNA发生了过度修饰。在这些情况下，特别是当逆转录酶预期不会到达RNA模板的5'末端时，读长将不理想。
- 制备 SHAPE 试剂（NMIA 或 1M7）的 10 倍浓度储备液。最佳方法是将少量试剂加入 1.5 ml 微量离心管中，然后加入 DMSO 至所需浓度。注意：SHAPE 试剂溶液在与 RNA 混合前必须保持无水状态。DMSO 应在室温下存放于干燥器中，并在使用前立即配制储备液，以尽量减少暴露于环境水蒸气的时间。
试剂 最佳 10X 浓度（溶于 DMSO） 试剂完全降解所需时间27 NMIA 10–100 mM 约 20 分钟 1M7 10–50 mM 70 秒
表 1. 用于 RNA 修饰的亲电试剂。 - 分别向修饰组（+）和对照组（-）反应体系中加入 8 μl 10X NMIA/1M7 或无水 DMSO。注意：对于 NMIA 和 1M7，无论所分析的 RNA 种类如何，2.5 mM 均已被证明是有效的起始浓度。
- 根据所用试剂，在 37 °C 下孵育 50 分钟（NMIA）或 5 分钟（1M7）。
- 通过加入 8 μl（0.1 体积）3 M NaOAc（pH 5.2）、8 μl 100 mM EDTA、240 μl（3 体积）冷乙醇以及 1 μl 10 mg/ml 糖原来沉淀 RNA。4 °C 冰箱中静置 2 小时，随后在 4 °C 下以 14,000 × g 离心 30 分钟。用冷的 70% 乙醇洗涤沉淀物两次。注意：为尽量减少盐类共沉淀（这可能会影响电泳过程中的峰分辨率），应尽量缩短冷藏时间、离心时间和降低离心速度。
- 用移液器吸除上清液，并将沉淀物在室温下空气中干燥 5 分钟。
- 将沉淀的 RNA 溶解于 10 μl TE 缓冲液中，在室温下孵育 5 分钟。此溶液中的 RNA 足够进行两次逆转录反应。未使用的部分应储存于 -20 °C。注意：通常无需机械重悬沉淀物，因其可能损伤 RNA。
3. 逆转录
此步骤产生荧光标记的 cDNA 产物，用于间接鉴定 RNA 核苷酸被 SHAPE 试剂修饰的程度。在 SHAPE 实验中，Superscript III（Invitrogen）逆转录酶的表现优于所有其他测试的逆转录酶，因此本实验方案选用该酶。使用 Cy5 和 Cy5.5 标记的寡核苷酸分别作为 (+) 和 (-) 反应的引物。对于较短的 RNA，引物与天然 RNA 的 3' 末端延伸区杂交例如 一种“结构盒”）以获取关于3'末端的信息4. 注意： 从此时起至 CE 结束，样品应避光保存。
- 在0.5 ml离心管中准备用于逆转录的(+)和(-)样品。对于(+)RT反应，混合5 μl修饰RNA (+)、6 μl水和1 μl Cy5标记引物（10 μM）；对于(-)RT反应，混合5 μl对照RNA (-)、6 μl水和1 μl Cy5标记引物（10 μM）。注意：建议使用Sarstedt PCR管（货号 72.735.002）进行本实验。
- 将离心管放入热循环仪中，通过以下程序使引物与RNA退火并准备进行逆转录：85 °C，1 min；60 °C，5 min；35 °C，5 min；50 °C，保温。
- 在退火步骤期间，根据所需进行的反应数量准备足够量的2.5X逆转录混合液，并额外增加50%（例如，对于两个(+)和两个(-)反应，按4.5倍比例放大）。每个反应需要8 μl，具体如下：4 μl 5x RT缓冲液、1 μl 100 mM DTT、1.5 μl水、1 μl 10 mM dNTPs、0.5 μl SuperScript III RT。置于冰上保存。注意：5X RT缓冲液和100 mM DTT随SuperScript III RT试剂提供。
- 当退火混合物温度达到50 °C时，向(+)和(-)反应中各加入8 μl 2.5X RT混合液。建议：在加入反应体系前，将RT混合液在37 °C预热5 min。
- 在50 °C孵育50 min，然后冷却至4 °C和/或置于冰上。注意：逆转录反应孵育时间超过50 min可能导致异常的cDNA产物。
- 通过加入1 μl 4 M NaOH并在95 °C加热3 min以水解RNA。将反应物在冰上冷却，然后加入2 μl 2 M HCl进行中和。注意：省略此步骤会导致cDNA产物分离质量差。
