监测树突状细胞迁移的19F / 1H磁共振成像方法

摘要

近年来，利用磁共振成像（MRI）进行细胞示踪受到了广泛关注。本实验方案描述了使用富含氟（¹⁹F）的颗粒对树突状细胞进行标记、将标记后的细胞体内应用，以及通过¹⁹F/¹H MRI和¹⁹F磁共振波谱（MRS）监测这些细胞迁移至引流淋巴结的程度。

摘要

无创成像技术的持续进步，如磁共振成像（MRI），极大提升了我们研究活体生物生理或病理过程的能力。MRI 也被证实是追踪移植细胞的一种有效工具 体内最初的细胞标记策略在磁共振成像（MRI）中利用了影响MR弛豫时间（T1、T2、T2*）的对比剂，使标记细胞所在区域产生信号增强（T1）或信号减弱（T2*）。超小氧化铁颗粒（USPIO）等T2*增强剂已被用于研究细胞迁移，其中一些已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床。T2*对比剂的一个缺点是难以将标记细胞引起的信号衰减与血凝块、微出血或气泡等其他伪影区分开来。本文介绍一种新兴的细胞示踪技术 体内 基于使用氟对细胞进行标记¹⁹富含F的颗粒。这些颗粒通过乳化全氟碳化合物（PFC）制备而成，可用于标记细胞，随后可通过成像技术进行观察。 ¹⁹f MRI。全氟化碳在细胞追踪中的重要优势 体内 包括（i）无碳键合 ¹⁹F 体内，从而获得无背景干扰的图像和完全的细胞选择性，以及（ii）通过量化细胞信号的可能性 ¹⁹F核磁共振波谱学

引言

细胞追踪 体内 是生物医学多个领域中的一个关键方面。为此，能够随时间推移选择性定位细胞的非侵入性成像技术具有极高价值。在三维磁共振成像（MRI）发展之前，免疫细胞迁移的追踪仅限于显微镜分析或组织活检。近年来，借助MRI进行细胞追踪受到了广泛关注，不仅在研究免疫细胞行为的免疫学家当中，而且在临床前与临床研究中均展现出重要应用前景。 体内，也适用于临床和干细胞研究人员。在20世纪90年代中期，关于氧化铁纳米颗粒的首批研究 ¹ 引发了一系列利用MRI追踪细胞的发展。氧化铁颗粒可缩短标记细胞的磁共振弛豫时间（T2*），从而导致磁共振图像中的信号减弱。氧化铁颗粒已被用于标记巨噬细胞。 ²少突胶质细胞前体细胞 ³ 以及其他多种细胞类型。其中一些颗粒已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的临床批准，用于黑色素瘤患者细胞疫苗的标记 ⁴。由于 体内 或 离体 使用氧化铁颗粒对细胞进行标记依赖于T2*信号的缩短，而后者也可能由其他因素引起 在体 由于磁敏感性相关的T2*效应（如微出血、铁沉积或气泡），可能难以识别标记的细胞 体内 来自其他背景的T2*信号衰减 ⁵.

本文中，我们介绍一种用于追踪树突状细胞（DC）的技术 体内 通过采用 ¹⁹F/¹氢磁共振成像（MRI）。这种细胞追踪技术直到2005年才被引入 ⁶，首次被认可的应用几年后 ¹⁹F在MRI中已有报道 ⁷一个重要的优势是 ¹⁹铁氧化物颗粒细胞标记的缺点之一是其在生物学中的发生率较低 ¹⁹F 在组织中；这使得能够以基本无背景干扰的图像非常特异性地追踪细胞。此外，还可以进行叠加 ¹⁹将移植的标记细胞的 F MRI 信号与常规 1H MRI 获取的解剖图像进行融合。 ¹⁹F/¹氢质子磁共振成像因此在细胞迁移研究中具有重要相关性 体内使用该方法研究的细胞会被标记 ¹⁹富氟颗粒。通常使用主要由碳和氟原子组成的合成全氟碳化合物（PFCs）来制备此类颗粒。这些化合物不溶于水，应用前需进行乳化处理。 体外 或 体内通常其他研究团队所使用的PFC颗粒的大小 体内 ¹⁹F-MRI 追踪实验的范围在 100 nm 至 245 nm 之间 ^6,8-10然而，我们已证明，树突状细胞标记全氟-15-冠-5-醚（PFCE）颗粒的效率随颗粒尺寸增大而提高（>560 nm¹¹

