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方法文章

分离制备物中斑马鱼胚胎和幼鱼骨骼肌肌纤维的分析

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DOI：

10.3791/50259

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2013年11月13日

 ,  ,  ,  , 
1Departments of Pediatrics and Neurology, University of Michigan

本文内容

摘要

斑马鱼是研究人类骨骼肌疾病的新兴模型系统。本文介绍一种快速高效分离斑马鱼胚胎和幼体骨骼肌肌纤维的方法。该方法可获得高密度的肌纤维样本，适用于单个骨骼肌纤维形态学、蛋白质亚细胞定位以及肌肉生理学的研究。

摘要

斑马鱼已被证明是研究骨骼肌功能和人类肌肉疾病的一个有价值的模型系统。尽管其提供了诸多优势 体内 斑马鱼骨骼肌分析中，可视化负责肌肉功能的复杂且精细结构的蛋白质环境，尤其是在完整胚胎中，可能具有挑战性。这一困难源于斑马鱼骨骼肌尺寸较小（60 μm），以及肌节尺寸更小。本文描述并演示了一种简单快速的方法，用于从斑马鱼胚胎和幼鱼中分离骨骼肌纤维。同时提供了后续处理技术的方案，适用于分析肌肉结构与功能。具体而言，我们详细介绍了骨骼肌蛋白的免疫细胞化学定位，以及通过活细胞钙成像对刺激诱导的钙释放进行定性分析。总体而言，本视频文章提供了一种直接高效的斑马鱼骨骼肌纤维分离与表征方法，该技术为多种后续肌肉结构与功能研究提供了途径。 关键词：斑马鱼，骨骼肌，肌纤维分离，免疫细胞化学，钙成像，肌节，胚胎，幼鱼

引言

骨骼肌是一种高度特化的组织，负责产生运动所需的收缩力。收缩通过一种称为兴奋-收缩耦联（excitation-contraction, EC）的过程启动，该过程将电信号转化为细胞内钙库的钙离子释放1,2。细胞内钙离子的释放可激活肌节缩短并产生收缩力。介导神经肌肉接头传递3、兴奋-收缩耦联4,5以及肌动蛋白-肌球蛋白依赖性收缩6的分子机制包含多种特定组分，目前仍是深入研究的重点。此外，参与稳定肌肉膜收缩过程中结构完整性7,8以及介导肌纤维与细胞外基质之间信号传导的蛋白质7,9也已被鉴定并得到深入研究。

已发现多个对肌肉结构和功能至关重要的基因发生突变是人类骨骼肌疾病的致病原因（http://www.musclegenetable.org/）。这些疾病根据临床和组织病理学特征 broadly 被归类为骨骼肌病和肌营养不良症，常伴随肌肉无力、终身残疾以及早亡10,11。斑马鱼已被证实是研究人类骨骼肌疾病的优秀模型系统8,12,13。该模型已被用于验证新发现的基因突变8、阐明疾病病理生理学的新机制14,15，以及发现新的治疗策略15,16。斑马鱼在研究人类肌肉疾病方面的优势在于其后代数量多、肌肉结构与功能发育迅速、胚胎具有良好的光学通透性，以及对发育中斑马鱼进行遗传学和药理学操作的便捷性17。

我们及其他研究者12,18,19近期开发了一种简单的方法，用于从发育中的斑马鱼中快速高效地分离肌纤维。该方法使得对肌纤维的观察比整体胚胎分析更为细致。该技术已被用于蛋白质亚细胞定位的表征20，以及在新建立的疾病模型验证研究中识别重要的组织病理学特征21。此外，分离的肌纤维还可用于活体成像和电生理学研究22，这些技术能够探究肌肉功能的关键方面。本文后续部分将详细描述肌纤维分离的具体方案，以及两个后续分析实验的示例。

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方案

1. 聚-L-赖氨酸包被盖玻片的制备（时间：1 小时）

包被盖玻片可促进肌纤维快速沉降和贴附。此步骤可在肌纤维分离的解离过程中进行（如下步骤2）。

  1. 将Parafilm剪裁后放置于60 mm培养皿（任何品牌均可）底部。
  2. 将显微镜盖玻片（直径12 mm）放置在60 mm组织培养皿中的Parafilm上，或单独放入24孔板的各个孔中。

