利用视频追踪软件分析小鼠短期与长期运动活动

摘要

运动活动（LMA）是测量小鼠行为的一种简单且易于实施的方法。将视频追踪软件（VTS）与LMA结合，可显著提高检测的特异性和敏感性，尤其相较于手动划线计数的LMA分析方法更具优势。此外，VTS还支持对小鼠LMA进行长期追踪。

摘要

运动活动（LMA）是测量小鼠及其他啮齿类动物行为的一种简单且易于实施的方法。视频跟踪软件（VTS）的进步使其能够与LMA测试相结合，与传统的手动计分划线穿越法相比，显著提高了特异性和敏感性。此外，VTS还支持高通量实验。虽然LMA测试所用的自动视频跟踪技术与旷场实验（OFT）类似，但其独特之处在于允许小鼠停留在其居住笼中，并且在明暗周期的活动阶段不使用强光作为致焦虑刺激。传统上，LMA测试通常仅用于较短时间（分钟级），而较长时间的运动研究（小时至天级）则常依赖植入式发射器和生物遥测技术。如今，借助实时跟踪技术，长期LMA测试与短期测试一样，均可通过录像技术实现。长期LMA测试需要一种特殊但易于构建的笼具，以避免食物和水（通常放置在笼顶）遮挡摄像视野。重要的是，录像技术和VTS能够量化诸如小鼠运动轨迹等参数，而这些参数使用划线穿越法和/或生物遥测法难以甚至无法准确测量。总之，LMA测试结合VTS可更全面地描述小鼠的运动行为，并具备在较长时间范围内检测运动能力的优势。

方案

1. 短期LMA的设置与操作步骤

1. 短期LMA笼具设置
   1. 在单只饲养小鼠的笼具内进行短期LMA测试。为便于基于视频跟踪系统（VTS）的图像分析，应使用与小鼠体色形成高对比度的垫料（例如，白色小鼠使用深色垫料，黑色小鼠使用浅色垫料）。
   2. 在进行短期LMA测试期间，使用带有11个直径¼英寸通气孔的透明¼英寸厚Plexiglas盖子覆盖笼具，以保证适当的通风。
2. 短期LMA测试房间
   1. 在清洁环境中进行小鼠测试，且小鼠应在该环境中适应至少24小时⁸。
   2. 使用带有红色灯泡的育雏夹灯（< 125流明）照亮测试环境。在开始录像前，调整灯具的角度和位置，以消除Plexiglas笼盖上的反光或眩光。
   3. 避免测试房间内噪音超过70 dB。若在小鼠测试期间无法避免间歇性背景噪音，可使用白噪音发生器。
   4. 在测试房间内，将笼具放置的测试台面用与笼具垫料颜色相近的牛皮纸或实验台纸覆盖，以防录像过程中笼底暴露影响分析。
3. 短期LMA录像
   1. 在测试房间的记录区域上方，安装一台具备夜视功能、内存至少120 GB的天花板固定式摄像机，并将其置于中央位置。摄像机视野内放置的笼具数量不应超过所用VTS系统的分辨率处理能力（例如，Noldus Information Technology（Leesburg VA）生产的Ethovision XT 7可实时同时追踪8只小鼠）。
4. 短期LMA测试流程
   1. 在光周期的活跃/黑暗阶段进行短期LMA测试。确保所有实验组的时间点相对于光周期保持一致，因为LMA具有晨昏节律特征，在黑暗周期的初期和末期活动量更高¹。每组录制的小鼠中均应包含实验组和对照组个体，以尽量减少LMA时间差异可能带来的影响。
   2. 在LMA测试开始前至少24小时，将小鼠单独饲养并进行环境适应⁸。
   3. 将隔板及装有单只小鼠的笼具直接置于摄像机下方。移除笼内所有筑巢材料和环境富集物，以免遮挡小鼠（例如，小鼠钻入或被筑巢材料覆盖），从而影响VTS追踪的准确性。为每只被记录的笼具加盖透明Plexiglas盖板。
   4. 当同时录制多个笼具时，确保分辨率与所选VTS系统兼容。为便于VTS分析，应将各笼具在隔板内的位置保持一致（例如，均置于右上角）。
   5. 开始录像。每段视频开始时应插入一个标板，注明所有相关实验信息，以确保无需依赖其他非视频文档即可准确识别视频内容。使用计时器或秒表记录LMA测试的持续时间（5–10分钟）。若计时信息丢失，应从视频记录中恢复。
   6. 若采用重复测量设计进行短期LMA测试，在非测量间隔期间应允许小鼠自由获取食物和饮水。
   7. 测试过程中，实验操作人员应避免出现在小鼠视线范围内，以防成为外部视觉干扰因素。
   8. 测试结束后，及时归还或补充筑巢材料和环境富集物，以降低小鼠产生类焦虑行为的风险⁸。
5. 短期LMA分析
   1. 将测试会话的视频记录存储至与所用VTS系统兼容的归档介质中。对于Ethovision XT 7，通常使用硬盘驱动器（HDD）进行存储。
   2. 使用VTS配套的媒体播放器回放视频，并以实时模式进行分析。图1中的检测参数设置为：移动速度达2 cm/sec时开始追踪，速度降至1.75 cm/sec时停止追踪。
   3. 初始分析时，选择整个笼底作为兴趣区域（ROI）进行追踪。对于更高级的分析（如趋壁性评估），可在笼内设置多个ROI。
   4. 在高通量研究中，可同时分析视频中的所有笼具，并为每个笼底单独设定ROI。
   5. 利用VTS计算总移动距离（cm）、移动速度（cm/sec）和移动持续时间（sec）。对于Ethovision XT 7，可将生成的数据导出至Microsoft Excel中进行存储和进一步分析。

