斑马鱼是研究人类骨骼肌疾病的新兴模型系统。本文介绍一种快速高效分离斑马鱼胚胎和幼体骨骼肌肌纤维的方法。该方法可获得高密度的肌纤维样本，适用于单个骨骼肌纤维形态学、蛋白质亚细胞定位以及肌肉生理学的研究。
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本文内容
摘要
摘要
斑马鱼已被证明是研究骨骼肌功能和人类肌肉疾病的一个有价值的模型系统。尽管其提供了诸多优势 体内 斑马鱼骨骼肌分析中，可视化负责肌肉功能的复杂且精细结构的蛋白质环境，尤其是在完整胚胎中，可能具有挑战性。这一困难源于斑马鱼骨骼肌尺寸较小（60 μm），以及肌节尺寸更小。本文描述并演示了一种简单快速的方法，用于从斑马鱼胚胎和幼鱼中分离骨骼肌纤维。同时提供了后续处理技术的方案，适用于分析肌肉结构与功能。具体而言，我们详细介绍了骨骼肌蛋白的免疫细胞化学定位，以及通过活细胞钙成像对刺激诱导的钙释放进行定性分析。总体而言，本视频文章提供了一种直接高效的斑马鱼骨骼肌纤维分离与表征方法，该技术为多种后续肌肉结构与功能研究提供了途径。 关键词：斑马鱼，骨骼肌，肌纤维分离，免疫细胞化学，钙成像，肌节，胚胎，幼鱼
引言
骨骼肌是一种高度特化的组织，负责产生运动所需的收缩力。收缩通过一种称为兴奋-收缩耦联（excitation-contraction, EC）的过程启动，该过程将电信号转化为细胞内钙库的钙离子释放1,2。细胞内钙离子的释放可激活肌节缩短并产生收缩力。介导神经肌肉接头传递3、兴奋-收缩耦联4,5以及肌动蛋白-肌球蛋白依赖性收缩6的分子机制包含多种特定组分，目前仍是深入研究的重点。此外，参与稳定肌肉膜收缩过程中结构完整性7,8以及介导肌纤维与细胞外基质之间信号传导的蛋白质7,9也已被鉴定并得到深入研究。
已发现多个对肌肉结构和功能至关重要的基因发生突变是人类骨骼肌疾病的致病原因（http://www.musclegenetable.org/）。这些疾病根据临床和组织病理学特征 broadly 被归类为骨骼肌病和肌营养不良症，常伴随肌肉无力、终身残疾以及早亡10,11。斑马鱼已被证实是研究人类骨骼肌疾病的优秀模型系统8,12,13。该模型已被用于验证新发现的基因突变8、阐明疾病病理生理学的新机制14,15，以及发现新的治疗策略15,16....
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方案
1. 聚-L-赖氨酸包被盖玻片的制备（时间：1 小时）
包被盖玻片可促进肌纤维快速沉降和贴附。此步骤可在肌纤维分离的解离过程中进行（如下步骤2）。
- 将Parafilm剪裁后放置于60 mm培养皿（任何品牌均可）底部。
- 将显微镜盖玻片（直径12 mm）放置在60 mm组织培养皿中的Parafilm上，或单独放入24孔板的各个孔中。
注意 1：这些小型圆形盖玻片有助于集中肌纤维数量，并减少抗体的过量使用。
注意 2：其他尺寸的盖玻片也可使用；但需相应调整试剂和胚胎的用量。
- 在培养皿中的每个盖玻片上加入 50–200 μl 多聚赖氨酸（poly-L-lysine）溶液（0.01%）。
- 将盖玻片置于 37 °C 下静置至少 1 小时。更长时间的孵育不会对结果产生不利影响。
- 从盖玻片上移除多聚赖氨酸溶液，并用不少于 100 μl 的 1× PBS 洗涤两次。
- 让盖玻片自然干燥。
- 盖玻片现已准备好用于肌纤维实验。
注意 3：为确保无菌，包被操作可在超净台中进行，并使用已灭菌的盖玻片。
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结果
肌纤维的荧光免疫标记（图2）
图像显示了成功分离并接种后，肌纤维经免疫荧光染色所预期的荧光标记模式。肌纤维分别使用抗兰诺碱受体抗体（1:100）（图2A）或抗α-肌动蛋白结合蛋白抗体（1:100）（图2B）进行标记，分别显示出三联体和Z带的免疫荧光染色结果。所用二抗为Alexa Fluor 555（1:500）。图像采用共聚焦显微镜采集。
肌纤维中诱导的钙释放（图3）
图示为经咖啡因处理的分离肌纤维中典型的钙离子释放过程。简言之，在单细胞期将pSKM:GCaMP3质粒注射至斑马鱼胚胎中。在受精后3天（3 dpf），按照实验方案所述方法对胚胎进行解离并接种培养。分析时，根据基础状态下存在的绿色荧光，选择表达GCaMP3的肌纤维。通过微移液管给药，将选定的肌纤维浸入30 mM咖啡因溶液中以诱导钙离子释放。在.......
