本文描述了一种分离胚胎面部外胚层和间充质的方案。我们首先使用Dispase II处理整个胚胎，解剖出完整的面部突起，然后分离面部外胚层和间充质。
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本文内容
摘要
摘要
口面裂是最常见的颅面缺陷，全球每1000名新生儿中约有1.5例1,2。口面裂的形成源于面部发育异常3。在人类和小鼠中，面部的初始生长和模式形成依赖于数个微小的组织芽体，即面部突起4,5。面部由六个主要突起发育而来：成对的额鼻突（FNP）、上颌突（MxP）和下颌突（MdP）。这些突起由间充质组织的隆起构成，其表面覆盖有上皮层。多个物种的研究表明，面部外胚层与间充质之间的信号串扰对面部形态的塑造至关重要6。然而，目前尚缺乏关于参与这些信号传递过程的基因的详细分子机制。要全面理解与发育中的面部外胚层和间充质相关的基因表达、转录因子结合以及染色质修饰，一种有效的方法是分离并鉴定这些独立的组织区室。
本文介绍一种在胚胎第10.5天（E）分离面部外胚层和间充质的方法，该时期是小鼠面部发育的关键阶段，发生于面部突起融合之前。本方法改编自我们先前用于解剖面部突起的方法7。在之前的研究中，我们采用近交系C57BL/6小鼠，因为该品系已成为遗传学、基因组学和面部形态学研究的标准8。然而，由于本实验可获取的组织量更为有限，我们改用远交系CD-1小鼠，该品系购买成本较低，饲养适应性更强，且每窝产胚数（12–18只）高于任何近交系小鼠品系8。在分离胚胎后，使用中性蛋白酶Dispase II处理整个胚胎，随后解剖出面部突起，并将面部外胚层与间充质分离。该方法可保持面部外胚层和间充质的完整性。通过本方法获得的样本可用于蛋白质检测、染色质免疫沉淀（ChIP）实验、微阵列研究以及RNA-seq等技术。
方案
1. 准备中性蛋白酶II
- 配制新鲜的HEPES缓冲盐水（HBS）（50 mM HEPES/KOH，pH 7.4，150 mM NaCl）。将2 ml 0.5 M HEPES/KOH（pH 7.4）和1.2 ml 2.5 M NaCl加入16.8 ml超纯H2O中。
- 配制10 mg/ml Dispase II溶液。称取0.2 g Dispase II（Roche，货号# 4942078001），溶于20 ml HBS中。将溶液分装为每管1.0 ml，置于独立的Eppendorf管中，长期保存时储存于-20 °C。
- 使用前将10 mg/ml Dispase II用PBS按1:10比例稀释。将稀释后的Dispase II置于冰上备用。
2. 从怀孕雌性小鼠中解剖 CD-1 E10.5 胚胎
所有动物实验均按照科罗拉多大学丹佛分校（UCD）动物护理与使用委员会批准的方案进行。CD-1（ICR）小鼠购自哈兰实验室（Harlan Laboratories，印第安纳波利斯，印第安纳州）。
- 用70%乙醇清洁解剖区域和工具。
- 按照批准的方案处死怀孕的CD-1雌性小鼠。
- 用70%乙醇喷洒腹部，然后切开腹腔。用一把镊子拉出子宫，另一把镊子撕离子宫周围的子宫系膜。将子宫从体内取出。对腹腔另一侧的子宫角重复此操作。
- 在10 cm培养皿中用预冷的PBS短暂冲洗子宫，以去除血液。
- 将子宫转移至另一含预冷PBS的培养皿中。通过在着床部位之间进行切割，将子宫分离为单胚胎片段。
- 在体视显微镜下，将一个胚胎转移至含预冷PBS的培养皿中。用精细镊子从切割处开始撕开子宫肌层，暴露带有卵黄囊的胚胎。剥离卵黄囊和羊膜。将解剖出的胚胎转移至含PBS并置于冰上的6 cm培养皿中。按此步骤逐一收集所有胚胎。
3. Dispase II 处理
- 在6 cm培养皿中用PBS清洗所有胚胎。将PBS更换为10 ml用PBS稀释的Dispase II溶液，盖上培养皿，在37 °C孵育25分钟；可使用细菌培养箱或恒温房间，此步骤无需使用CO2组织培养箱。
- 取出培养皿，在体视显微镜下观察胚胎。外胚层应已变得松散，表现为该组织层与下方间充质之间出现明显间隙。若未达到此状态，于37 °C继续孵育5分钟。随后将培养皿置于冰上。
4. 分离出完整的面部突起
- 使用一次性玻璃移液管（VWR，货号# 14672-380） 在体视显微镜下，将一个经Dispase II处理的胚胎转移至6 cm培养皿中的预冷PBS缓冲液内。
- 使用一对镊子固定胚胎，再用另一对精细镊子小心地剪开头面部突起与头部相连的边界图1 显示面部突起的边界）。从一侧的下颌突（MnP）开始，然后是上颌突（MxP），最后是额鼻突（FNP）。另一侧以相同方式操作，完整分离出两侧的面部突起图2A).
