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方法文章

全身纳米颗粒气溶胶吸入暴露

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DOI：

10.3791/50263

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2013年5月7日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, School of Medicine, West Virginia University , 2Center for Cardiovascular and Respiratory Sciences, West Virginia University , 3National Institute for Occupational Safety and Health

本文内容

摘要

为开展纳米级二氧化钛（TiO2）吸入毒理学研究，建立了一套全身暴露的纳米颗粒气溶胶吸入暴露系统。该系统可提供满足以下条件的纳米TiO2气溶胶测试环境：1）质量浓度稳定；2）组分均匀且无污染物；3）在气溶胶生成过程中粒径分布保持稳定。

摘要

对于操作可气溶胶化工程纳米材料（ENM）的人员而言，吸入是最可能的暴露途径。为了正确开展纳米颗粒吸入毒理学研究，容纳实验动物的暴露舱内的气溶胶必须满足以下条件：1）在整个暴露期间，浓度保持稳定并维持在目标水平；2）成分均匀，不含污染物；3）粒径分布稳定，几何平均直径< 200 nm，几何标准偏差 σg < 2.5 5。由于纳米颗粒极易发生团聚，生成含纳米颗粒的气溶胶极具挑战性。这主要是因为颗粒间作用力极强，并会形成尺寸达数十甚至数百微米的大型分形结构6，难以将其分散。研究人员已测试了多种常见的气溶胶发生器，包括雾化器、流化床、文丘里抽吸器和Wright粉尘进样器；然而，这些装置均无法产生满足上述所有标准的纳米颗粒气溶胶5。

一种全身性纳米颗粒气溶胶吸入暴露系统被设计、验证并用于纳米TiO₂2 吸入毒理学研究。关键组分：1）新型纳米TiO₂2 气溶胶发生器；2）0.5 m3 全身吸入暴露舱；以及3）监测与控制系统。Nano-TiO2 由块状干燥纳米二氧化钛产生的气溶胶2 粉末（一次粒径为21 nm，振实密度为3.8 g/cm³）3) 以90 LPM（每小时10.8次空气交换）的流速送入暴露室。使用扫描电迁移粒径谱仪（SMPS）和电气低压冲击器（ELPI）连续测量颗粒物粒径分布和质量浓度谱。气溶胶质量浓度（C) 通过重量法验证（mg/m3）。质量（M所收集颗粒的质量被确定为 M = (M后- M预处理），其中 M预处理 和 M术后 采样前后滤膜的质量mg）。质量浓度计算公式为 C = M/(Q*t)， 其中 Q 采样流速（m3/分钟), 和 t 为采样时间（分钟）。腔室压力、温度、相对湿度（RH）、O2 和 CO2 浓度被持续监测和控制。纳米TiO₂2 使用扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线（EDX）分析采集在Nuclepore滤膜上的气溶胶。

综上所述，我们报道了生成并输送至暴露室的纳米颗粒气溶胶具有以下特性：1）稳定的质量浓度；2）均匀且无污染物的组分；3）稳定的粒径分布，在气溶胶生成过程中计数中值空气动力学直径为157 nm。该系统能够可靠且可重复地创建模拟职业、环境或家庭中暴露于工程纳米材料（ENM）气溶胶的测试环境。

方案

全身纳米颗粒吸入暴露的逐步操作流程如下所述。

注意：1）步骤1和3应在通风橱中进行；2）操作人员必须佩戴适当的个人防护装备（呼吸器、护目镜和橡胶手套）。

1. TiO的预处理2 纳米颗粒干粉

  1. 将纳米TiO2粉末置于不透明容器中。
  2. 保持容器盖子打开。
  3. 将容器放入干燥干燥器中，至少放置24小时进行预处理。

2. 预热数据采集与控制系统、SMPS、ELPI及所有传感器

  1. 打开空气监测和数据采集系统，以及气溶胶监测仪器SMPS（TSI Inc., Shoreview, MN）和ELPI（Dekati, Tampere, Finland）的电源开关，并预热系统至少1小时。
  2. 打开所有传感器的电源开关，并预热至少1小时。

3. 将TiO2纳米颗粒干粉装入气溶胶发生器

  1. 打开气溶胶发生器的筒盖，更换气溶胶发生器中的滤膜。注意：每个气溶胶发生器包含一个筒体。所需使用的气溶胶发生器数量取决于暴露舱内颗粒物的目标质量浓度。
  2. 称取约 4 g 纳米 TiO2 粉末，并将其装入每个筒体中。
  3. 重新安装筒盖。
  4. 所有可能受到 TiO2 污染的区域均应使用湿布擦拭。

4. 将气溶胶发生器连接至吸入暴露室

  1. 通过一个歧管将所有气溶胶发生器的出口连接至旋风分离器，旋风分离器位于吸入暴露室（TSE Systems GmbH，德国巴特洪堡）的入口处。
  2. 将压缩空气管路连接至气溶胶发生器中的文丘里分散器。

