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从DNA折纸设计一种生物响应机器人

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DOI：

10.3791/50268

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2013年7月8日

 ,  , 
1Faculty of Life Sciences and the Institute for Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

本文内容

摘要

DNA折纸是一种通过编程DNA分子的自组装来制造精确纳米级结构的强有力方法。本文描述了如何利用DNA折纸技术设计一种能够感知生物信号并响应性地发生形状变化，进而实现特定效应的纳米机器人。

摘要

核酸具有惊人的多功能性。除了作为生物信息存储介质的天然功能1，它们还可用于并行计算2,3，识别并结合分子或细胞靶标4,5，催化化学反应6,7，并在生物系统中产生可计算的响应8,9。重要的是，核酸可被编程使其自组装形成二维（2D）和三维（3D）结构10-12，从而将上述所有卓越特性整合到单一的纳米机器人中，实现对生物信号的感知并触发预设的响应，以达到期望的生物学效应。

利用核酸构建形状最初由 Seeman 提出13，此后已通过多种技术实现了该构想的若干变体11,12,14,15。然而，其中最具意义的或许是 Rothemund 提出的方法，称为支架式 DNA 折纸术16。在该技术中，一条长的（>7,000 个碱基）单链 DNA“支架”在数百条短的互补链（称为“订书钉”）的引导下折叠成目标形状。折叠过程通过温度退火程序完成。该技术已成功用于创建多种二维结构，具有极高的精确性和稳定性。随后，DNA 折纸术也被拓展至三维结构17,18。

本文将重点介绍 Douglas 及其同事开发的 caDNAno 2.0 软件19。caDNAno 是一种功能强大且用户友好的计算机辅助设计（CAD）工具，能够实现具有多种功能的二维和三维 DNA 折纸结构的设计。该设计过程依赖于一套系统且精确的 DNA 结构抽象方案，使其相对简单高效。

本文中，我们展示了最近描述的一种DNA折纸纳米机器人（nanorobot）的设计20。该机器人之所以称为“机器人”，是因为它将感知与驱动功能相连接，以执行特定任务。我们解释了如何将多种感知机制整合到该结构中，以及如何将感知信号传递以产生预期效应。最后，我们使用Cando21对所设计结构的力学性能进行模拟。本文讨论的概念可适用于多种任务和应用场景。

方案

本文中我们将设计一种机器人，它能响应蛋白质P，使货物C可与选定靶细胞表面的受体结合。图1展示了该机器人。C可以是受体阻断药物、生长因子等，且必须存在一种化学方法将其连接至DNA寡核苷酸，同时不破坏其功能。该机器人具有两种状态：在非活性状态下，两个外部“唇”结构上的DNA门处于杂交状态，确保机器人保持闭合，从而将其内部装载的任何货物安全地封闭其中；当存在蛋白质P时，门可通过多种机制（如下所述）中的任意一种打开，使机器人开启并暴露货物。在设计结构时需考虑，机器人在闭合状态下必须具有足够的柔性以实现自我闭合，并在门打开时能够弹开至开放状态。对整合了热力学与力学组分的DNA结构进行行为建模较为困难，实际构建的结构可能需要经过若干轮迭代优化。尽管如此，本文仍聚焦于基于一个通用的工作模型进行设计过程，该模型可作为进一步研究的基础。

注意：

为了更全面地理解DNA折纸设计与折叠过程，我们强烈推荐阅读Douglas及其同事撰写的原始caDNAno论文19，该论文详细解释了设计界面中DNA的抽象表示方式，以及这种表示如何对应三维DNA结构的实际分子构型。该论文还附有两段视频教程，以非常清晰的方式介绍了caDNAno的表示方法和操作界面。此外，我们还建议阅读Dietz及其同事近期发表的论文，其中描述了折叠过程中的许多重要方面及详细实验方案，包括Cando分析工具21。