注意 1：这些小型圆形盖玻片有助于集中肌纤维数量，并减少抗体的过量使用。

注意 2：其他尺寸的盖玻片也可使用；但需相应调整试剂和胚胎的用量。

  1. 在培养皿中的每个盖玻片上加入 50–200 μl 多聚赖氨酸（poly-L-lysine）溶液（0.01%）。
  2. 将盖玻片置于 37 °C 下静置至少 1 小时。更长时间的孵育不会对结果产生不利影响。
  3. 从盖玻片上移除多聚赖氨酸溶液，并用不少于 100 μl 的 1× PBS 洗涤两次。
  4. 让盖玻片自然干燥。
  5. 盖玻片现已准备好用于肌纤维实验。

注意 3：为确保无菌，包被操作可在超净台中进行，并使用已灭菌的盖玻片。

注意 4：将带 Parafilm 的 60 mm 培养皿底部朝下放置。此装置将在肌纤维接种和免疫标记（后续步骤）中使用。

替代方案1：可使用预先包被的盖玻片库存，而非在使用前立即包被。将大量盖玻片置于含有至少2 ml多聚-L-赖氨酸的60 mm培养皿中，可在4 °C保存。采用此替代方案时，从步骤1.5开始处理盖玻片以用于肌纤维实验。

替代方案2：我们还使用多聚-L-鸟氨酸对盖玻片进行包被。该方法更为耗时，但适用于长期培养，因为经多聚-L-鸟氨酸包被的盖玻片可进行紫外线处理。通过紫外线处理并结合严格的无菌操作技术，活体肌纤维通常可在培养条件下维持4至7天。

2. 斑马鱼胚胎的解离与肌纤维的接种（时间：1 至 3 小时）

注意：标准方案最适合应用于受精后3天（days post fertilization）的胚胎。

  1. 将斑马鱼胚胎转移至标准的1.5 ml离心管中，并尽可能去除多余的养鱼用水。通常每管放置10–20个胚胎，也可使用更少数量。超过20–25个胚胎通常会导致制备物密度过高。
    1. 在解离前，使用#5镊子手动去除胚胎的绒毛膜。或者，可通过10–15分钟的蛋白酶（Pronase）处理实现化学法去除绒毛膜。通常仅在需要预先确认突变表型或形态，或使用已自然孵化出绒毛膜的发育阶段时，才需提前去除绒毛膜。
  2. 向含有胚胎的离心管中加入900 μl的CO2 非依赖性培养基。
  3. 加入100 μl II型胶原酶，终浓度为3.125 mg/ml（将31.25 mg/ml的胶原酶储备液用1×PBS稀释）。也可使用IV型胶原酶进行解离。
  4. 将胚胎置于旋转摇床中旋转，并在室温下每隔30分钟使用P1000移液器吹打混匀一次，以完成吹打解离。

注意 2：需仔细监测胚胎解离过程；解离过度或不足（尤其是过度解离）是导致实验方案失败的最常见原因。消化时间会因吹打强度、每管中胚胎数量以及胚胎发育阶段的不同而有所差异。此外，骨骼肌突变体胚胎的消化时间通常比野生型胚胎更短。

注3：不同胚胎日龄的平均消化时间：1 dpf = 1小时，2 dpf = 1.5小时，3 dpf = 2小时，4 dpf = 2-2.5小时。

  1. 当已无完整胚胎可见，但仍可见固体碎片时，停止消化—— 这一点至关重要，可防止过度消化。
  2. 将已解离的胚胎样品在 0.8–2.3 × g 条件下离心 3–5 分钟，以沉淀细胞。
  3. 弃去沉淀细胞的上清液，并用 CO2 非依赖性培养基洗涤两次。
  4. 加入新鲜的 CO2 非依赖性培养基重悬细胞。通常每 10–20 个胚胎使用 1 ml 培养基，可根据胚胎数量按比例调整体积。
  5. 使用 P1000 移液器将胚胎悬液通过 70 μm 滤膜，以去除样品中的不必要碎片。

注意 4：胚胎悬液可再次通过 40 μm 滤器过滤，以进一步去除不需要的碎片。经过两次过滤后，从 1 ml 起始体积中回收量约为 800 μl。

  1. 向每张经多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片中加入约 50–100 μl 的肌纤维悬液。

注意5：在之前准备好的底部带有Parafilm的培养皿中进行步骤2.9。Parafilm可防止肌纤维悬液从包被的盖玻片上流失。保持培养皿加盖，以防止蒸发。

  1. 将肌纤维置于室温下，使其在包被的盖玻片上静置约1小时。

注意6：肌纤维将在5-10分钟内开始沉降。然而，为获得良好的肌纤维贴壁效果，建议至少静置1小时（1-2小时）。延长肌纤维沉降时间不会对制备样品造成损害。对于较长时间的孵育（包括过夜孵育），可在培养基中添加抗生素。在使用抗生素并保持无菌操作的条件下，活体培养通常可维持1-2天。