- 合并(+)和(-)反应产物，通过加入0.1体积的3 M NaOAc、0.1体积的100 mM EDTA、1.5体积的预冷乙醇以及1 μl 10 mg/ml糖原沉淀cDNA。4 °C冰箱中静置2 hr，然后在4 °C以14,000 x g离心30 min。用预冷的70%乙醇洗涤沉淀两次。注意：以更高转速或更长时间离心会导致沉淀难以重悬。
- 将沉淀的cDNA溶于40 μl去离子甲酰胺中，65 °C加热10 min，随后剧烈涡旋振荡超过30 min以充分溶解。注意：沉淀可能不可见。电泳后无信号或信号微弱可能是由于此阶段未能充分溶解沉淀所致。
4. 测序梯度的制备
测序阶梯用作数据处理过程中确定核苷酸位置的标记物。这些测序阶梯使用 USB Cycle Sequencing 试剂盒（#78500）、与所研究 RNA 序列相同的 DNA 以及用 WellRed D2 或 D1/Lycor 800 标记的引物生成。通常，该反应中使用的 DNA 即为用于转录目标 RNA 的模板 DNA。尽管此处提供的反应方案与试剂盒制造商推荐的方案相似，但反应体系已放大数倍。在下述反应中使用 ddA 和 ddT 作为链终止剂，但也可使用任意一对终止剂来生成测序阶梯。
- 将40 μl ddA终止混合物、5 pmol DNA模板、4.6 μl 10X Sequenase缓冲液、10 μl WellRed D2标记引物、4.6 μl Sequenase以及适量水混合，使总体积达到82 μl。Sequenase应在最后加入。以相同方式制备第二个测序反应，使用ddT和Licor IR800标记引物。
- 按照USB推荐条件进行PCR扩增。注意：对于使用加热盖的实验方案/热循环仪，无需也不建议添加矿物油。
- 将ddA和ddT测序反应液合并至一个1.5 ml微量离心管中（总体积约164 μl）。
- 按如下步骤沉淀DNA：加入16 μl 3 M NaOAc（pH 5.2）、16 μl 100 mM EDTA、1 μl 10 mg/ml糖原和480 μl 95%乙醇。充分混匀，在4 °C下孵育30分钟，随后在4 °C下以14,000 × g离心30分钟。
- 将沉淀的cDNA溶于100 μl去离子甲酰胺中，先在65 °C加热10分钟，再剧烈涡旋振荡至少30分钟。
5. 通过毛细管电泳对反应产物进行分级分离
毛细管电泳可实现将四个反应混合为单个样本后的cDNA合成产物进行同时分离。每次运行可同时分离8个样本，单次运行最多可分离96个样本（图2）。
- 将40 μl的混合SHAPE样品与10 μl的混合测序梯度样品混合，转移至96孔样品板中。注意：使用贝克曼库尔特CEQ 8000遗传分析仪时，必须使用贝克曼库尔特的试剂和板（包括LPA-I凝胶、运行缓冲液、矿物油、样品上样溶液以及样品板和缓冲液板）。
- 根据制造商的说明，对毛细管电泳仪器进行程序设置和准备，并启动运行。注意：为获得最佳样品分辨率，请使用先前发表的CAFA方法参数28。
理想情况下，除引物和强终止峰外，所有四个电泳图谱迹线中每个峰的信号均应处于线性范围内；信号的逐渐衰减是可以接受的。然而，有时即使在对照反应中也明显存在较大的峰（终止峰），这些峰可能干扰后续的数据处理。导致这些峰出现的截短cDNA可能是逆转录过程中遇到天然障碍所致例如 RNA二级结构）或RNA降解。在前一种情况下，添加如甜菜碱等试剂可能改善逆转录酶的持续合成能力，并减少逆转录过程中的暂停或提前终止。
数据处理
ShapeFinder 软件可让用户对毛细管电泳（CE）图谱进行可视化和转换，并将其转化为 SHAPE 反应活性图谱18。在获得反应活性值后，将对其进行标准化处理，并导入 RNAStructure（v5.3）以生成和优化二级结构模型。
6. ShapeFinder 软件
作为 BaseFinder 痕迹处理平台的扩展29，ShapeFinder 的已发布版本可免费用于非商业用途18。ShapeFinder 的数据处理详细操作说明随软件文档一并提供。