方案

所有动物实验操作必须在实施前获得当地机构动物福利委员会的批准。在进行磁共振测量期间，充分的麻醉水平以及生理监测（体温、呼吸频率）是必不可少的要求。

1. 小鼠骨髓来源树突状细胞的制备

1. 从C57BL/6小鼠中提取骨髓细胞，方法如前所述 ¹². 该方案可追溯至1992年 ¹³ 最初由拉尔夫·M·斯坦曼（Ralph M. Steinman，1943–2011）团队描述，他也是树突状细胞的发现者 ¹⁴.
2. 简而言之，在处死小鼠后立即取出胫骨和腓骨。在超净工作台内操作（以防止微生物污染），用洗涤培养基（含5% FBS、1%青霉素/链霉素和1% HEPES的RPMI培养基）将骨髓冲洗至小型培养皿中。 ¹².
3. 将细胞悬液通过细胞滤器（100 μm孔径，尼龙材质）转移至无菌的50 ml离心管中，以去除骨组织和残留的组织。经过数次洗涤步骤和一步裂解处理后 ¹²，使用台盼蓝和血细胞计数板计数活细胞 血细胞计数板
4. 重悬骨髓细胞 浓度为 400,000 个细胞/ml^-1 在培养基中（RPMI 培养基，添加 10% FBS、1% 青霉素/链霉素、1% HEPES 和 1% L-谷氨酰胺，含 75 ng/ml^-1 小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（mGM-CSF）的获取，来源于转染了小鼠基因的293FT HEK细胞上清液 GMCSF 质粒。转移10 ml细胞悬液（4 x 10⁶ 细胞置于培养皿（100 mm × 20 mm）中，并在CO₂培养箱中孵育₂ 培养箱（37 °C，5% CO₂）₂。第3天，用10 ml新鲜培养基替换旧培养基（维持mGM-CSF的终浓度为75 ng/ml）。^-1第6天，移除10 ml旧培养基，并补充10 ml新鲜培养基（mGM-CSF终浓度 = 75 ng/ml）^-1第8天，移除10 ml旧培养基，并补充10 ml新鲜培养基（mGM-CSF终浓度 = 150 ng/ml）^-1).
5. 第10天，用1 μg/ml的试剂成熟化已分化的DC^-1 脂多糖（LPS）处理24小时。

2. 使用富含¹⁹F的颗粒标记树突状细胞

1. 在24小时成熟步骤（1.5）期间，用1 mM富含氟的全氟-15-冠-5-醚（PFCE）颗粒（500–560 nm）对DC进行标记，同样持续24小时。通过在Pluronic F-68中乳化PFCE（总体积2.5 ml），使用细胞破碎用钛合金超声探头，并采用连续脉冲程序（振幅100%，功率=250 W）处理60秒，制备大尺寸氟标记颗粒。
2. 完成上述孵育步骤后，使用组织培养细胞刮刀收集成熟且经氟标记的DC，转移至50 ml离心管中，在室温下以500 × g离心5分钟。
3. 为洗去残留颗粒和死亡细胞，将收集的细胞置于聚-L-赖氨酸包被的培养皿中使其贴壁。为此步骤做准备时，先将培养皿用聚-L-赖氨酸（1 mg ml^-1）在37 °C孵育1小时，随后用PBS洗去未结合的聚-L-赖氨酸。
4. 将上述收集的细胞接种于聚-L-赖氨酸包被的培养板中，在无血清培养基中孵育，使细胞贴壁（37 °C，1小时，5% CO₂）。
5. 吸去培养基以去除未贴壁细胞、残留颗粒及死亡细胞，并用预热（37 °C）的PBS洗涤三次。
6. 通过胰蛋白酶-EDTA处理（0.25%胰蛋白酶-EDTA，37 °C孵育3分钟）收集贴壁细胞。
7. 再经过一次洗涤离心步骤后，将所需数量的成熟DC重悬于无菌无血清PBS中。
8. 为确定细胞是否成功标记，建议使用流式细胞术（FACS）检测细胞的理化特性。侧向散射（SSC）应显示这些细胞的颗粒度增加，如先前所述¹¹。还需注意，成纤维细胞可能污染DC培养物，并可能同时摄取¹⁹F颗粒。因此，在进行体内应用前，应评估DC纯度（通过FACS检测CD11c⁺CD11b⁺细胞百分比）。