1. 下载并安装 caDNAno 2.0 和 Autodesk Maya 2012

注意：Autodesk 软件对学生和学术用途免费。以下说明包含在 Autodesk 上建立学术账户的步骤。

  1. 访问 http://students.autodesk.com/ 创建学术账户。收到账户设置邮件后，点击激活链接，并根据需要填写个人偏好信息。
  2. 从下载中心获取 Maya 2012 的免费版本。
  3. 在计算机上安装 Maya 2012。
  4. 在安装 caDNAno 2.0 之前，先运行一次 Maya 2012。
  5. 从 http://cadnano.org/ 下载并安装最新版本的 caDNAno 2.0。
  6. 启动 Maya 2012，图形用户界面右上角应出现 caDNAno 图标。点击该图标即可进入 caDNAno。

2. 勾勒期望的形状和支架链路径

  1. Maya 内 caDNAno 的设计界面包含 3 个面板 （图 2）：
    1. 顶部面板：晶格视图，用于初步勾勒形状。该面板支持双螺旋层级的操作，并提供形状的截面视图。
    2. 底部面板：编辑面板，支持单碱基层级的操作。
    3. 右侧面板：由 Maya 生成的形状实时 3D 模型
  2. 点击“蜂窝”图标。在顶部面板中，可通过向上和向下滚动鼠标滚轮分别实现对晶格的放大和缩小。
    caDNAno 支持两种可能的设计晶格：蜂窝状和方形；本文将使用蜂窝布局，尽管方形晶格通常也可使用22。
  3. 首先在左侧面板上绘制所需形状的截面。
    每个圆圈代表一个双链 DNA 螺旋。要选择构成形状的螺旋，只需单击其圆心 （图 3）。逐个螺旋继续选择，直到整个形状被勾勒完成。或者，也可以按住鼠标左键连续绘制形状的轮廓。任何操作均可通过点击“编辑”菜单中的“撤销”或使用键盘快捷键 CTRL+Z（PC）或 CMD+Z（Mac）来撤销。
    此时，所选螺旋将显示为黄色。同时，底部面板将显示由这些螺旋组成的形状的侧视图。底部面板中的螺旋编号与顶部面板中的编号保持一致。
  4. 观察底部面板。每个螺旋由两行方格表示：这两行代表双螺旋的两条链，每个方格代表一个碱基 （图 4）。
    橙色垂直条指示沿螺旋进行编辑操作的位置。沿网格的碱基位置以橙色条上方的数字显示。螺旋框架的默认长度为 42 个碱基。可通过点击编辑面板右上角的灰色箭头图标之一并选择延伸长度（以 21 的倍数增加，对应 DNA 螺旋的两个完整旋转，其中每转跨越 10.5 个碱基）来延长长度 （图 4）。网格将向所选箭头的方向延伸。
  5. 要绘制贯穿整个形状的实际支架链路径，请按下鼠标按钮，从第一个螺旋开始，连续经过所有螺旋，遵循第 2.3 节中最初选择的相同顺序。注意：
    1. 此次选择的螺旋颜色将变为橙色。
    2. 在底部面板中，支架链片段将在所选螺旋上自动绘制。
    3. 右侧面板将实时显示正在构建的形状的 3D 模型。此过程结束时，支架链路径的草图将自动绘制在底部面板中 （图 5）。
  6. 在支架路径所有最左侧边缘周围绘制一个矩形。注意，所选边缘将显示为红色 （图 6）。
  7. 通过将所选边缘作为整体拖动至网格左侧来延伸支架路径。对右侧边缘重复此过程，直到路径被适当延伸。注意，支架的延伸也会在右侧面板中延伸 3D 形状 （图 7）。
  8. 定位那些与其他部分隔离的支架路径部分，并将其连接。例如，在我们的形状中，螺旋 0–9 构成一个孤立部分。螺旋 9 需要连接到螺旋 12（注意：螺旋 9 和 10 在形状中[顶部面板]不相邻，因此无法直接连接）。
  9. 放大需要连接的链段，使用“选择”工具单击其中一条链上的任意一点。当单击蓝色支架片段上的任意位置时，螺旋之间会出现“桥接”图标，表示允许发生交叉的位置。在这些位置，相邻螺旋中的碱基直接相对，使得链可以在螺旋之间交叉而不会使 DNA 变形或扭曲。每个桥接图标旁边的数字表示其将交叉到的螺旋编号 （图 8）。
  10. 要创建交叉，左键单击所需的桥接图标。将生成一个支架交叉，意味着支架在此处从一个螺旋跨越到另一个螺旋 （图 9）。重复此过程，直到支架贯穿所有螺旋，形成一个跨越整个形状的闭合环路，不再存在与其他部分隔离的区域。
    注意：尽管在软件中交叉看似跨越一定距离，但实际上并不包含任何 DNA 碱基。物理上，交叉“桥接”仅包含 DNA 骨架中的一个磷酸基团，用于将来自相邻螺旋的两个碱基连接在一起。
  11. 在进入下一步之前，请确保整个支架连续不断，且没有任何部分与其他部分隔离。