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讨论
斑马鱼是一种强大的脊椎动物模型系统，可用于研究肌肉的发育和功能 体内25,27,28 。斑马鱼也已成为模拟人类肌肉疾病的重要工具14,15,20,29 。尽管在推动斑马鱼用于肌肉功能和肌肉疾病研究的应用方面已取得显著进展，但仍迫切需要不断开发新的工具，以实现更深入的分析，从而补充斑马鱼在遗传学、形态学、行为学和功能学方面已有的优势17。因此，我们改进并建立了一种简单且稳健的技术，用于从解离的完整胚胎中对斑马鱼肌纤维进行表征。
在使用小鼠模型系统的研究中，单个肌纤维的应用十分普遍。在小鼠中，这种方法使得对亚细胞蛋白定位30、活细胞成像31以及电生理测量32等难以在整体动物中开展或根本无法实现的研究与分析成为可能。在斑马鱼中，已有类似的解离技术被开发出来，用于特异性鉴定和研究运动神经元33 以及Rohon-Beard感觉神经元34，这些技术为深入分析这些神.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者希望感谢Dowling实验室的成员（Aaron Reifler、Trent Waugh、Angela Busta和William Telfer），他们为该技术的开发以及手稿的撰写做出了贡献。本工作由Taubman研究所、密歇根大学儿科系资助，并部分获得肌营养不良协会（JJD MDA186999）和美国国立卫生研究院（JJD 1K08AR054835）基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔培养板 | Corning | 3524 | |
| 10倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS） | Invitrogen Gibco | 70011 | |
| CO2 独立培养基 | Invitrogen Gibco | 18045 | |
| II型胶原酶 | Worthington Biochemical | LS004186 | 批号 41H12764 |
| IV型胶原酶 | Worthington Biochemical | L5004188 | |
| 8% 戊二醛 | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| 甲醇 | Sigma | 322415 | |
| 吐温X-100 | Sigma | X100 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A2153 | |
| 绵羊血清 | Sigma | S3772 | |
| 山羊血清 | Sigma | G9023 | |
| 玻璃盖玻片 | Fischerbrand | 12-545-82 12CIR-1D | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | P4707 | |
| 蛋白酶K | Sigma | P5147 | |
| 40 μm 滤膜 | BD Biosciences | 352340 | |
| 70 μm 滤膜 | BD Biosciences | 352350 | |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36931 | |
| 抗-α-肌动蛋白抗体 | Sigma | A5044 | |
| 抗RYR抗体 | Abcam | 34C | |
| Alexa Fluor 抗体 | Invitrogen | A-21425 | |
| 吐温20（TWEEN 20） | Sigma | P1379 | |
| 60 mm 培养皿 | Fischerbrand | 0875713A | |
| 聚-L-鸟氨酸 | Sigma | P4957 | |
| 显微镜载玻片 | Fischerbrand | 12-550-15 | |
| 咖啡因 | Sigma | C0750 |
参考文献
- Dulhunty, A. F. Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33, 763-772 (2006).
- Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap: recent developments in skeletal....
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