3. 体内应用¹⁹F标记的树突状细胞

1. 给予DC（10⁶ - 10⁷)以50-100 μl体积，通过将C57BL/6小鼠置于固定装置中，用26½ G针头小心插入皮肤表层后，皮内注射至后肢（使用0.5 ml结核菌素注射器，配固定针头，以最小化死体积）。为确保正确的皮内注射，针头插入部分应部分可见于皮肤下方。若针头完全不可见，则表明已插入过深。对于缺乏经验的操作者，可在麻醉状态下进行皮内注射。
2. 对肢体进行成像 体内 氟（¹⁹F) / 质子 (¹H) 注射后21小时进行MRI（见下一节）。

4. 体内 ¹⁹F/¹H 磁共振成像

有关设置磁共振扫描的详细说明，参考了使用控制软件 Paravision（版本 5.1）的布鲁克（Bruker）磁共振扫描仪。涉及厂商特定功能和项目的名称已用斜体标出。对于其他磁共振扫描仪，这些步骤可能需要根据制造商的指南进行相应调整。

1. 安排使用专用的小动物磁共振成像仪。为获得足够的图像质量，系统应具备9.4特斯拉或更高的磁场强度，并配备专用的射频线圈（例如 ¹H/¹⁹建议使用F双调谐容积射频线圈（内径35 mm，长度50 mm；Rapid Biomed，德国维尔茨堡）。
2. 在进行 MRI 之前，准备好用于麻醉和生理监测的 MRI 扫描仪装置。确保动物床/固定装置的呼吸面罩已连接至异氟烷系统，并且温度探头和呼吸垫已连接至远程动物监测系统例如 Model 1025，SA Instruments Inc.，纽约，美国）。后者用于监测动物的生理参数，如体温和呼吸。
3. 使用与异氟烷系统相连的小鼠麻醉舱，通过吸入麻醉法对小鼠进行麻醉。调节空气和氧气的流速₂ 0.2 L min⁻¹^-1 和 0.1 L min^-1分别调节为3%的异氟烷（通过蒸发器调节）持续约2分钟，直至达到所需的麻醉深度（夹趾无反应）。最佳气流速率可能因实验装置不同而有所差异。需注意高流速可能导致动物脱水。如上所述，必须始终密切监测动物的状况。
4. 将小鼠俯卧位放置于小动物磁共振扫描仪的鼠床/固定装置上（图1).
5. 在保持空气和O₂的流速不变的同时₂ 保持恒定，调节异氟烷挥发罐至0.8–1.5%，直至达到最佳呼吸模式。建议呼吸频率为每分钟50–70次。
6. 实验过程中，使用循环温水（或温热空气）系统将体温维持在36–37 °C。
7. 测量过程中使用无菌眼用润滑软膏保持小鼠眼睛湿润。
8. 将动物固定在成像支架上并连接监测系统后，将支架移至 ¹H/¹⁹F射频线圈（位于动物扫描仪磁体的等中心位置）。
9. 将小鼠放置于磁体等中心位置，可采用自动化方法实现例如 使用定位激光结合电机驱动的动物固定装置，或通过手动计算固定装置需移入磁体以到达等中心的位置距离。
10. 用于确认动物在扫描仪中的正确位置以及后续图像切片几何形状的规划（即 大小、位置和空间旋转），使用快速低分辨率成像方法获取三个标准方向（轴向、冠状向、矢状向）的定位像例如：TriPilot 方案（采用FLASH脉冲序列）
11. 调节射频线圈至 ¹H共振频率（例如 400.1 MHz（对应9.4 T）以及 ¹⁹F 共振频率 (例如 376.3 MHz（对应9.4 T）并使用动物磁共振扫描仪的调谐监测功能将线圈的特征阻抗匹配至50欧姆。调谐与阻抗匹配对于实现最佳的信号发射与接收条件至关重要。
12. 执行必要的自动系统设置，包括匀场，以优化磁场的均匀性（例如：ADJ_SHIM），系统频率调节用于将射频调谐至小鼠的拉莫尔频率（例如，ADJ_SF）以及参考增益来调节射频（RF）幅度（例如，ADJ_REFG）。所有这些设置对于生成静态和可变磁场（B₀，B₁尽可能使感兴趣区域内的信号均匀一致。
13. 获取第二组定位像（方法同上），沿三个正交方向扫描，调整视野（FOV）使双侧下肢从骨盆至足部均可见（LxWxH = 50x25x25 mm）。这些图像用于规划最终三维扫描的方位。 ¹H/¹⁹F扫描。
14. 建立TurboRARE 3D序列方案 ¹H-scan：TR/TE = 1,500/53 毫秒，FOV = 50×25×25 毫米，矩阵 = 400×200×200，RARE 因子 = 16（扫描时间约 60 分钟）。借助定位图像调整 FOV，启动扫描交通信号灯).
15. 加载单脉冲FID序列，TR至少为1,000毫秒。打开 编辑扫描 并设定细胞核为 ¹⁹F. 通过取消选择自动参考增益来使用手动增益设置 编辑方法 的 工具箱.
16. 使用实时显示 MR 信号的模式开始测量，但不记录数据 GSP （进行设置）。如果 ¹⁹若采集窗口内的F谱信号过低，可增加累加次数 编辑方法 和/或调节脉冲衰减器（TX0 或 SP0 滑块，直到信号清晰可见。调节基础频率以使信号居中 ¹⁹采集窗口中 0 Hz 处的 F 谱峰 应用基本频率 并按压 停止请注意，用作麻醉剂的异氟烷可能会产生背景信号。在9.4特斯拉磁共振成像中，异氟烷的化学位移与 ¹⁹含F颗粒与异氟烷之间的频率差约为1,800 Hz。确保激发带宽小于3,600 Hz，以避免同时激发异氟烷和含F颗粒 ¹⁹F标记的细胞或颗粒。应正确设置由信号产生的基本频率 ¹⁹F标记的细胞。或者，实验人员可根据需要选用其他麻醉方法。
17. 克隆（复制）先前的 TurboRARE 3D 方案 ¹H扫描。前往 编辑方法 并取消选择自动参考增益（如上所述）。设置 ¹⁹F 原子核来自 编辑扫描将矩阵改为128×64×64，RARE因子至少设为40（最高可达64）。当TR/TE为1,000/6毫秒且累加次数为64时，扫描时间约为70分钟。将接收增益设为101（工具箱）并使用以下设置开始扫描，无需进一步调整 GOP （go 流程）
18. 扫描完成后，将小鼠固定器从磁共振扫描仪中撤出。小心地将小鼠从固定器上取下。如果小鼠未被处死用于 离体 分析例如 在磁共振测量结束后立即进行组织学或光谱学分析（详见下文），并密切监测小鼠直至其完全从麻醉中恢复。由于麻醉会影响体温调节，在恢复期间应将小鼠置于单独的笼子中，并将笼子放在温度可控的加热垫上。待小鼠完全恢复后，将其放回饲养笼并送回动物房。
19. 叠加 ¹⁹F 图像到 ¹H 图像，请使用 查看菜单 同一软件中的选项Paravision）。 底层 功能可在以下位置找到 相关性保存底层图像，加载新图像并突出显示 ¹⁹F层通过定义新颜色来自 查找表. 以区分两者 ¹⁹F 和 ¹H 扫描，调整所选颜色的阈值（裁剪查找表，使得 ¹⁹F 信号将呈现所选颜色，而背景 ¹H 图像将保持为灰度图像。其他后期处理程序（例如 ImageJ）可用于创建 ¹H/¹⁹F 图像叠加。
20. 应 体内 定量分析 ¹⁹若需要F信号，按照先前所述的简单定量方案进行 ^15,16简而言之，可通过在视野（FOV）内靠近小鼠的位置放置一支已知浓度的PFCE乳剂参考管来进行定量。获取MR图像后，对参考管和目标区域的信号强度进行定量分析。 ¹⁹使用感兴趣区域（ROI）分析F信号，并与之比较 体外 标准曲线，如图所示 图2.