- 将毛细管电泳（CEQ）的电泳图导入 ShapeFinder 软件，对其进行校正，以消除以下因素的影响：（i）荧光背景，（ii）不同荧光通道之间的光谱重叠，（iii）不同标记引物引起的迁移率偏移，（iv）不同荧光染料标记的相同产物之间的荧光强度差异，以及（v）因逆转录提前终止导致的信号衰减。
- ShapeFinder 软件中“比对与积分”工具的“设置”功能会自动为各个峰分配身份，并根据用户输入及两条测序梯形条带将峰与 RNA 序列对应。尽管初始分配通常不够准确，但可使用同一工具的“修改”功能手动校正错误。最后，“拟合”功能计算比对后（+）和（-）反应峰下的面积，并将这些反应性值及其对应的核苷酸编号整理成制表符分隔的文本文件。
注意： 数据分析对于SHAPE的准确性至关重要，在分析过程中需考虑一些非常重要的因素，包括：
- 信噪比：信噪比应足够高，以确保即使在反应活性较低的位置，各个峰也易于识别。尽管ShapeFinder提供了数据平滑选项，但应极为谨慎地使用此功能，因为它可能扭曲后续分析结果。
- 分析区域：通常，可从长度为300–600 nt的cDNA中获得可靠数据，其起始位置位于引物3'末端下游40–80 nt处，终止位置则为信号衰减至难以与背景噪声区分的水平处。若需分析更长的RNA片段，则需使用多组引物；此时建议各引物组之间可靠信号的重叠区域保持在30–50 nt范围内。对于较短的RNA，由于逆转录酶常可到达RNA模板的末端，必须注意排除因DNA合成强终止效应而影响信噪比的峰信号。
- 信号衰减：信号衰减与实验过程中RNA修饰的程度以及逆转录酶（RT）的不完全过程性有关。理想情况下，针对所分析的RNA区域应实现单次命中动力学，以最大化读长。ShapeFinder包含一种可有效校正信号衰减的工具；然而，由于该方法在单次命中动力学未实现时容易引入分析误差，因此最好在信号衰减较小时使用即，当峰的分布符合单次击中动力学时）。最近，已有改进的算法用于转换信号衰减30 如果在特定实验中信号衰减尤为值得关注，则应对此进行深入研究。
- 信号缩放。在SHAPE数据分析中，这一步骤可能是最具主观性的。应调整对照图谱的缩放比例，使其中最低反应活性的（+）和（-）条带的峰强度相等。若对照图谱被过度缩放，将导致第一四分位中出现大量负反应活性值（参见下文数据归一化）。此时，应相应降低缩放因子并重新进行数据积分。
- 峰归属。通常情况下，自动化的峰归属效果良好。然而，当该过程失败时，用户必须确保软件已识别出所有峰，尤其是在信噪比较低的情况下。例如，肩峰并不总是能够被检测到，而富含G的序列常常会发生压缩。
7. 数据标准化
为了将核苷酸反应性谱图整合到 RNAStructure（v5.3）软件所使用的二级结构算法中，和/或比较密切相关RNA的谱图，必须以标准化的方式对SHAPE数据进行归一化处理12。该过程包括：（i）在后续计算中排除异常值；（ii）确定“有效最大”反应性（即，排除异常值后反应性值最高的8%的平均值）；以及（iii）将所有反应性值除以“有效最大”反应性进行归一化，具体如下：
- 打开比对与整合后生成的制表符分隔文本文件，将其内容复制到 Excel 电子表格中。该文件最右侧的列（RX.area-BG.area）包含为 RNA 每个核苷酸计算出的绝对 SHAPE 反应活性值。最左侧的列将该反应活性与 RNA 序列相关联。
- 使用 Excel 函数“=QUARTILE(array,quart)”计算并存储（RX.area-BG.area）的第一和第三四分位数（即，第 25 和第 75 百分位数）值。
- 计算并存储四分位距差值“=QUARTILE(array, 3)-QUARTILE(array, 1)”。
- 使用公式“=(QUARTILE, array,3)+1.5*((QUARTILE(array,3)-QUARTILE(array,1))”计算并存储“离群值截断值”。所有大于该值的反应活性值应在后续计算中予以排除。
- 将（RX.area-BG.area）中的反应活性值复制并粘贴到相邻的空白列中，然后对这些值进行排序，使最大值位于该列顶部。
- 在新创建的“排序值列”中，删除大于离群值截断值的数值。