  1. 此时可观察到活体肌纤维。来自2 dpf及更晚期胚胎的肌纤维呈现为具有横纹的细长细胞（图1）。此时，肌纤维已准备好进行活体分析或免疫标记。

注意 7：1 dpf 胚胎的骨骼肌不会贴壁形成细长且横纹清晰的肌纤维，而是可见较大的肌球状细胞团（myoballs）。此外，在解离后的离心成团阶段（步骤 2.6），1 dpf 的肌球状细胞团需在 5,000 × g 条件下离心至少 8 分钟才能形成沉淀。针对此发育阶段胚胎的分析，建议使用特异性在骨骼肌中表达 EGFP 的转基因品系23，这有助于区分来源于肌肉的细胞与其他来源的细胞。

3. 斑马鱼分离肌纤维的荧光免疫染色（耗时：约1天）

3.1. 免疫标记

  1. 从黏附在包被盖玻片上的肌纤维中移除部分培养基
  2. 使用4%多聚甲醛或甲醇固定细胞。对于多聚甲醛固定，移除 ½ 培养基的体积，并加入等量的PFA。室温固定10分钟，然后移除全部液体，替换为50-100 μl 的 PFA，再固定 10 分钟。对于酒精固定，可在 4℃ 使用冰冻甲醇或丙酮处理。 °分别在 C 条件下孵育 10 分钟或 5 分钟。
  3. 用1×PBS或含0.1% TWEEN的1×PBS洗涤肌纤维至少3–5次。每次洗涤的平均体积为50–100 μ每盖玻片升。
  4. 向肌纤维中加入封闭液（工作浓度），室温孵育20–60分钟。封闭液的配方根据一抗和二抗的不同而有所调整。实验室中最常用的两种封闭液为：（1）1× PBS，2 mg/ml BSA，1% 羊血清，0.25% Triton X-100（终浓度）；（2）0.2% Triton X-100，2 mg/ml BSA（即0.2% BSA），5% 羊/山羊血清。
  5. 去除封闭液，加入用封闭液或PBS稀释的一抗。4℃下孵育肌纤维过夜 °C. 确保用封口膜或保鲜膜密封含有已加抗体的载片的培养皿。可加入少量湿润的纸巾以形成湿化环境。
  6. 从盖玻片上移除一抗，用 PBS 或封闭液洗涤盖玻片，每次 5 分钟，重复 3–5 次。
  7. 在1× PBS或封闭液中按适当浓度稀释二抗，室温孵育1–2小时。
  8. 去除二抗，用 PBS 在室温下洗涤肌纤维，每次 5 分钟，重复 3 至 5 次。

3.2. 盖玻片封片

  1. 在显微镜载玻片上滴加 1-2 滴抗荧光淬灭剂。
  2. 用镊子小心夹起已包被并完成免疫标记的盖玻片，将其有肌纤维的一面朝下，放置在载玻片的抗荧光淬灭剂上。

注意1：注意镀膜盖玻片的方向至关重要。

  1. 将1-2张Kimwipe纸平铺在坚硬的固体表面上。迅速将载玻片倒置，使带有涂层的盖玻片接触抗荧光淬灭剂，然后将其（盖玻片朝下）放置在Kimwipe纸上。
  2. 轻轻按压显微镜载玻片的四个角，以去除多余的抗荧光淬灭剂，并在载玻片与盖玻片之间形成紧密密封。
  3. 在室温下静置5-10分钟，使残留的抗荧光淬灭剂干燥，随后肌纤维即可用于成像（图2A和 B），或于4 °C保存。

4. 使用 GCaMP3 进行活细胞钙成像

在固定之前（完成步骤 2.10 后），可对肌纤维进行活细胞实验。以下方案描述了表达 GCaMP324（一种由骨骼肌特异性斑马鱼 α-肌动蛋白启动子（pSKM）23驱动表达的基因编码钙离子指示剂）的肌纤维中的活体成像。此外，该技术也可轻松调整用于使用钙离子指示剂染料（如 Fura-2）的实验。