5. 将空气监测和气溶胶采样入口连接到吸入暴露舱

  1. 将 TSE Systems 公司提供的温度与相对湿度（RH）、压力、O2 和 CO2 传感器连接至吸入暴露舱的测试气氛监测端口。
  2. 将气溶胶稀释器的入口连接至吸入暴露舱的一个气溶胶采样端口，然后将其出口连接至 ELPI 的入口。
  3. 将 SMPS 连接至吸入暴露舱的一个气溶胶采样端口。
  4. 将颗粒物浓度监测仪（TSE Systems）的入口连接至暴露舱的一个气溶胶采样端口。
  5. 称量聚四氟乙烯（PTFE）膜滤膜（货号 66149，Pall 公司，美国密歇根州安娜堡），并将滤膜装入不锈钢滤膜夹具中（In-Tox 产品，美国新墨西哥州莫里亚蒂）。
  6. 将装有预称重滤膜的不锈钢滤膜夹具入口连接至吸入暴露舱的一个气溶胶采样端口，并将其出口连接至采样泵。

6. 启动数据采集系统

  1. 启动ELPI数据采集软件ELPIVI，检查设置参数，开启冲洗泵约5分钟，然后对ELPI进行归零校准。记录暴露前浓度。
  2. 启动SMPS数据采集软件。记录暴露前浓度。
  3. 启动软件Daco（TSE Systems），用于监测和控制气流流速、温度和相对湿度，以及反应室的压力、温度与相对湿度、O2和CO2。

7. 将实验动物装入吸入暴露室

  1. 称量实验动物。
  2. 标记实验动物及其笼具，以便在需要时可将动物放回原来的笼子中。
  3. 打开吸入暴露室的门，将实验动物放入金属网笼中。
  4. 可为动物提供饮水。
  5. 关闭并固定吸入暴露室的门。
  6. 通过暴露室的观察窗定期观察动物是否出现痛苦迹象。动物应保持放松并表现正常。若观察到呼吸急促或困难、外观异常、姿势异常或不动等情况，应立即停止暴露，取出动物并将其放回原有笼具，联系主管兽医和/或启动相应的机构动物护理与使用委员会程序。

注意： 操作人员在执行步骤 8.7、8.8 和 8.17 时必须佩戴个人防护装备。

8. 小型动物暴露于纳米颗粒气溶胶

  1. 打开吸入暴露室的排气真空泵。
  2. 运行数据采集软件， Daco，用于：a) 为暴露室提供过滤干燥的空气，b) 控制暴露室内的压力，以及 c) 采集暴露环境的数据，如压力、温度、相对湿度（RH）、O₂2 和 CO2.
  3. 在腔室压力中建立轻微负压（设定值 = -0.2 mbar）。
  4. 打开气溶胶发生器。
  5. 运行ELPI和SMPS数据采集软件，以持续监测吸入暴露舱内颗粒物的粒径及相对质量浓度。
  6. 当气溶胶浓度稳定时， 即 ELPI监测仪上的浓度曲线达到平台期（通常在气溶胶发生器运行20分钟后），设置采样时间（例如1小时），然后开启气溶胶采样泵，通过滤膜收集具有代表性的纳米颗粒样品。
  7. 达到采样时间后，取出滤膜，并用橡胶塞堵住采样口，以防止测试材料从暴露室中逸出。
  8. 称量滤膜，并按照上述方法计算暴露舱内的平均质量浓度。
  9. 如果平均浓度偏离目标浓度，需手动调节发生器中的气流，以确保达到目标浓度。
  10. 计算颗粒物在动物肺部的沉积量 D = C × Vm x t x Fr，其中 D 剂量 C = 测试物质的平均质量浓度， Vm分钟通气量, t = 曝光持续时间，以及 Fr = 被沉积或吸收的物质比例.
  11. 将滤膜盒中的滤膜更换为洁净的、预先称重的滤膜，并重复步骤 8.6 和 8.8。
  12. 根据暴露室中的实际质量浓度及动物肺部的目标颗粒沉积量，估算剩余暴露时间如下： t保持 = (D靶向的 - D) / (C x Vm x Fr），其中 t保持 = 保持曝光时间， D靶向的 = 靶向剂量, C = 测试物质的平均质量浓度， Vm 分钟通气量， Fr = 被沉积或吸收的物质比例。
  13. 关闭气溶胶发生器 t保持 达到。
  14. 在将动物从暴露舱中移出之前，用过滤空气冲洗吸入暴露舱，直至监测仪显示的颗粒物浓度接近暴露前舱内的颗粒物浓度。
  15. 关闭腔室排气真空泵。
  16. 停止数据采集软件 Daco.
  17. 暴露后，观察动物以确认呼吸和行为正常，并记录无其他研究相关并发症。若观察到鼻部分泌物、呼吸困难或任何其他动物福利相关并发症，应联系驻场兽医和/或启动相应的机构动物护理与使用委员会程序。
  18. 停止 ELPI 和 SMPS 数据采集软件。