3. 定义开启机制轴

所述机器人会响应特定的生物输入而展开，从而暴露其载荷。展开过程以类似外壳开合的方式进行，两个半部分（螺旋 0-29 构成一半，螺旋 30-61 构成另一半）围绕两个轴旋转。这两个轴由螺旋 29-30 和 61-0 之间的交叉点构成，这些交叉点是两个半部分之间唯一的连接点，且仅位于或靠近网格的左边缘。右边缘将包含门控链（下文讨论）。

  1. 擦除螺旋29-30之间已有的交叉连接。要擦除交叉连接，请点击任一链上的“拐点”。这将在原交叉位置的两条链上各留下一个切口。按住 SHIFT 键，然后依次点击每个切口以封闭这些切口。
  2. 在螺旋29-30之间创建一个新的交叉连接，位置应尽可能靠近网格左侧边缘 （图10）。
  3. 在螺旋61与0之间创建一个新的交叉连接，位置应尽可能靠近网格左侧边缘。

4. 定义有效载荷附着位点

完成支架链路径的绘制后，我们需要定义有效载荷的连接（装载）位点。装载位点实际上是作为单链“分支”从其螺旋结构向外延伸的短链。因此，必须精确定义分支在螺旋上的发生位置，以确保其朝向所需方向延伸。如果我们随意定义短链的延伸位置，装载位点可能会出现在机器人外侧，而非内侧。

为了确保引物仅向特定方向延伸，我们绘制一条额外的螺旋链，作为引物从主体结构定向分支的引导链。在延伸完所需的加载位点引物后，移除该引导螺旋链。

  1. 定义4个朝向机器人内部的装载位点。这些装载位点将从螺旋3、27、34和58分支而出。对于每个位点，在上方面板中单击紧邻这些螺旋且朝向内部一侧的螺旋 （图11）。这会将这些螺旋添加到底部面板的网格中。此时不要再次单击这些螺旋。

5. 添加和编辑订书针

  1. 点击“AutoStaple”。软件将自动添加不同颜色的 staple 序列 （图12）。 注意 右侧面板中已将 staples 添加至 3D 结构。底部和右侧面板中的 staple 颜色保持一致。此外，界面左下角有一个指示符，用于标识 staple。
    注意： 订书针序列不能过长、过短或呈环状。此处生成的大部分订书针序列不符合这些标准，需要进行编辑。编辑的第一步是自动完成的（见下一步）。
  2. 点击“AutoBreak”。将弹出一个对话框 （图 13），要求为此操作提供用户自定义参数：
    1. 目标长度（bp）：若可能，预计的片段长度
    2. 最小长度（bp）：允许的截短片段最小长度
    3. 最大长度（bp）：允许的切刻链最大长度
    4. 最小交叉距离（bp）：一条短链从其末端到一个交叉点，或两个交叉点之间所跨越的最少碱基对数目。
      使用默认参数，点击“确定”。软件将根据这些参数尽可能地拆分片段。 （图14）.
  3. 擦除螺旋29-30与61-0之间的所有支架链交叉点，以使这些螺旋能够分离并使机器人打开。擦除支架链交叉点可能导致部分支架链过短或结构不合理，因此需要进行一些手动编辑以修正这些问题。为正确完成此操作，请遵循以下章节中的说明。
    确保保留第3.2和3.3节中创建的支架交叉结构。
  4. 以左侧第29和第30条螺旋之间的第一个 staples 交叉（青色和黑色staples）为例 （图15）. 通过单击每个拐点或桥接点将其变为红色，然后按 DELETE 键，擦除该交叉点的两个桥接部分 （图 16）.
  5. 按住 SHIFT 键并点击螺旋 29 上两个支架链之间的切口，将这两个支架链连接起来。同样，将链 30 上的三个支架链与一个支架链连接起来 （图17）. 可通过单击支架的边缘并按需拖动，手动延长或缩短支架。注意不要将任何支架首尾相连形成环状。 图18 显示在完全编辑完连接链交叉后，第29-30号螺旋之间的间隙。对第0号和第61号螺旋重复此过程，并手动编辑每个螺旋中的所有连接链。
  6. 找到由粗线标出的 staples，这些 staples 需要进一步编辑。逐一检查并根据需要进行修正。例如，过短的 staples 可以删除 （图19） 或尽可能延长。

