端粒长度与端粒酶活性：细胞衰老的阴阳平衡

摘要

本文描述了一种准确、快速、精密且低成本的方法，利用qRT-PCR技术在多种组织和物种中检测端粒长度。此外，我们还将介绍一种简单的检测端粒酶活性的实验方法，作为端粒长度检测的互补性基础实验。

摘要

端粒是位于染色体末端的重复DNA序列，其长度具有多样性，在人类中可长达15,000个碱基对。端粒在每次细胞分裂过程中起到保护染色体免受磨损的生物学防护作用。当端粒缩短至某一特定长度时，将无法支持进一步的复制，这一过程可能导致染色体不稳定或细胞死亡。端粒长度由两种相对的作用机制共同调控：缩短与延长。缩短发生在每次细胞分裂过程中。相反，延长则部分依赖于端粒酶的活性，该酶可在染色体末端添加重复序列。因此，端粒酶有可能逆转某种衰老机制，恢复细胞活力。这些因素在维持细胞生命活动中至关重要，也被用于评估细胞衰老程度。在本文中，我们将描述一种准确、快速、精密且经济的方法，用于检测多种组织和物种中的端粒长度。该方法利用了两个关键要素：端粒序列的串联重复特性，以及qRT-PCR技术对检测样本中拷贝数差异的高度敏感性。此外，我们还将介绍一种简单的检测端粒酶活性的实验方法，作为端粒长度分析的补充基础检测手段。

引言

端粒是位于染色体末端的重复DNA六聚体（TTAGGG）序列。在每次细胞复制过程中，这些染色体末端都会缩短。如果端粒变得过短，染色体可能发生端粒末端融合、异常重组和降解。因此，维持足够的端粒长度在染色体稳定性和细胞保护中起着重要作用³⁸。端粒长度的维持对于位于染色体末端附近的基因也至关重要，因为DNA复制无法持续到染色体的最末端^1-2。因此，防止端粒缩短可能有助于提高细胞稳定性。

许多研究报道，端粒长度与生物体的寿命及疾病状态相关，例如癌症^3-4、糖尿病⁵和心血管疾病^6,7。此外，端粒缩短还与过度压力或不健康的生活方式有关⁸，可能是通过促进细胞过早衰老和死亡所致⁹。然而，也有研究发现，端粒长度与寿命及年龄相关疾病之间并无显著差异^{39, 40, 41}。

细胞抵御端粒缩短的天然机制之一是激活其自身的端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase, TERT）。该酶及其亚基——端粒酶RNA（telomerase RNA, TERC），一种非编码RNA，以端粒为模板，在染色体末端添加端粒重复序列¹⁰。尽管端粒酶活性在多种细胞类型中缺失，且其他机制也参与端粒长度的维持，但端粒酶活性的增强与端粒长度的增加相....

方案

1. 端粒长度检测方案¹⁹

1. DNA 提取

大多数DNA提取方法均可使用。本实验室对于血液样本优先使用Qiagen DNeasy试剂盒（#69506）。根据DNA来源的不同，例如口腔黏膜细胞或其他来源，可采用不同的提取方法。

2. 引物

所有引物均用PCR级水稀释至100 pmol/μl的储存浓度，并于-20 °C保存直至使用。工作浓度的引物需新鲜配制，可短期存放于20 °C（数月）。端粒和作为SCG的β-珠蛋白的标准引物参照O'Callaghan 等²⁰所述方法使用。

引物序列：
Telo 1：5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3'

Telo 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3'
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3'
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3'

结果

一种端粒长度qRT-PCR检测示例见于 图1左上方面板中，以红色和绿色标记的样本表示受试者在96孔板中的位置。右上方面板显示扩增曲线。每位受试者均通过两种检测（端粒和单拷贝基因）进行测试，每种检测均设三个复孔。由于所选个体在两种检测中产生的DNA拷贝数不同，荧光信号达到指数增长曲线所需的循环次数在不同检测间存在差异。在拷贝数较高的反应管中（即 端粒检测中，荧光信号量在27个循环后达到指数增长曲线。第二组曲线代表单拷贝基因（SCG），该基因在基因组中仅有一个拷贝，因此其拷贝数远少于端粒样本，需经过31个循环后才进入指数增长阶段。棕色曲线代表基于已知样本浓度梯度稀释所建立的标准曲线。右下角图示为标准曲线各点的对数浓度（一条直线表明梯度稀释效果理想）。该线性曲线用于计算待测样本管的浓度（左下角图示）。qRT-PCR结果最初由Cawthon建立 ¹⁹，已被我们及其他研究者重复验证，结果表明其与末端限制性片段长度分析法所得数据具有相关性。一个T/S比值单位（端粒扩增的qRT-PCR循环数除以SCG扩增的qRT-PCR循环数）相当于白细胞平均端粒长度为4,270 bp

讨论

端粒长度为研究应激和衰老细胞提供了一种独特的细胞标志物，并有助于揭示衰老的机制。自从首次提出其在衰老过程中的作用以来，已有大量研究将端粒长度与年龄、寿命、年龄相关疾病、癌症以及应激联系起来。几十年来，端粒长度测量的金标准是采用Southern杂交的末端限制性片段分析。然而，近年来Cawthon开发出一种经济、快速且易于操作的新方法。通过定量实时PCR，Cawthon提供了一种测量端粒长度的有效替代方案，使得大样本量的研究成为可能。

利用qRT-PCR技术，已有大量研究探讨了端粒长度与多种结局之间的关系，尤其是与年龄相关疾病的关系。更具体地说，该方法使研究人员能够在人群层面开展大规模的流行病学研究，以验证或否定端粒长度与多种疾病之间的相关性。例如，缺血性心脏病⁷、阿尔茨海默病²²、女性骨肉瘤²³、吸烟者的肺癌²⁴、家族性甲状腺癌²⁵、糖尿病⁵、血压²⁶、衰老²⁷以及痴呆²⁸均已被证实与较短.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
定量端粒酶检测	Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy 试剂盒	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master，用于基于 SYBR Green I 的实时 PCR 的即用型热启动反应混合液，适用于 LightCycler 480 仪器	Roche Diagnostics	4707516