9. 生成测试报告

9.1 测试条件包括

  1. 本试验所用气溶胶发生系统的描述及其操作参数。
  2. 暴露装置的描述，包括设计、类型、尺寸以及暴露过程中使用的工作参数。
  3. 用于测量温度、湿度、粒径和实际浓度的设备。
  4. 废气处理方式，以及在使用时动物在试验舱内的饲养方法。

9.2 暴露气氛数据包括

  1. 吸入设备中的气流流速。
  2. 空气的温度和湿度。
  3. 靠近动物笼具的气溶胶采样区域中的实际（分析或重量法）浓度。
  4. 颗粒物粒径分布，以及计算所得的计数中值空气动力学直径和几何标准偏差。
  5. 说明为何未能达到目标舱室浓度和/或颗粒大小（如适用），以及为符合指南中这些方面要求所采取的措施。

9.3 其他

  1. 应保持含有吸入设施的房间内为轻微负压，以防止测试物质逸出吸入暴露实验室。
  2. 每日清洁暴露室，以消除动物排泄物的影响。
  3. ELPI、SMPS 及其他仪器应根据用户手册进行清洁和校准。

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结果

吸入暴露研究通常涉及将实验动物置于已知且恒定的测试环境中，并使其暴露于特定浓度的测试物质中8,9。全身体吸入纳米颗粒暴露系统如图1所示。全身体暴露室在动态气流条件下运行，室内保持90 LPM的持续气流。该气流提供每小时10.8次空气交换，超过美国环境保护署（Environmental Protection Agency）对急性吸入暴露所要求的最低空气交换次数（10.0）7。进气端采用三级空气过滤系统，包括聚结过滤器、高效聚结过滤器和活性炭过滤器（Atlas Copco，瑞典），以去除空气中的水分、灰尘、油蒸气以及（碳氢化合物）气味。另设一套三级空气过滤系统，包括前置纸质过滤器、活性炭过滤器和高效微粒空气（HEPA）过滤器，用于保护排气质量流量控制器。根据西弗吉尼亚大学的要求，排气真空泵出口处采用由TSE Systems设计的四级空气过滤系统。暴露室可容纳8个由TSE Systems提供的不锈钢丝材质动物笼。暴露室内同时暴露的实验动物最大数量为16只大鼠或64只小鼠。实验动物总体积不超过暴露室容积的5%，以确保测试气氛的稳定性，此要求符合美国<...

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讨论

本文构建并描述了一套整体暴露式纳米颗粒气溶胶吸入暴露系统。该系统的功能已通过先进的纳米颗粒气溶胶表征技术进行了验证。借助一种新型的纳米颗粒气溶胶发生系统，该吸入暴露系统可为实验动物提供温度、湿度、气流和氧气含量相对稳定且受控的、特性明确且均匀的纳米颗粒气溶胶测试环境。该暴露系统特别适用于需要大量动物或长期暴露的实验研究。在此大型整体暴露舱中，实验动物可自由活动，舒适度较高，热应激被降至最低。该暴露系统的主要局限性在于实验动物完全处于暴露舱的气溶胶环境中，可能同时存在经口和经皮等其他暴露途径。此外，在整体暴露系统中，由于进气流量较大，需要消耗较大量的原始材料。例如，在本系统中，暴露舱体积为0.5 m3时，进气流量为90 LPM；而12通道的仅头部暴露吸入暴露系统的进气流量仅为12 LPM。因此，在规划吸入暴露实验时，必须考虑原始材料的成本及其可获得性。

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披露

本报告中的发现和结论仅代表作者观点，并不代表国家职业安全与健康研究所的立场。提及任何公司名称或产品，并不意味着美国国家职业安全卫生研究所（NIOSH）对此表示认可，也不表示其他替代产品不可获得，或在经过适当评估后无法替代。

致谢

列出致谢和资助来源。

NIH-ES015022 和 ES018274（TRN）

美国国家科学基金会合作协定 1003907（VCM）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
吸入暴露系统TSE Systems GmbH, Bad Homburg, Germany
空气监测系统TSE Systems GmbH, Bad Homburg, Germany
二氧化钛 Aeroxide P25Evonik, Germany
扫描迁移率粒径谱仪-3936L75TSI Inc., Shoreview, MN
低压电撞击器，标准 10 LPMDekati, Tampere, Finland
超微量天平，XP2UMETTLER TOLEDO, Switzerland
场发射扫描电子显微镜-S-4800Hitachi, Japan
能量色散X射线分析Princeton Gamma-Tech, Rocky Hill, N.J.
Nuclepore 聚碳酸酯滤膜Whatman, Clinton, PA
PTFE 膜滤器Pall corporation, Ann Arbor, Michigan

参考文献

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