6. 创建加样位点和门控结构

  1. 在上方面板中第二次单击加载位点的螺旋，然后在下方面板中点击并拖动边缘，以延伸生成的支架链片段 （图20）。
  2. 通过将橙色垂直条放置在支架链的期望位置，覆盖左侧面板中的引导螺旋，按住 SHIFT 键并单击，手动为这些支架片段添加短链 （图21）。这将在每个螺旋上添加一个短链前体。
  3. 通过点击并拖动，将短链前体延伸至全长。
  4. 找到红色桥接图标，该图标表示引导链（例如螺旋62）与底盘（例如螺旋3）之间允许的交叉位置。
  5. 选择最方便的位置引入交叉并单击桥接图标 （图22）。理想的位置应使对底盘中现有短链的编辑最小化。
  6. 在引导螺旋（螺旋62）中，删除不属于加载位点的短链部分，并将参与部分缩短至所需长度。所需长度应既能确保对不同类型货物加载的特异性，又能提供足够的结合强度。通常，18个核苷酸长度的尾部即可满足要求。确保短链仍以细线绘制，否则需继续编辑直至满足该要求。
  7. 在底盘中，根据需要编辑已发生变化的短链。
  8. 擦除引导螺旋（螺旋62），仅保留短链的延伸部分。
  9. 对所有加载位点重复步骤6.4–6.8 （图23）。

7. 设计门控链

除了轴链之外，门链是唯一连接29-30和61-0螺旋的链。与轴链不同，门链并非交叉链，而是通过杂交形成一段双链区域，用作特定生物输入信号的感应元件。一旦门链双链被置换，整个机器人即可围绕轴链发生熵驱动的旋转并打开。

  1. 确定门链的合适位置。这些门链将位于第29、30、61和0号螺旋上。
  2. 例如，观察29-30门区域。在网格右侧有位于第29和第30号螺旋两侧的合适 staple 链，可用作门链。注意，它们朝向相反的方向。
  3. 点击其中一条潜在门链的末端，将其延伸至结构外部。如果该末端位于支架链交叉点上方，可通过在界面右上角的“可选”工具栏中关闭“Scaf”（支架），仅保留“Stap”（staple 链）可选，从而简化选择操作。
  4. 延伸两条 staple 链以形成门链。如有需要，可对 staple 链进行编辑（图24）。对第0和第61号螺旋的门链重复此操作。
    注意，目前其实际长度并不重要，因为在序列完成步骤中，传感器DNA（例如 适体）将替换门链的序列。