- 计算并存储“排序值列”中剩余的最大 8% 反应活性值的平均值。该值即为“有效最大”反应活性。
- 将每个核苷酸的未排序（RX.area-BG.area）值（包括离群值）除以“有效最大”反应活性值，以获得“归一化反应活性值”。将这些值存储在空白列中，并在其左侧保留一个空白列。然后，将表格左侧的核苷酸编号复制并粘贴到“归一化反应活性值”左侧的空白列中。
- 将核苷酸位置与归一化反应活性值的配对数据复制并粘贴到文本编辑器中。
- 删除低于 -0.09 的值（即，将这些位置留空），因为这些值很可能是由于 cDNA 合成过程中逆转录酶暂停所致，而非模板的化学修饰引起。此外，对于在未修饰模板上观察到强烈暂停的核苷酸（通过目视检查“Align and Integrate” ShapeFinder 谱图确定），其反应活性值也应予以排除。
- 将文件保存为扩展名为 .shape 的文件，用于 RNAstructure（v5.3）软件中的结构分析。
8. 数据建模
使用 SHAPE 分析获得的伪自由能约束，通过 RNAstructure（v5.3）软件预测经实验支持的 RNA 二级结构19该软件可提供最低能量的二维RNA结构的图形化表示，以及以点括号表示法呈现的这些结构的文本形式。后者可导入用户首选的RNA结构查看器中。 例如 伪影查看器23 或瓦尔纳22，以生成符合出版要求的图像。
注意：在使用 RNAstructure（v5.3）软件生成的结构时需格外谨慎。例如，该软件无法解析三级相互作用，如假结（pseudoknots）和吻环（kissing loops），也无法判断某个区域反应性缺失是由于碱基配对还是由结合蛋白造成的空间位阻所致。因此，在提出确定的结构模型时，必须综合考虑这些因素以及软件所报告的各个结构的能量值。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
含有HIV-1 rev反应元件（RRE）和3'末端结构盒的RNA4 由线性化质粒制备 体外 转录，随后通过加热、冷却及孵育进行折叠 37 °C 在 MgCl₂ 存在下2RNA经NMIA处理后，通过与3'末端结构盒杂交的5'端标记DNA引物进行逆转录。所获得的SHAPE cDNA文库连同对照及测序反应产物，随后采用贝克曼库尔特CEQ 8000全自动毛细管电泳系统进行分离，得到如图所示的电泳图谱 图4四条重叠且以颜色编码的轨迹由四组反应产物在毛细管中的迁移产生，具体如下：蓝色（来自NMIA修饰RNA逆转录生成的Cy5标记的RT产物）、绿色（来自折叠但未修饰RNA的Cy5.5标记的RT产物）、黑色（使用ddG生成的WellRed D2标记的DNA测序梯度）和红色（Lycor800标记的测序梯度，ddT）。
原始毛细管电泳图谱使用 ShapeFinder 软件进行分离、处理、比对和积分18对应于RRE SLII区域的轨迹部分如图所示 图5，...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文介绍了一种高通量SHAPE技术的详细实验方案，该技术能够以单核苷酸分辨率测定任意长度RNA的二级结构。此外，将实验获得的SHAPE数据与二级结构预测算法相结合，可生成比单独使用任一方法更为精确的RNA二维模型。通过使用荧光标记引物并结合自动毛细管电泳（CE），该方法相较于传统的凝胶电泳SHAPE具有显著优势，能够在单次实验中解析长链RNA序列，并大幅提高多个实验的运行速度和通量。该方法的高效性以及配套数据分析工具的可用性，使其特别适用于此前难以分析的病毒RNA、完整信使RNA和非编码RNA的结构研究。随着这些引人关注的RNA二级结构日益清晰，羟基自由基探针、空间切割技术及分子建模方法的应用将有助于阐明复杂的三级相互作用，并最终使研究人员得以确定这些RNA的三维结构。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
