高通量选择性2'羟基酰化结合引物延伸分析（SHAPE）利用一种新型化学探针技术，结合逆转录、毛细管电泳和二级结构预测软件，以单核苷酸分辨率测定长度从数百到数千个核苷酸的RNA结构。
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本文内容
摘要
摘要
要理解RNA在生物过程中的功能，必须全面了解其结构。为此，一种名为“高通量选择性2'羟基乙酰化引物延伸分析”（SHAPE）的方法，能够以单核苷酸分辨率预测RNA的二级结构。该方法利用化学探针，在水溶液中优先乙酰化RNA的单链区域或柔性区域。通过逆转录检测RNA的化学修饰位点，反应产物经自动毛细管电泳（CE）分离。由于逆转录酶会在被SHAPE试剂修饰的RNA核苷酸处暂停，因此生成的cDNA文库可间接反映在折叠RNA结构中处于单链状态的核糖核苷酸位置。利用ShapeFinder软件，将自动毛细管电泳产生的电泳图谱处理并转化为核苷酸反应活性表，这些数据进一步转化为伪能量约束，输入RNAStructure（v5.3）预测算法中。结合SHAPE化学探针与in silico RNA二级结构预测所获得的二维RNA结构，其准确性显著高于单独使用任一方法所得的结构。
引言
为了理解参与剪接、翻译、病毒复制和癌症调控的催化性与非编码RNA的功能，需要对RNA结构有深入的了解1,2。然而，准确预测RNA折叠仍面临巨大挑战。传统的结构探针存在多种缺点，例如具有毒性、对核苷酸的覆盖不完全，以及每次实验通量仅限于100–150个核苷酸。未经辅助的二级结构预测算法同样存在不足，因其无法有效区分能量相近的结构而导致预测不准确。特别是对于较大的RNA分子，由于其构象灵活性以及X射线晶体学和核磁共振（NMR）波谱技术所需的大量高纯度样品，常常难以适用这些三维结构测定方法。
高通量SHAPE通过提供一种高效且简便的方法，在单核苷酸分辨率上探测大型RNA的结构，解决了上述诸多问题。此外，SHAPE所用试剂安全、易于操作，并且与大多数其他化学探针试剂不同，能够与全部四种核糖核苷酸发生反应。这些试剂还能穿透细胞膜，使得在体内环境中探测RNA结构成为可能3。SHAPE最初由Weeks实验室开发4，已被用于分析多种RNA，其中最著名的例子是确定了约9 kb的HIV-1 RNA基因组的完整二级结构5。其他利用SHAPE取得的重要成果包括解析感染性类病毒的结构6、人类长链非编码RNA7、酵母核糖体8以及核糖开关9的结构，并用于鉴定病毒颗粒相关HIV-1 RNA中的蛋白质结合位点....
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方案
引物设计与RNA 3'末端的延伸
为了通过高通量SHAPE分析长链RNA，应选择一系列引物杂交位点，使其满足以下条件：（i）彼此间隔约300个核苷酸，（ii）长度为20–30个核苷酸，（iii）将DNA与这些位点退火后形成的RNA/DNA杂交体具有预期的熔解温度 >50 °C此外，应避免选择预测具有高度结构化的RNA区段，尽管做出此类判断需要对RNA结构有一定预先了解，而这种信息通常难以获得。应针对这些位点设计DNA引物，并需注意确保引物不会形成稳定的二聚体或分子内二级结构。
设计完成后，引物序列需进行采购（例如 来自 Integrated DNA Technologies，Ames，Iowa）或合成24,25Cy5、Cy5.5、WellRedD2（Beckman Coulter）和IRDye800（Lycor）/WellRedD1（Beckman Coulter）标记的引物最适合用于Beckman Coulter 8000 CEQ，可在提供良好信号强度的同时最大限度减少串扰。标记的寡核苷酸可长期储存于小量 10 μM -80°C 分装保存20 °C；避免反复冻融循环。
通过使用以此方式设计的引物，几乎可以获得任意长度RNA的完整SHAPE数据。然而，RNA的3'末端或其附近序列始终无法被SHAPE检测到，除非对该RNA进行改造以包....
