本文描述了一种在大鼠中进行葡萄糖和脂肪乳剂慢性输注的实验方案。该模型可用于研究营养过剩对器官功能及生理参数的影响。
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摘要
摘要
长期暴露于过量营养物质被认为会影响多个器官和组织的功能，并促进与肥胖症及代谢综合征相关的多种并发症（包括2型糖尿病）的发生。为了研究高浓度葡萄糖和脂肪酸影响胰腺β细胞及胰岛素分泌的机制，我们建立了一种在大鼠中进行的长期营养物质输注模型。该操作包括：在全身麻醉下对右侧颈静脉和左侧颈动脉进行插管；给予7天恢复期；通过滑轮和配重系统将导管连接至输液泵，使动物可在笼内自由活动；随后持续输注葡萄糖和/或脂肪乳剂（Intralipid，一种大豆油乳剂，与肝素共同输注时可产生约80%不饱和脂肪酸与20%饱和脂肪酸的混合物）72小时。该模型具有多项优势，包括能够精确调控循环中葡萄糖和脂肪酸的目标浓度；可同时输注药理学化合物；以及相较于饮食诱导模型所需时间较短。该模型可用于探究营养物质诱导的多种器官功能障碍机制，并评估药物在此类条件下的有效性。
引言
循环中长期升高的葡萄糖和脂质水平被认为通过改变多种参与维持葡萄糖稳态的器官功能，从而促进2型糖尿病的发病机制，这些器官包括但不限于胰岛β细胞（详见文献1综述）。葡萄糖毒性假说认为，慢性高血糖会加重最初导致高血糖的β细胞功能缺陷，从而形成恶性循环，促使2型糖尿病患者的血糖控制进一步恶化。同样，糖脂毒性假说提出，葡萄糖和脂质水平的同时升高——这在2型糖尿病中常被观察到——对β细胞具有损害作用。
阐明长期营养过剩对胰腺β细胞功能产生有害作用的细胞与分子机制，是理解2型糖尿病发病机制的关键 1为此，已有大量研究探讨了长期营养过剩的机制 离体 在分离的朗格汉斯岛中 体外 在克隆的胰岛素分泌细胞系中。然而，将这些模型系统中获得的研究结果外推至完整生物体十分复杂，尤其是因为培养细胞或胰岛中所使用的脂肪酸浓度很少与β细胞周围循环中的实际水平相符 体内 2另一方面，营养过剩导致β细胞功能衰竭的机制已在糖尿病啮齿类动物模型中得到研究，典型例子如Zucker糖尿病肥胖大鼠。 3,4，沙鼠 Psammomys obesus 5 高脂饮食喂养的小鼠 6然而，这些模型具有内在的代谢异常特征，难以在更为可控且非长期慢性条件下对血糖和/或血脂水平进行干预。为了能够在正常动物体内于数天的时间范围内改变循环营养物质水平，我们建立了一种在正常大鼠中的慢性输注模型，该模型可使我们单独或联合研究脂质和葡萄糖对生理参数及功能的影响。 7,8.
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方案
概述：该操作包括在全身麻醉下对右侧颈静脉和左侧颈动脉进行插管；允许动物恢复7天；通过滑轮和配重系统将导管连接至泵，使动物在笼内可自由活动；随后输注葡萄糖和/或脂肪乳剂（一种大豆油乳剂，与肝素联合输注时可产生约80%不饱和脂肪酸和20%饱和脂肪酸的混合物9），持续72小时。
1. 右颈静脉和左颈动脉插管
- 对手术器械进行灭菌。插管导管也必须在手术前使用液体灭菌剂（2.6% 戊二醛）进行冷灭菌。将导管浸入已高压灭菌的容器中 16–24 小时。使用前用无菌蒸馏水充分冲洗和灌注，以彻底去除所有戊二醛残留。
- 称量大鼠体重以计算药物剂量：
卡洛芬 5 mg/kg：稀释 1/10 = 体重（g）× 0.001 ml 皮下注射（镇痛药）
格隆溴铵 0.01 mg/kg：稀释 1/10 = 体重（g）× 0.0012 ml 皮下注射（抗胆碱药） - 使用异氟烷和氧气对大鼠实施麻醉。
- 将大鼠俯卧放置，剃除耳后至肩部基底区域的毛发。然后将大鼠仰卧放置，剃除颈部下方至前肢区域的毛发。
- 用氯己定、酒精和碘伏对手术部位进行消毒处理，并给予药物。
- 将大鼠转移至手术区域。
- 采用无菌技术，使用连接于装有 5 U 肝素化生理盐水的 1 ml 注射器的 PE-50 插管，对右侧颈静脉和左侧颈总动脉进行插管。用 50 U 肝素化生理盐水冲洗插管，以防止恢复期间发生凝血。使用钝化的 23G 针头。每根插管用 23G 针帽封闭。
- 手术后，剪短下门齿约 2.5 mm，并将大鼠放入输注背心，以防止其咬损插管。
