同时记录突触前与突触后电生理信号 非洲爪蟾 神经-肌肉共培养

摘要

本视频演示了培养非洲爪蟾（Xenopus）胚胎神经细胞和肌细胞原代培养物的操作步骤，并展示了该制备方法在同步进行突触前和突触后膜片钳记录中的应用价值。

摘要

关于突触前离子电流与神经递质释放之间耦合机制的大量信息主要来自无脊椎动物标本的研究，尤其是乌贼巨大突触¹然而，除了此处所述的制备方法外，很少有其他脊椎动物制备模型能够同时测量神经递质释放和突触前离子电流。胚胎 非洲爪蟾 运动神经元和肌细胞可在室温下的简单培养基中共同培养；它们将在12至24小时内形成功能性突触，并可用于研究神经和肌肉细胞的发育以及突触相互作用数天之久（直至出现过度生长）。相较于其他脊椎动物标本，此类共培养体系具有一些优势，包括制备简便、可在室温条件下维持培养并进行操作，以及所形成的突触易于观察和实验操作。^2-4该制备方法已广泛用于研究突触前离子通道的生物物理特性以及神经递质释放的调控机制^5-8此外，该制备方法还可用于其他研究，包括神经突起生长和突触形成的分析。^9-12神经递质释放的分子机制^13-15可扩散信使在神经调节中的作用^16,17，以及 体外 突触可塑性^18-19.

方案

1. 实验前准备

1. 配制以下溶液（参见 表1 用于配制溶液的成分）：(a) 1 升 NFR（正常林蛙林格液），(b) 100 毫升 10% 盐水，(c) 100 毫升 CMF（无钙）²⁺ /毫克²⁺-无血清溶液)，(d) 1 ml ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒，Sigma I1884），(e) 100 ml L-15 培养基，(f) 10 ml HCG（人绒毛膜促性腺激素，Sigma CG-10），(g) 100 ml K⁺-内液，(h) 100 ml K⁺-两性霉素B的内液。应使用蒸气压渗透压计检测溶液1的渗透压，确保其约为260 mOsM例如 Wescor 型号 #5100C
2. 过滤除菌溶液（b）和（c）。溶液（a）、（b）和（c）可在4 °C下保存最长三个月。通过加入1 ml去离子H₂通过25号注射器针头和注射器滤器将溶剂加入含有冻干粉的小瓶中。该终溶液可在4 °C下保存30天。
3. 在超净工作台中，将所有组分加入烧杯或烧瓶内混合配制溶液（e）。对终溶液进行过滤除菌，并将10 ml分装至无菌离心管中。于-20 °C保存。
4. 通过加入10 ml去离子水配制HCG（溶液(f)）₂通过25号注射器针头和注射器滤器，将0加入含有冻干粉末的小瓶中。该终溶液可在4 °C下保存30天。
5. 使用氰基丙烯酸酯胶水将一枚微型针（Minutien pin，26002-10，Fine Science Tools）粘附至玻璃巴斯德吸管末端，制备至少两把显微解剖工具。微型针的尖端应伸出吸管末端约0.5 cm。
6. 在准备培养前两天，按以下步骤诱导配种。确定一对具备配种条件的 非洲爪蟾 通过观察雌性个体明显的红褐色泄殖腔，以及雄性个体前肢掌面的深色色素沉着进行区分。逐个用网捞起青蛙，并用网将其腹部朝下固定于水槽上，防止其逃脱。透过网将1 ml溶液（f）注射至其中一侧背侧淋巴囊的皮下。
7. 将繁殖配对的个体共同放入一个装有十加仑水的带盖水族箱中。为防止动物踩踏新产下并已受精的卵，需安装筛网式底板，网孔大小约为½英寸，并将其固定在距箱底约1-2英寸的位置（图1A).
8. 让青蛙静置12–48小时，直至动物进入抱对状态，并在筛网下方的底部观察到已受精的卵图1B).
9. 将动物从水箱中移出，但让卵保持不受干扰至少再过24小时。这对青蛙可在六周后再次进行繁殖。
10. 将胚胎从培养皿底部松动，并转移至四到五个含有10%盐水（溶液b）的60×15 mm培养皿中。根据Niewkoop和Faber的分期方案（参考文献20）对胚胎进行分期筛选。适用于实验的胚胎应为22–24期。 图2A 显示约22期的胚胎 图2B 显示的胚胎发育阶段过晚，已无使用价值（约第28期）。选择健康胚胎至关重要：外观光滑、呈浅褐色与白色斑驳相间的胚胎为理想状态。若胚胎具有较大面积的黑色或白色斑块，则通常不健康且不可用。