S. Lusvarghi、J. Sztuba-Solinska、K.J. Purzycka、J.W. Rausch 和 S.F.J. Le Grice 获得美国国立卫生研究院国家癌症研究所院内研究计划的支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| N-甲基异邻苯二甲酰亚胺（NMIA） | Life technologies | M25 | 溶于无水DMSO中 |
| 1-甲基-t-硝基异邻苯二甲酰亚胺（1M7） | 参见参考文献22 | ||
| Superscript III 逆转录酶 | Life technologies | 18080044 | 10,000 单位 |
| Thermo sequenase 循环测序试剂盒 | Affymetrix | 78500 | |
| 用户自备材料 | |||
| 目标RNA | 每反应6 pmol（检测下限由仪器决定） | ||
| 四组5'端标记引物（Cy5、Cy5.5、WellRed D2 和 WellRed D1/Licor IR800） | 引物与目标RNA互补，用于逆转录和测序反应。所列荧光染料适用于Beckman Coulter 8000 CEQ系统。引物可外购或自行合成。 | ||
| DNA模板 | DNA用于测序反应，必须包含所研究RNA的序列——包括任何3'端延伸序列（如存在）。在适用情况下，通常可方便地使用RNA转录模板。 | ||
| 缓冲液 | |||
| 10× RNA复性缓冲液 | 100 mM Tris-HCl pH 8.0，1 M KCl，1 mM EDTA | ||
| 5× RNA折叠缓冲液 | 200 mM Tris-HCl pH 8.0，25 mM MgCl2，2.5 mM EDTA，650 mM KCl。（该缓冲液可根据具体情况调整（例如 pH、EDTA、Mg、RNase抑制剂）） | ||
| 2.5× 逆转录混合液 | 4 μl 5× 缓冲液，1 μl 100 mM DTT，1.5 μl 水，1 μl 10 mM dNTPs，0.5 μl SuperScript III。注意：5× 缓冲液和100 mM DTT随SuperScript III（Invitrogen）购入时提供。 | ||
| GenomeLab 样品上样溶液（Beckman Coulter） | 注意： 避免反复冻融 | ||
| 仪器设备 | |||
| 毛细管电泳仪 | Beckman | CEQ8000 | |
| 热循环仪 | 型号各异 |
参考文献
- Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).
- Moore, P. B., Steitz, T. A. The roles of RNA in the synthesis of protein. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a003780(2011).
- Wilkinson, K. A., et al. High-throughput SHAPE analysis reveals structures in HIV-1 genomic RNA strongly conserved across distinct biological states. Plos Biol. 6, 883-899 (2008).
- Merino, E. J., Wilkinson, K. A., Coughlan, J. L., Weeks, K. M. RNA structure analysis at single nucleotide resolution by selective 2 '-hydroxyl acylation and primer extension (SHAPE). J. Am. Chem. Soc. 127, 4223-4231 (2005).
- Watts, J. M., et al. Architecture and secondary structure of an entire HIV-1 RNA genome. Nature. 460, 711-716 (2009).