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结果
含有HIV-1 rev反应元件（RRE）和3'末端结构盒的RNA4 由线性化质粒制备 体外 转录，随后通过加热、冷却及孵育进行折叠 37 °C 在 MgCl₂ 存在下2RNA经NMIA处理后，通过与3'末端结构盒杂交的5'端标记DNA引物进行逆转录。所获得的SHAPE cDNA文库连同对照及测序反应产物，随后采用贝克曼库尔特CEQ 8000全自动毛细管电泳系统进行分离，得到如图所示的电泳图谱 图4四条重叠且以颜色编码的轨迹由四组反应产物在毛细管中的迁移产生，具体如下：蓝色（来自NMIA修饰RNA逆转录生成的Cy5标记的RT产物）、绿色（来自折叠但未修饰RNA的Cy5.5标记的RT产物）、黑色（使用ddG生成的WellRed D2标记的DNA测序梯度）和红色（Lycor800标记的测序梯度，ddT）。
原始毛细管电泳图谱使用 ShapeFinder 软件进行分离、处理、比对和积分18对应于RRE SLII区域的轨迹部分如图所示 图5，.......
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讨论
本文介绍了一种高通量SHAPE技术的详细实验方案，该技术能够以单核苷酸分辨率测定任意长度RNA的二级结构。此外，将实验获得的SHAPE数据与二级结构预测算法相结合，可生成比单独使用任一方法更为精确的RNA二维模型。通过使用荧光标记引物并结合自动毛细管电泳（CE），该方法相较于传统的凝胶电泳SHAPE具有显著优势，能够在单次实验中解析长链RNA序列，并大幅提高多个实验的运行速度和通量。该方法的高效性以及配套数据分析工具的可用性，使其特别适用于此前难以分析的病毒RNA、完整信使RNA和非编码RNA的结构研究。随着这些引人关注的RNA二级结构日益清晰，羟基自由基探针、空间切割技术及分子建模方法的应用将有助于阐明复杂的三级相互作用，并最终使研究人员得以确定这些RNA的三维结构。
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致谢
S. Lusvarghi、J. Sztuba-Solinska、K.J. Purzycka、J.W. Rausch 和 S.F.J. Le Grice 获得美国国立卫生研究院国家癌症研究所院内研究计划的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| N-甲基异邻苯二甲酰亚胺（NMIA） | Life technologies | M25 | 溶于无水DMSO中 |
| 1-甲基-t-硝基异邻苯二甲酰亚胺（1M7） | 参见参考文献22 | ||
| Superscript III 逆转录酶 | Life technologies | 18080044 | 10,000 单位 |
| Thermo sequenase 循环测序试剂盒 | Affymetrix | 78500 | |
| 用户自备材料 | |||
| 目标RNA | 每反应6 pmol（检测下限由仪器决定） | ||
| 四组5'端标记引物（Cy5、Cy5.5、WellRed D2 和 WellRed D1/Licor IR800） | 引物与目标RNA互补，用于逆转录和测序反应。所列荧光染料适用于Beckman Coulter 8000 CEQ系统。引物可外购或自行合成。 | ||
| DNA模板 | DNA用于测序反应，必须包含所研究RNA的序列——包括任何3'端延伸序列（如存在）。在适用情况下，通常可方便地使用RNA转录模板。 | ||
| 缓冲液 | |||
| 10× RNA复性缓冲液 | 100 mM Tris-HCl pH 8.0，1 M KCl，1 mM EDTA | ||
| 5× RNA折叠缓冲液 | 200 mM Tris-HCl pH 8.0，25 mM MgCl2，2.5 mM EDTA，650 mM KCl。（该缓冲液可根据具体情况调整（例如 pH、EDTA、Mg、RNase抑制剂）） | ||
| 2.5× 逆转录混合液 | 4 μl 5× 缓冲液，1 μl 100 mM DTT，1.5 μl 水，1 μl 10 mM dNTPs，0.5 μl SuperScript III。注意：5× 缓冲液和100 mM DTT随SuperScript III（Invitrogen）购入时提供。 | ||
| GenomeLab 样品上样溶液（Beckman Coulter） | 注意： 避免反复冻融 | ||
| 仪器设备 | |||
| 毛细管电泳仪 | Beckman | CEQ8000 | |
| 热循环仪 | 型号各异 |
参考文献
- Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).
- Moore, P. B., Steitz, T. A. The roles of RNA in the synthesis of protein. Cold Spring Harb. Perspect. Biol.....
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重印与许可