- 提供氧气（1 L/min，持续 10 分钟）以帮助清除异氟烷。
- 将大鼠置于加热笼中，直至完全清醒。
- 每种输注条件需操作四只大鼠，每次使用一只（表 1）。
2. 术后护理（术后治疗与导管连接）
- 术后第1天和第2天称量大鼠体重。
- 术后第1天皮下注射格隆溴铵两次，剂量为体重（g）× 0.00048 ml；术后第2天注射一次。
- 如有必要，可给予其他支持性治疗：补液、加热垫、湿粮饮食、氧疗、镇痛药、抗胆碱药。
- 术后第7天称量大鼠体重，用于计算输注速率。
- 使用固定装置和滑轮系统将每只大鼠连接至输注系统，滑轮安装在笼具顶部的格栅上 (图1)。
- 用5 U肝素化生理盐水冲洗导管以清除血凝块，再用50 U肝素化生理盐水冲洗一次以防止凝血。
- 让大鼠适应固定装置和滑轮系统至少24小时，然后开始输注。
3. 灌注
- 从每只大鼠的颈动脉抽取 0.15 ml 血液，并测量血糖浓度。冲洗颈静脉导管。使用 50 U 肝素化生理盐水防止每只大鼠两根导管内形成血栓。
- 将血液样本转移至含有 2% EDTA 的 0.5 ml 收集管中。以 10,000 rpm 离心 2 分钟，并将血浆在 -20 °C 下冷冻保存。
- 根据下述每种输注条件，为每只大鼠准备两个 60 ml 注射器。将注射器 1 置于泵的前部位置，注射器 2 置于泵的后部位置。
- 使用已灭菌的 Y 型连接器和 CO-EX T22 管路将每对溶液连接在一起。将注射器安装至 Harvard 33 双注射器泵上。
- 更换笼底垫料，并从笼顶格栅上移除所有食物。
- 称取 150 g 标准饲料，并放置于笼顶格栅上。
- 将注射器连接至笼顶格栅上的旋转连接器。正确冲洗注射器，以排除管路中残留的空气。
- 根据连接输注系统前测得的大鼠体重，计算输注流速。使用 Microsoft Excel 文件将葡萄糖输注速率（GIR）换算为 ml/h。
- 根据制造商设定，将泵设置为适用于 60 ml 注射器的流速。输入注射器 1（前部注射器）和注射器 2（后部注射器）各自的流速。
- 启动泵。
4. 监测
- 启动泵后，检查旋转接头或套管处是否有渗漏，输液管是否扭曲，并确认输液管内无气泡。
- 输注3小时后，采集血样以监测血糖水平；分别在输注6、24、48和72小时后重复采样。为预防起见，还应在输注30、34、54和60小时后监测血糖。可使用便携式血糖仪检测一滴全血中的血糖浓度。该方法可减少输注期间采血量，从而避免显著改变血容量和/或血细胞比容。
- 根据血糖值调整注射器1的输注速率，以维持血糖在220–250 mg/dL范围内。注射器2的输注速率在72小时输注期间保持不变，因游离脂肪酸浓度维持在1 mmol/L。
- 配对设置输注条件，使对照组动物接受的液体体积与实验组动物相等（表1）。
- 输注24小时后，更换笼底，并称量笼栅中剩余的食物量，将未食用的部分重新放回笼栅中。在48小时后重复该操作。
- 在72小时输注期间，根据需要每日补充注射器中的液体。
- 输注期间应持续观察大鼠是否出现炎症或不适症状，必要时给予适当护理。
5. 输注后安乐死
- 输注72小时后，通过静脉注射0.5 ml的氯胺酮/赛拉嗪混合液（氯胺酮182 mg/kg，赛拉嗪11.6 mg/kg，用0.9% NaCl按1:2稀释）对大鼠进行麻醉。
- 通过夹趾反射评估麻醉深度，必要时追加麻醉剂。
- 大鼠麻醉后，使用手术剪打开腹腔，通过主动脉或下腔静脉用注射器抽取10–15 ml血液以进行放血处死。
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结果
在经历手术的42只大鼠中，有5只在术后期间死亡，1只在输注过程中死亡，总体成功率为86%。最终接受输注的37只大鼠在手术前的平均体重为608±5 g，输注开始时的平均体重为588±6 g（均值±标准误；n=37；配对t检验，P<0.0001）。以下结果来自两个输注组：生理盐水组（SAL）和葡萄糖+脂肪乳剂组（GLU+IL）。图2A和2B分别显示了在72小时输注期间的血糖和游离脂肪酸水平。根据实验设计，通过定期检测并调整葡萄糖输注速率（GIR），在整个输注过程中将血糖水平维持在约220–250 mg/dl，如图3所示。啮齿类动物可通过增加内源性胰岛素分泌来有效代偿葡萄糖输注，因此，为了维持血糖水平相对稳定，必须在输注过程中逐步提高葡萄糖输注速率。尽管如此，血糖水平在输注末期仍呈下降趋势，如图2A所示。由于动物接受了热量营养物质的输注，其食物摄入量会自发减少（图4）。