  1. 在1-2细胞期向胚胎显微注射pSKM: GCaMP3质粒
  2. 在受精后3天（3 dpf）收集幼鱼，并按照第1和第2节所述方法制备肌纤维。让肌纤维贴壁至少1小时。本技术要求将盖玻片置于24孔板中进行制备。
  3. 小心移除多余培养基，并在室温下加入300 μl新鲜的CO2 非依赖性培养基。
  4. 在倒置显微镜下观察细胞。表达GCaMP3的肌纤维应在绿色荧光下可见。
  5. 如需记录，设置好相机采集参数。
  6. 用CO2 非依赖性培养基配制30 mM咖啡因溶液。在显微放大条件下，轻柔地将300 μl咖啡因溶液加入孔中以刺激细胞。在5-10秒内，GCaMP阳性肌纤维应表现出荧光强度的快速升高（图3）。肌纤维可能同时发生收缩。需要注意的是，咖啡因可诱导肌浆网钙库中的钙离子释放25。其他试剂如KCl26 和雷尼丁碱（ryanodine）4也可用于研究可诱导的钙释放。

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结果

肌纤维的荧光免疫标记（图2）

图像显示了成功分离并接种后，肌纤维经免疫荧光染色所预期的荧光标记模式。肌纤维分别使用抗兰诺碱受体抗体（1:100）（图2A）或抗α-肌动蛋白结合蛋白抗体（1:100）（图2B）进行标记，分别显示出三联体和Z带的免疫荧光染色结果。所用二抗为Alexa Fluor 555（1:500）。图像采用共聚焦显微镜采集。

肌纤维中诱导的钙释放（图3）

图示为经咖啡因处理的分离肌纤维中典型的钙离子释放过程。简言之，在单细胞期将pSKM:GCaMP3质粒注射至斑马鱼胚胎中。在受精后3天（3 dpf），按照实验方案所述方法对胚胎进行解离并接种培养。分析时，根据基础状态下存在的绿色荧光，选择表达GCaMP3的肌纤维。通过微移液管给药，将选定的肌纤维浸入30 mM咖啡因溶液中以诱导钙离子释放。在...

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讨论

斑马鱼是一种强大的脊椎动物模型系统，可用于研究肌肉的发育和功能 体内25,27,28 。斑马鱼也已成为模拟人类肌肉疾病的重要工具14,15,20,29 。尽管在推动斑马鱼用于肌肉功能和肌肉疾病研究的应用方面已取得显著进展，但仍迫切需要不断开发新的工具，以实现更深入的分析，从而补充斑马鱼在遗传学、形态学、行为学和功能学方面已有的优势17。因此，我们改进并建立了一种简单且稳健的技术，用于从解离的完整胚胎中对斑马鱼肌纤维进行表征。

在使用小鼠模型系统的研究中，单个肌纤维的应用十分普遍。在小鼠中，这种方法使得对亚细胞蛋白定位30、活细胞成像31以及电生理测量32等难以在整体动物中开展或根本无法实现的研究与分析成为可能。在斑马鱼中，已有类似的解离技术被开发出来，用于特异性鉴定和研究运动神经元33 以及Rohon-Beard感觉神经元34，这些技术为深入分析这些神...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者希望感谢Dowling实验室的成员（Aaron Reifler、Trent Waugh、Angela Busta和William Telfer），他们为该技术的开发以及手稿的撰写做出了贡献。本工作由Taubman研究所、密歇根大学儿科系资助，并部分获得肌营养不良协会（JJD MDA186999）和美国国立卫生研究院（JJD 1K08AR054835）基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔培养板Corning3524
10倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS）Invitrogen Gibco70011
CO2 独立培养基Invitrogen Gibco18045
II型胶原酶Worthington BiochemicalLS004186批号 41H12764
IV型胶原酶Worthington BiochemicalL5004188
8% 戊二醛Electron Microscopy Sciences157-8
甲醇Sigma322415
吐温X-100SigmaX100
牛血清白蛋白（BSA）SigmaA2153
绵羊血清SigmaS3772
山羊血清SigmaG9023
玻璃盖玻片Fischerbrand12-545-82 12CIR-1D
聚-L-赖氨酸SigmaP4707
蛋白酶KSigmaP5147
40 μm 滤膜BD Biosciences352340
70 μm 滤膜BD Biosciences352350
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36931
抗-α-肌动蛋白抗体SigmaA5044
抗RYR抗体Abcam34C
Alexa Fluor 抗体InvitrogenA-21425
吐温20（TWEEN 20）SigmaP1379
60 mm 培养皿Fischerbrand0875713A
聚-L-鸟氨酸SigmaP4957
显微镜载玻片Fischerbrand12-550-15
咖啡因SigmaC0750

参考文献

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