2. 显微解剖 非洲爪蟾 胚胎

1. 在超净工作台内，将三个无菌培养皿（60×15 mm）分别标记后，用10%生理盐水填充至约一半高度；另取一个培养皿用CMF填充。
2. 使用无菌玻璃巴斯德移液管，将5至10个22-24期的胚胎转移至其中一个含有10%生理盐水的培养皿中。在超净台内的体视变倍显微镜下（0.6–5×物镜，10×目镜），使用两对无菌#5镊子（11251-30，Fine Science Tools）去除每个胚胎的胶质膜和卵黄膜。（见图3A和图3B。）
3. 依次将裸露的胚胎逐个通过另外两个盛有10%生理盐水的培养皿进行清洗，最后转移至盛有CMF的培养皿中。每次转移均需使用新的无菌移液管，并尽量减少随胚胎转移的液体体积。
4. 依次用一对镊子轻而牢固地夹住每个胚胎，使用步骤1.5中制备的显微解剖工具，切除位于动物体背侧最上方的神经管及其相关的肌节。通过三处切口完成：在神经管两端各一切口，第三处切口位于其腹侧正下方（图4A）。将每一段分离出的神经管/肌节移至培养皿中洁净区域，远离卵黄颗粒和其他碎片（图4B）。背腹轴以及神经管和肌节的位置在图4中予以标明。
5. 组织在此溶液（CMF）中孵育约15分钟后，用镊子将色素化的皮肤从已解离的组织上提起并弃去。再经过额外30–60分钟，细胞将彼此分离，形成“沙堆”状聚集体（图4C）。

3. 神经-肌肉共培养的制备

1. 解冻一支10 ml的培养基，无菌条件下加入70 μl ITS和35 ng/ml BDNF（Sigma B3795）。
2. 标记并用L-15培养基（溶液(e)）填充无菌的35 mm培养皿（FD35-100，World Precision Instruments），每个培养皿填充约一半体积，每个解剖得到的胚胎对应一个培养皿。
3. 通过手持玻璃巴斯德吸管的两端，将细端置于火焰上方加热，然后将两端缓慢拉开至约10 cm，再折断末端，制成尖端直径约为0.2 mm的铺板吸管。
4. 使用铺板吸管吸取一个胚胎中的“沙堆”样细胞团，尽量减少吸入的液体量。将细胞吹打至培养皿底部，以多条线状形式进行铺板。观察已铺板的未分化细胞（图5A 和 图5B）。
5. 将铺有细胞的培养皿静置至少15分钟，期间勿扰动，以使细胞有足够时间贴附于培养皿表面。

4. 神经-肌肉突触的膜片钳记录

1. 培养 12–24 小时后，贴壁细胞呈现出明显的形态学特征：肌细胞呈梭形，脊髓神经元则延伸出较长的突起（图 6）。可通过同步配对的电生理记录确认神经末梢膨大与肌细胞之间形成功能性突触连接。“M”、“S”和“V”分别代表肌细胞、神经元胞体和突触前膨大。
2. 准备两个膜片钳电极用于记录：一个用于突触前膨大，另一个用于肌细胞。
3. 配制含两性霉素的溶液作为突触前电极填充液：取 1.5 ml 微离心管，加入 5 mg 两性霉素 B（Sigma A4888），再加入 100 μl DMSO，涡旋振荡 10 秒。然后取 10 μl 该溶液加入另一含有 625 μl 用于两性霉素 B 的 K⁺-内液（溶液 (h)）的微离心管中，同上涡旋振荡。
4. 用步骤 4.3 配制的含两性霉素的 K⁺-内液填充突触前电极，用 K⁺-内液（溶液 (g)）填充突触后电极。
5. 将培养皿中的培养基更换为 NFR，并将培养皿转移至配备相差光学系统的倒置显微镜下。
6. 将两个电极分别置于目标细胞上方。先对肌细胞建立全细胞记录模式，再对膨大部位建立穿孔膜片钳记录模式。
7. 为验证突触的功能性，使用膜片钳放大器（例如 Axopatch 200B，Molecular Devices）在软件控制下（例如 pCLAMP 9，Molecular Devices）对突触前膨大进行去极化刺激，并同步观察突触前和突触后电流。图 7 显示了当突触前膨大以 10 mV 为增量、从 -30 mV 阶梯式去极化至 +40 mV 时所记录到的电流反应。突触前细胞中的内向电流由 Na⁺ 和 Ca²⁺ 携带，外向电流由 K⁺ 携带。突触后细胞中记录到的电流是神经递质从膨大处释放所引发的反应，主要通过烟碱型乙酰胆碱受体通道由 Na⁺ 携带。

结果

图4B 显示了22期胚胎脊髓/体节取出后立即观察到的背侧视图 非洲爪蟾 胚胎 图 4C 表明，在去除皮肤并经 Ca 孵育后²⁺-Mg²⁺无钙镁溶液（CMF，溶液c）中，细胞解离成“沙堆”状，即可用于铺板。铺入培养基后，细胞立即表现出较低的形态学变异性（图5B）但在培养24小时后呈现不同的形态。肌细胞变为纺锤形，而神经元则保持球形，同时延伸出神经突，在与肌细胞形成突触的部位产生曲张体。图6). 对突触前曲张体和突触后肌细胞进行同步配对膜片钳记录（图7揭示了与神经递质释放相关的突触前内向和外向电流，以及由此产生的兴奋性突触后电流。