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讨论
尽管先前已有许多研究采用持续输注葡萄糖（例如 10-15）或脂质（例如 16,17）的方法在啮齿类动物中进行实验，但据我们所知，同时输注这两种营养物质的方法此前仅在小鼠中报道过18。本文所介绍的慢性输注模型为研究营养过剩对大鼠多种生物学功能的影响提供了若干优势。首先，该模型不依赖遗传性肥胖的啮齿类动物，而人类常见的肥胖属于多基因性19，因此该模型的研究结果更可能适用于一般人群中营养过度摄入所产生效应的研究。其次，通过改变营养物质的种类和输注流速，该模型可实现对不同营养素（特别是糖类或脂肪）在不同循环浓度下作用效果的检测。第三，静脉给药途径允许在输注营养物质的同时共输注其他化合物或药物20。最后，该实验周期相对较短（72小时，而高脂饮食诱导模型需数周），在临床前研究中具有更高的成本效益和时间效率。
该模型也存在一些缺点和局限性。首先，与任何外科手术模型一样，需要经过高度训练且技术熟练的人员进行无菌手术操作。其次，如代表性结果部分所述，动物...
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披露
Vincent Poitout 是 Bêtagenex 公司的联合创始人，并从该公司获得了研究合同。Bêtagenex 是一家合同研究组织，将本文所述的输注模型作为商业服务提供。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（R01DK58096，授予 Vincent Poitout）资助。Vincent Poitout 担任加拿大糖尿病与胰岛β细胞功能研究讲席。Bader Zarrouki 获得了默克公司和礼来公司的博士后奖学金。Ghislaine Fontés 获得加拿大糖尿病协会博士后奖学金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 生理盐水 | BD | JB1324 | |
| 70% 葡萄糖 | McKesson | ||
| 20% 脂肪乳剂（Intralipid） | Fresenius Kabi | JB6023 | |
| Metricide（2.6% 戊二醛） | Metrex | 11-1401 | |
| 肝素钠 10,000 USP u/ml | PPC | ||
| 卡洛芬 | Metacam | ||
| 格隆溴铵 | Sandoz | ||
| 异氟烷 | Abbott | ||
| 2% 氯己定 | |||
| 70% 酒精 | |||
| 碘 | |||
| PE-50 导管 | BD | 427411 | |
| CO-EX T22 | Instech Solomon | BCOEX-T22 | |
| 22G 连接器 | Instech Solomon | SC22/15 | |
| 22G 旋转接头 | Instech Solomon | 375/22PS | |
| 22G Y型连接器 | Instech Solomon | ||
| 配重平衡臂 | Instech Solomon | CM375BP | |
| 23G 钝头针 | Instech Solomon | LS23 | |
| 23G 插管针 | Instech Solomon | SP23/12 | |
| 导管连接装置（12 英寸） | Lomir | RT12D | |
| 输注背心 | Lomir | RJ01, RJ02, RJ03, RJ04 | |
| （SM-XL） | |||
| 导管连接件 | Lomir | RS T1 | |
| 60 ml 注射器 | BD | 309653 | |
| 1 ml 注射器 | BD | 309602 |
参考文献
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