2. 长期LMA测试的设置与操作步骤

1. 长期LMA测试笼具构建
   1. 在标准小鼠笼具的短端侧壁上切割一个直径为5.5 cm的孔洞。使用¼英寸镀锌钢丝网制作孔洞的覆盖板，裁剪钢丝网并留出若干½英寸的开口，以便小鼠取食。对裁剪后的钢丝网边缘进行打磨，去除毛刺和锋利边缘。
   2. 使用额外的网片制作一个外部漏斗，并将其直接连接至覆盖5.5 cm开口的网片上。将漏斗与覆盖孔洞的网片相连，并使用铝铆钉将整个组件固定到笼子上。
   3. 使用标准的50 ml锥形离心管（Corning）和一个单孔橡胶塞（Fisher）制作饮水瓶，将橡胶塞钻扩孔以便插入防滴漏饮水管（Sta-Pure Systems）。用魔术贴胶带（3M）将饮水瓶固定在笼具上，并将饮水管穿过笼盖的网状开口插入。
   4. 在长期LMA测试期间，使用带有11个直径¼英寸通气孔的¼英寸透明Plexiglas覆盖笼具，以保证适当的通风。
2. 长期LMA测试室
   1. 长期LMA测试室的设置与短期LMA相同。操作步骤详见第1.2节。
3. 长期喉罩气道视频记录
   1. 在测试室的录制区域上方，居中安装一个与电脑直接连接的吸顶式红外监控摄像头。每次录制的笼子数量应控制在所用视频追踪系统（VTS）能够分辨单个笼子的范围内。例如 Ethovision XT 7 可同时实时追踪 8 只小鼠。
4. 长期LMA测试流程
   1. 在光照周期的活跃期/暗期测试长期LMA。确保各组相对于光照周期的时间一致，因为LMA呈晨昏节律模式，在暗期的初期和末期活动较多。 ¹在每组记录的小鼠中，同时测试实验组和对照组个体，以尽量减少昼夜活动量（LMA）测量中可能存在的时序差异影响。
   2. 将测试小鼠 individually 单独饲养于改良笼具中，适应环境至少 24 小时。
   3. 将笼具隔板及装有单只小鼠的笼具直接置于摄像头下方。移除笼具内的所有垫料/环境丰富材料，以确保对小鼠的视野无遮挡。小鼠钻入垫料中会影响视频追踪系统（VTS）对小鼠的追踪能力。为每只待记录的笼具加盖透明的有机玻璃盖。
   4. 同时记录多个笼子时，务必确保分辨率与所选视频跟踪系统（VTS）兼容。为便于VTS分析，应将每个隔间中的笼子位置保持一致。即 右上角
   5. 长期LMA测试通常采用实时分析，一般不创建视频记录。如需视频记录，可通过连接至主相机的辅助相机或DVD录像机进行录制。务必详细记录每只小鼠及分组信息。
   6. 设置视频跟踪系统（VTS）以进行实时分析。整个笼底区域应包含用于追踪的兴趣区域（ROI）。为所有正在录制的笼子设置兴趣区域（ROI）。利用VTS计算总移动距离（cm）、移动速度（cm/sec）和移动持续时间（sec）。 图2检测参数为：2 cm/sec 开始追踪；1.75 cm/sec 停止追踪。
   7. 开始记录小鼠长期活动监测（LMA）。通过分析计算机连接的时钟监测长期LMA测试的持续时间。
   8. 测试期间，所有实验操作人员应避开小鼠视线，以免成为外部视觉线索。
   9. 测试结束后，应归还或更换筑巢/环境丰富材料，以降低出现类似焦虑行为的风险 ⁸.
5. 长期LMA分析
   1. 长期LMA分析在实时进行，无需生成视频记录。若使用Ethovision XT 7，可将数据导出至Microsoft Excel以进行存储和分析。
   2. 为长期LMA生成视频记录，请使用辅助摄像机。确保该辅助摄像机具备充足的存储容量，足以保存可能较长的录制内容。