图 1. A： 位于筛网顶部的交配桶中正在繁殖的一对蛙类。B： 处于抱对状态的蛙类及其已受精的卵。

图2. A： “合适”的22期胚胎。B： “不合适”的28期胚胎。比例尺表示1 mm。

图3. A：去除卵黄膜和胶状包膜前的22期胚胎。箭头指向胶状包膜的外缘。卵黄膜紧贴胚胎表面，几乎不可见。B：裸露的胚胎。比例尺为1 mm。

图4. A： 第22期胚胎，虚线表示将要分离的部分。 B： 急性分离的胚胎背侧部分；“d”和“v”分别代表胚胎的背侧和腹侧，而“m”和“n”表示体节肌和神经管的大致位置。 C： 在CMF中孵育60分钟后形成的“沙堆状”细胞团。比例尺在A中代表1 mm，在B和C中代表0.5 mm。

图5. A：接种后立即观察的培养细胞，5倍放大视野。B：相同培养物在40倍下的图像。比例尺在A中代表40 μm，在B中代表5 μm。

图6. 培养中的神经肌肉接头，标示出神经元胞体（S）、突触前膨体（V）和突触后肌细胞（M）。比例尺：5 μm。

图 7. 对突触前末梢施加从 -30 mV 到 +40 mV、以 10 mV 为增量的电压阶跃所记录到的突触前（上图）和突触后（下图）电流。某些突触前迹线旁标注了相应的电压阶跃。两个细胞的钳制电位均为 -70 mV。

讨论

成功共培养运动神经元和肌细胞的关键步骤包括：利用诱导繁殖的非洲爪蟾（Xenopus）青蛙所产生的适当发育阶段的胚胎，以及对未分化的脊髓神经元和成肌细胞进行严格的无菌解剖。受精卵应保持静置，直至其发育至约第10期左右，因为过早移动常会终止其发育。健康的胚胎表现为表面光滑，具有棕白相间的斑驳色泽。第22至24期的胚胎最为适用，因为此时期正处于神经管闭合后、而肌细胞尚未显著分化的发育阶段。此外，较老胚胎的细胞在CMF中难以有效解离。去除卵黄膜时需格外小心，因其与胚胎紧密粘连。应使用尖头镊子将膜撕开，使胚胎完整释放。另一个重要注意事项是，应小心地将细胞直接放置于培养皿底部（而非任其自然沉降），因为该方法更有利于细胞贴附于培养皿表面。

仅通过记录突触后信号即可确定神经与肌肉之间的功能性神经传递，通常还可通过观察神经支配后肌肉的自发性收缩来判断。未受神经支配的肌细胞在培养中不会发生抽搐。仅进行突触后记录适用于记录微小终板电流或电位，但若要测量诱发释放，则需要进行突触前刺激，而要关联突触前与突触后电流，需采用双膜片钳技术。

除了此处描述的成对膜片钳记录方法外，该制备方法还允许在神经元胞体处引入第三根微电极⁵。这可以诱发动作电位，使其传播至突触前曲张体，从而引起神经递质的释放。此外，可将推测能够介导或调节突触传递的物质引入突触的任一侧：通过肌细胞的微电极，或通过放置在胞体处的第三根微电极进行扩散给药。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰岛素-转铁蛋白-硒	Sigma	I1884
人绒毛膜促性腺激素	Sigma	CG-10
蒸气压渗透压计	Wescor	5100C
微型固定针	Fine Science Tools	26002-10
两性霉素B	Sigma	A4888
镊子	Fine Science Tools	11251-30
<表格 边框="1"> <胸段>
<强>溶液名称	<强>配方
(a) NFR（正常林蛙林格液（单位：mM））	116 NaCl，2 KCl，1.8 CaCl2，5 钠+-HEPES，pH 7.35
(b) 10% 盐水	10 ml NFR + 90 ml 去离子 H2O
(c) CMF（Ca2+ /毫克2+无溶液	125 毫摩尔氯化钠，2 毫摩尔氯化钾，1.2 毫摩尔乙二胺四乙酸，5 毫摩尔钠+-HEPES，pH 7.35。
(e) L-15 培养基	50 ml L-15培养基（Sigma L1518）＋50 ml NFR。
(g) K+- 内液（单位：mM）	116 KCl，1 NaCl，1 MgCl2，10 EGTA，5 HEPES，pH 7.3
(h) K+-两性霉素B的内液（单位：mM）	52 K2SO4，38 KCl，1 EGTA，5 HEPES，pH 7.3

<强>表1.