- Xu, W., Bolduc, F., Hong, N., Perreault, J. P. The use of a combination of computer-assisted structure prediction and SHAPE probing to elucidate the secondary structures of five viroids. Mol. Plant Pathol. , (2012).
- Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Structural architecture of the human long non-coding RNA, steroid receptor RNA activator. Nucleic Acids Res. 40, 5034-5051 (2012).
- Leshin, J. A., Heselpoth, R., Belew, A. T., Dinman, J. High-throughput structural analysis of yeast ribosomes using hSHAPE. RNA Biol. 8, 478-487 (2011).
- Souliere, M. F., Haller, A., Rieder, R., Micura, R. A powerful approach for the selection of 2-aminopurine substitution sites to investigate RNA folding. J. Am. Chem. Soc. 133, 16161-16167 (2011).
- Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2 '-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nat. Protoc. 1, 1610-1616 (2006).
- McGinnis, J. L., Duncan, C. D. S., Weeks, K. M. High-Throughput Shape and Hydroxyl Radical Analysis of Rna Structure and Ribonucleoprotein Assembly. Method Enzymol. 468, 67-89 (2009).
- Low, J. T., Weeks, K. M. SHAPE-directed RNA secondary structure prediction. Methods. 52, 150-158 (2010).
- Das, R., Laederach, A., Pearlman, S. M., Herschlag, D., Altman, R. B. S. A. F. A. Semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments. Rna-a Publication of the Rna Society. 11, 344-354 (2005).
- Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467, 103-107 (2010).
- Underwood, J. G., et al. FragSeq: transcriptome-wide RNA structure probing using high-throughput sequencing. Nat. Methods. 7, 995-1001 (2010).
- Mauger, D. M., Weeks, K. M. Toward global RNA structure analysis. Nat. Biotechnol. 28, 1178-1179 (2010).
- Lucks, J. B., et al. Multiplexed RNA structure characterization with selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11063-11068 (2011).
- Vasa, S. M., Guex, N., Wilkinson, K. A., Weeks, K. M., Giddings, M. C. ShapeFinder: a software system for high-throughput quantitative analysis of nucleic acid reactivity information resolved by capillary electrophoresis. RNA. 14, 1979-1990 (2008).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).
- Pang, P. S., Elazar, M., Pham, E. A., Glenn, J. S. Simplified RNA secondary structure mapping by automation of SHAPE data analysis. Nucleic Acids Res. 39, e151(2011).
- Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 97-102 (2009).
- Darty, K., Denise, A., Ponty, Y. VARNA: Interactive drawing and editing of the RNA secondary structure. Bioinformatics. 25, 1974-1975 (2009).
- Byun, Y., Han, K. PseudoViewer: web application and web service for visualizing RNA pseudoknots and secondary structures. Nucleic Acids Res. 34, 416-422 (2006).
- Brown, T., Brown, D. J. S. Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach. Eckstein, F. , IRL Press. 20(1990).
- Legiewicz, M., et al. The RNA Transport Element of the Murine musD Retrotransposon Requires Long-range Intramolecular Interactions for Function. J. Biol. Chem. 285, 42097-42104 (2010).
- Steen, K., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Syntheis of 1-methyl-8-nitroisatoic anhydride (1M7). Protocol Exchange. , (2011).
- Mortimer, S. A., Weeks, K. M. A fast-acting reagent for accurate analysis of RNA secondary and tertiary structure by SHAPE chemistry. J. Am. Chem. Soc. 129, 4144-4145 (2007).
- Mitra, S., Shcherbakova, I. V., Altman, R. B., Brenowitz, M., Laederach, A. High-throughput single-nucleotide structural mapping by capillary automated footprinting analysis. Nucleic Acids Res. 36, e63(2008).
- Giddings, M. C., Severin, J., Westphall, M., Wu, J., Smith, L. M. A software system for data analysis in automated DNA sequencing. Genome Res. 8, 644-665 (1998).
- Aviran, S., et al. Modeling and automation of sequencing-based characterization of RNA structure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 11069-11074 (2011).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