结果

重复测量的短期运动活动性（LMA）测试结果示例如图1所示。该图显示，在给予脂多糖（LPS）后，饲养于独立通风笼具（IVC）中的小鼠比饲养于普通环境笼具（AEC）中的小鼠更快恢复短期运动活动性⁶。尽管注射LPS的各组在运动活动性初始下降程度上相似，但IVC饲养小鼠恢复至基础LMA水平的速度更快，其运动速度（图1b）和运动持续时间（图1c）的恢复也更为迅速。在该短期LMA测试中采用重复测量模型，可实现对不同组别随时间推移的恢复过程进行观察和比较。

长期 LMA 测试的一个示例如 图 2 所示。该图展示了小鼠在连续两天、每天 12 小时测试期间的运动情况。在这两天之间，移动距离（图 2a）、运动速度（图 2b）或运动持续时间（图 2c）均未发现显著差异（未发表的初步数据）。尽管由于样本量较小导致误差较大，但这些结果表明，在连续多天内...

讨论

小鼠患病的症状包括嗜睡、对社交和周围环境失去兴趣、不适感以及厌食^2-3。在小鼠及其他啮齿类动物中，可利用自由活动量（LMA）评估免疫激活后的患病状态^4-5。此外，长期LMA能够连续追踪24小时（或更长时间）内的活动情况，从而分析治疗所引起的昼夜节律行为改变或睡眠/觉醒模式的紊乱。与其他疾病评估方法相比，LMA具有多项优势：它属于非侵入性检测，可轻松进行重复测量或连续监测，且干扰因素极少。与其它方法和系统（例如 Phenotyper、Intellecage、光电束系统）相比，使用VTS进行LMA分析的成本相对较低，因为可同时记录和分析多个笼子的数据。尽管本文未采用，但通过加装侧向摄像头，还可进一步分析如直立和攀爬笼壁等LMA相关行为。VTS支持高通量适应性的LMA检测，同时也可对运动进行更全面的分析，包括运动持续时间、移动距离、速度和运动轨迹的确定⁵。轨迹追踪功能尤为强大，因其与焦虑样行为密切相关。

尽管LMA结合VTS具有诸多优势，但其潜在缺陷在于小鼠可能需要被隔离或单只饲养长达（甚至可能超过）24...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
摄像机	Sony	HDR-XR500V	其他类似的摄像机也可能适用。文件存储格式（编码/容器）必须与所使用的视频追踪系统（VTS）兼容。建议在初次建立VTS时，先选择VTS，并与供应商合作选择合适的摄像机，特别是要考虑文件格式和视频分辨率的兼容性。
不透明笼具隔板			根据特定笼具尺寸定制制作。为便于图像分析，隔板颜色应与笼具垫料相近。结构固定的隔板更佳，因其可在多次小鼠实验（如重复测量实验）之间加快设置速度。可使用1/2英寸厚的不透明塑料制作坚固且便于移动的笼具隔板，并通过一系列搭接方式连接。
浅色或深色垫料（与小鼠毛色相反）			可根据所在地区从多家实验动物用品供应商处获取。
透明有机玻璃笼盖			根据笼具尺寸定制制作。
自动化视频追踪软件（EthoVision XT 7）	Noldus Information Technology		市面上存在多种VTS制造商，使用其他软件也可能满足需求。
个人电脑（PC）	Dell Inc.		请参阅VTS软件供应商对PC的最低配置要求
白噪声发生器	Dohm	DS	根据需求可选择多种类型的白噪声发生器。
带红色灯泡的育雏夹灯			有多种尺寸和款式可供选择。所需数量取决于房间大小和照明需求。测试房间内的照度不得超过125流明。
实验台或牛皮纸			纸张颜色应与笼具垫料相同或极为接近。