5. 淋巴结磁共振波谱分析（MRS）

1. 小鼠安乐死后，取出腘窝淋巴结，置于一个小型5 mm核磁共振管中，并加入100 μl的2%多聚甲醛（PFA）。
2. 安装一个 ¹⁹F谱仪线圈（例如 一个环形线圈，其开口至少为5 mm，用于固定装有淋巴结的核磁共振管。
3. 将核磁共振管放入线圈中，并将线圈移至磁体的等中心位置。
4. 调节射频线圈至 ¹⁹F共振频率例如 376.3 MHz（对应9.4 T）并使用动物磁共振扫描仪的调谐监测功能将线圈的特征阻抗匹配至50欧姆。调谐与阻抗匹配对于实现最佳的信号发射与接收条件至关重要。
5. 设置所有匀场参数 匀场工具箱 设为0并点击应用。通常情况下无需应用匀场方法，因为样品体积相对较小。如果信号强度足够 ¹⁹F信号可用时，可按照上述方法自动进行匀场、系统频率和接收增益调节。
6. 加载一个单脉冲FID序列，TR至少为1,000毫秒。打开 编辑扫描 并将细胞核设定为 ¹⁹F. 通过取消选择自动参考增益来使用手动增益设置 编辑方法 的 工具箱将平均次数设置为1。
7. 使用以下步骤开始序列 GSP。如果 ¹⁹如果采集窗口内的 F 光谱信号过低，可增加累加次数 编辑方法 和/或调节脉冲衰减器（TX0 或 SP0 滑动滑块直至信号清晰可见。调节基频，使信号达到最佳状态。 ¹⁹F谱峰位于采集窗口中心0 Hz处，并施加基本频率。再次调整脉冲衰减器以最大化信号，达到90°激发。当信号达到最大值时，按下 停止.
8. 设置平均值 编辑方法 64 到 256（或根据信号情况必要时更多）并开始采集 GOP检测到的信号与平均次数呈线性相关。在进行定量时需注意，检测到的信号必须归一化至单次平均。此外，还需使用已知浓度的校准标准品或标准曲线，才能从归一化后的信号计算出细胞数量。 ¹⁹F信号（图2).
9. 扫描完成后，取出样品，放入下一个样品，并继续执行步骤 5.3。