8. 选择支架序列

  1. 点击“Seq”工具。将光标放置在支架链的任意位置并点击。此时将弹出一个对话框，提示我们选择支架DNA的来源 (图25)。
  2. 选择来源DNA在很大程度上取决于机器人尺寸。例如，M13mp18 ssDNA（p7249）及其扩展衍生物（p7308等）通常被用于较大的DNA折纸结构，适用于支架链长度约为7 kb的情况。如果所设计结构的支架长度明显短于所选的来源DNA，则未与任何短链杂交的多余支架链将形成一条从折叠结构中伸出的单链DNA环。虽然较短的环通常不会造成明显问题，但长达数千碱基的环可能严重干扰机器人的折叠与功能。因此，选择与结构支架长度相匹配的DNA来源至关重要。

例如，如果折叠一个小型结构所需的支架链长度约为1600个碱基，远短于对话框中预设的来源序列，则可使用自定义序列作为支架。有多种来源可供考虑。例如，可使用特定的限制性内切酶对M13mp18进行消化，以产生所需长度的片段。该过程可在NebCutter中完成（http://tools.neb.com/NEBcutter2/），方法是将M13mp18序列（http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/dna_sequences_maps.asp?#.UAygyzFWomR）粘贴至NebCutter的输入窗口，并进行限制性酶切位点的定位分析。另一种选择是使用预先消化的单链DNA，例如New England Biolabs公司提供的phiX174病毒单链DNA HaeIII消化产物。

  1. 在对话框中，点击“M13mp18”。注意，所选的DNA序列已添加到底部面板的支架链和订书链中。

9. 将 staples 序列导出为电子表格

  1. 点击顶部工具栏中的“导出”按钮，为支架链列表选择一个目标文件名，然后点击“保存”。
  2. 找到目标 .csv 文件并打开。
  3. 电子表格中显示了支架链列表，可直接发送至DNA合成公司。前两列显示起始和终止坐标，括号外的数字表示螺旋编号，括号内的数字表示碱基位置。

10. 分配门控和上样序列

  1. 在订书钉序列列表中，您会注意到某些序列以一串问号“?????”开头或结尾。这些问号表示由于没有支架链与这些特定的订书钉区域杂交，因此无法为其分配互补序列。实际上，这些是我们为门控链和装载位点设计的延伸部分，因此现在需要手动为其分配序列。
  2. 门控链：
    1. 门控链决定了机器人从非活性状态切换到活性状态并释放其载荷所响应的生物输入类型。每条单个的双链DNA门控链可编码对一种（或多种）生物输入的响应，因此可以定义机器人激活所需的一组输入特征。
      在本示例中，我们假设触发机器人激活的生物信号是一种限制性内切酶，该酶的存在可能指示有感染性细菌的存在。
    2. 首先需要考虑的是，门控单链DNA在从螺旋结构分支出来后并不会立即发生杂交。若设计不当，可能会影响折叠过程中的杂交效率。因此，每个分支应以一段间隔序列开始。我们通常使用多聚胸腺嘧啶（poly-T）作为间隔序列，因为该序列具有良好的柔性。
    3. 我们还假设门控杂交区域的长度为20个碱基，并在其中央包含目标限制性酶切位点。
    4. 因此，门控序列可能如下所示：
      [Helix 29]-5'-.....TTTTTTTGTGAGTTxxxxxxGCTAGAG-3'
      [Helix 30]-3'-.....TTTTTTTCACTCAAxxxxxxCGATCTC-5'
      “…..”表示与支架链杂交的订书钉区域，因此已有确定序列，不应更改。
      随机双链“GTGAGTT”及其互补链确保限制性酶切位点不会部分暴露，并提供额外碱基以保证酶的有效切割。
      “x”表示限制性酶切位点。
      随机双链“GCTAGAG”及其互补链为酶高效作用提供了额外碱基，同时也确保门控链足够长，以保障机器人良好闭合。
      在选择限制性酶切位点作为目标之前，必须确保整个机器人结构、装载位点以及门控链其他部分不会被所选酶切割。在此分析中，NEBCutter的0切割列表（即不切割整个序列的酶）提示EagI（源自成团泛菌 Enterobacter Pantoea agglomerans）是一种潜在可用的酶，可用于指示肠杆菌类感染的存在。
    5. 此时门控序列如下所示（黄色标记EagI限制性酶切位点）：
      [Helix 29]-5'-.....TTTTTTTGTGAGTTCGGCCGGCTAGAG-3'
      [Helix 30]-3'-.....TTTTTTTCACTCAAGCCGGCCGATCTC-5'
      注意，此设计假设在酶切后，序列“GTGAGTTCGG”（Tm = 32 °C）不再具有足够的长度或热力学稳定性来维持机器人闭合状态。这一假设很可能需要通过实验进一步验证。
    6. 第二个门控链可以与第一个相同，此时机器人仅响应一种酶；也可以设计为不同的酶切位点，以提高机器人的特异性。可在同一条链上添加更多限制性酶切位点，从而增加机器人响应的复杂性和特异性。
  3. 装载位点：
    1. 装载位点可采用通用序列。或者，也可基于独特序列设计装载位点，虽然会降低模块化程度，但可更好地控制载荷的方向和比例（适用于不同类型载荷）。
    2. 最后，装载位点的寡核苷酸应包含一个化学功能基团，使其能够与任何载荷（如蛋白质、纳米颗粒等）共价连接。请确保根据订书钉链的方向，将该化学基团连接在正确的一端（5'或3'）。