5. 分离面部外胚层与间充质
- 在具有3倍工作距离的体视显微镜下观察面部突起。使用一根长玻璃巴斯德吸管，轻轻将面部突起上下吹打5次。经过此操作后，外胚层易于剥离。
- 用一对镊子夹住面部突起，用另一对镊子非常缓慢地剥离外胚层。图2B展示了分离出的面部外胚层片层。
- 使用一根新的长玻璃巴斯德吸管，将面部外胚层转移至含有冰上预冷PBS的1.5 ml离心管中。将间充质转移至另一含有冰上预冷PBS的1.5 ml离心管中。
- 每次解剖均使用新的冰冻PBS。收集样品。
- 用PBS洗涤样品，在4 °C、500 × g条件下离心3分钟。
- 使用长玻璃巴斯德吸管吸除PBS。若样品用于ChIP实验，请进入步骤6.1；若用于RNA提取，请进入步骤6.2；若用于蛋白质提取，请进入步骤6.3。
6. 处理样品以进行后续实验
- ChIP 实验样品
- 加入 1 ml 含 1% 甲醛的 PBS 进行交联，匀浆样品。
- 室温旋转孵育 10 分钟。
- 每管加入 110 μl 1.25 M 甘氨酸，以淬灭未反应的甲醛。
- 混匀后室温孵育 5 分钟。
- 在 4 °C 下以 500 ×g 离心 3 分钟，弃上清液。
- 加入 1 ml 冷 PBS 洗涤组织。
- 在 4 °C 下以 500 ×g 离心 3 分钟。
- 吸除 PBS，重复洗涤一次。
- 去除上清液，将组织在液氮中速冻，于 -80 °C 保存，用于后续合并与处理。
- RNA 提取样品
- 将面部外胚层和间充质放入含有 RNAlater（Ambion）的离心管中。
- 在 4 °C 下于 RNAlater 溶液中孵育过夜，以确保试剂充分渗透组织。
- 于 -20 °C 保存，用于后续合并与处理。
- 蛋白提取样品
加入裂解缓冲液以供后续处理。或将组织在液氮中速冻。将样品于 -80 °C 保存，用于后续合并与处理。
注意事项
- 时间限制。从开始解剖到进入第6步之前，预计需要4-6小时。
- 熟练操作后，每个胚胎完成第4和第5步（突起解剖和外胚层分离）约需10-15分钟。
- 若样品用于RNA提取，所有溶液均应先用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。同时使用RNase Away清洁镊子和操作区域。
- 除Dispase II处理和解剖过程外，样品应始终置于冰上。每次解剖均应更换新的预冷PBS，以确保解剖所用PBS保持低温。
- 锋利的镊子对实现精确解剖至关重要。务必彻底清洁镊子，防止任何污染。
- 若需从不同突起收集样品，应在Dispase II处理后分别解剖各个突起，再分离外胚层与间充质。
- 经Dispase II处理后，面部外胚层易于剥离。需特别注意避免其他外胚层组织的污染，所有可能受污染的组织均应弃用。
- 一旦开始操作，应持续进行，直至样品达到第6步的适当阶段。应尽快完成所有胚胎的面部外胚层与间充质的分离。
- 不同批次和品牌的Dispase II酶活性可能存在差异，因此需根据所用Dispase II的品牌和批次调整处理时间。
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结果
经过 Dispase II 处理后，胚胎的外胚层趋于松散。解剖后，面部突起应保持完整（图 2A）。分离得到的面部外胚层清晰，不含间充质组织（图 2B）。为评估本实验方案的有效性并检测是否存在交叉污染，我们采用逆转录 PCR 检测在前脑表达的 Zic39、外胚层特异的 cdh15 以及间充质特异的 sox1010。研究结果证实，分离得到的面部外胚层和间充质均表达了预期的基因，且无交叉污染（图 3）。
图1. 小鼠E10.5时期面部突起的示意图。 左侧为头部的侧面观，右侧为E10.5胚胎头部的吻端观。红色虚线表示面部突起的边界。额鼻突（FNP）、上颌突（MxP）、下颌突（MdP）。...
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讨论
本方案提供了一种基于 Dispase II 初步处理步骤来分离小鼠胚胎面部外胚层和间充质的简便方法。在以往的研究中，我们通常在 Dispase II 处理前进行面部突起的解剖，但始终发现间充质会变得“粘稠”，更难操作。我们的新方案避免了这一问题。通过移液器反复吹打施加温和的物理力，结合 Dispase II 处理，可更轻松地实现外胚层与间充质的分离。此外，该方案也适用于其他胚胎外胚层和间充质样本的分离，例如缩短 Dispase II 处理时间即可用于肢芽外胚层和间充质的分离。同样，该方法也可应用于发育的其他阶段——例如，通过延长 Dispase II 处理步骤，可用于分离 E11.5 时期的面部外胚层和间充质。
从E10.5小鼠面部突起获得的样本量非常小，因此我们通常将多批样本储存起来，以便后续集中处理和分析。为此，需要汇集100至150个胚胎的外胚层样本，才能获得10 mg组织。每个胚胎产生的间充质组织量较大，因此所需合并的胚胎数量较少。染色质免疫沉淀（ChIP）实验中，10 mg面部外胚层经超声处理后获得的基因组DNA产量约为80 μg。每10 mg面部外胚层的总RNA产量约...
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披露
作者声明本文内容不存在竞争性利益或其他冲突。
致谢
作者感谢Irene Choi为图1中的胚胎头部插图所做的工作，以及实验室其他成员提供的帮助和讨论。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目DE012728（T.W.）支持
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Dispase II（中性蛋白酶，II 型） | Roche | 4942078001 | 用 HBS 配制 10 mg/ml 的 Dispase II 储存液。分装后于 -20 °C 保存。 |
| RNAlater | Ambion | AM7021 |
参考文献
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