结果

皮内给药后18至21小时 ¹⁹F标记的树突状细胞（DC）迁移至引流腘窝淋巴结。通过将图像叠加，可以观察到DC经淋巴管迁移至引流腘窝淋巴结的过程。 ¹H解剖图像与 ¹⁹F DC 图像（图2A）。我们先前已报道过这些细胞的迁移 体内以及对……的影响 ¹⁹F颗粒大小对树突状细胞免疫生物学的影响，包括摄取效率 ¹¹为了定量分析树突状细胞向淋巴结迁移的程度，我们分离引流淋巴结并进行后续操作 ¹⁹F MRS (图2B）。当我们比较时 ¹⁹每个淋巴结获得的F信号 ¹⁹使用相同PFCE颗粒标记的不同数量DC所获得的F信号（校准曲线， 图2C) 我们可以推断出数量 ¹⁹F标记的DC到达引流淋巴结。在所示的代表性实验中 图2A 和 2B，我们可以推断出 3.6 x 10

讨论

这种采用的方法 ¹⁹F/¹利用氢质子磁共振成像（¹H MRI）追踪树突状细胞（DC）进入淋巴结的迁移过程，为研究免疫细胞的迁移模式提供了可能 在体树突状细胞是能够快速迁移的免疫细胞的典型代表，它们可在三维结构中灵活移动，而无需紧密黏附于特定基质。 ¹⁷. 尽管空间分辨率较低（μ该技术的空间分辨率（微米级）无法与多光子显微镜所能达到的高分辨率（纳米级）相媲美，但利用该技术仍可研究细胞迁移的性质。 体内 并且在更长的时间范围内，显微镜的穿透深度有限，视野范围也受限，因此目前不适合对活体生物内的大范围区域进行成像。

由于该技术具有非侵入性，因此可以在研究后不处死小鼠的情况下连续数天监测免疫细胞的迁移。该技术的另一个优势在于，可以将捕获迁移细胞的¹⁹F图像与解剖结构的¹H扫描图像叠加，从而准确定位活体生物体内细胞的位置。该技术将使我们能够研究树突状细胞（DC）迁移背后的分子机制。与典型的体外（in vitro）迁移实验不同...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
C57BL/6 小鼠	Charles River, Berlin
RPMI	Gibco	21875-091
FBS Superior	Biochrom AG	S 0615
HEPES	Gibco-Invitrogen	15630-056
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-024
Dulbecco's PBS	Sigma Aldrich	D8662
PFA	Santa Cruz	sc-281692
全氟-15-冠-5醚	ChemPur	391-1996
Pluronic F-68	Sigma Aldrich	P5556
培养皿（35 × 10 mm）	VWR, Germany	391-1996
27 ½ G 注射器	VWR, Germany	612-0151
尼龙细胞筛（100 μm 孔径）	VWR, Germany	734-0004
NMR 管	VWR, Germany	634-0461
设备
解剖工具	FST
CO2 培养箱	Binder
小动物磁共振系统	Bruker Biospin		9.4T BioSpec 94/20 USR，ParaVision 采集与处理软件
1H/19F 双调谐体积射频线圈	Rapid Biomed, Würzburg, Germany		内径 35 mm，长度 50 mm
19F 波谱线圈	自制		调谐/匹配环形线圈，4 圈，内径 5 mm，长度 10 mm，两个电容用于调谐和匹配
异氟烷吸入系统	Föhr Medical Instruments GmbH
动物监测系统 Model 1025	SA Instruments Inc., New York, USA