11. 在 CANDO 中模拟结果

  1. 将作业保存为 .json 文件后，可上传至 CANDO 进行分析。CANDO 是一种基于有限元的 DNA 结构模拟方法，可用于估算其在溶液中的刚性和稳定性21。
  2. 访问 http://cando-dna-origami.org/
  3. 点击“提交 caDNAno 文件进行分析”，并填写所有必要信息。
  4. CANDO 中的分析通常需要 15–20 分钟。分析结束后，系统会发送电子邮件通知我们分析已完成，并提供下载模拟结果的链接 （图 26）。

12. 订购DNA并折叠机器人

当设计过程完成后，若 CANDO 分析显示对产物的预测结果令人满意，即可订购第 9-10 节生成的绑定位点链序列。通常情况下，绑定位点链无需特殊纯化；但建议对具有特殊用途的链序列（如门控链或加载位点）采用 HPLC 进行纯化。

DNA合成后的步骤，包括折叠、纯化及产物的评估，以及通过原子力显微镜（AFM）或透射电子显微镜（TEM）对折叠结构进行可视化观察，不在本文讨论范围之内，相关内容可参见先前的报道17,18,20,21。此处提供本研究设计的纳米机器的透射电子显微镜图像作为示例 （图27）。样品制备与染色步骤严格按照已有文献所述方法进行21。

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结果

图1-25 是 caDNAno 2.0 界面的截图，逐步展示了设计过程。首先勾勒出结构的横截面 （图3），随后自动添加支架链片段并完成整个支架链路径的构建 （图7）。接着，自动添加订书钉链 （图12），并根据用户自定义参数将其打断 （图14），再通过手动编辑使订书钉链适应器件的预期功能 （图15-18）。图23-24 描述了如何添加和编辑负载位点与门控链。最后，图27 展示了本设计模型的透射电子显微镜（TEM）图像。

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讨论

DNA折纸技术使我们能够在纳米尺度上精确制造具有任意特征的结构。下一步的重要进展是将功能整合到这些设计中。尽管该技术可应用于诸多领域并应对多种挑战，但人们尤其关注利用DNA折纸技术制造治疗性和科研用的纳米机器人，因为DNA本身所处的天然环境正适合此类应用。DNA在细胞中原本就作为遗传信息的存储介质，与分子机器相互作用。有趣的是，在纳米机器人或其他装置中折叠的DNA除了作为结构材料外，仍可充当遗传信息载体；当纳米机器人解体后，这些遗传信息可被传递并用于表达特定蛋白质，作为一系列输出反应中的组成部分。

在本文讨论的示例中，我们使用限制性内切酶来操控机器人。然而，DNA机器人响应输入信号的其他机制还包括以下几种。

分子识别：我们最近展示了基于适体门控的DNA机器人，可识别靶细胞表面的蛋白质分子20. 可筛选出适配体 体外 使用SELEX等方法23，从公司外包获得，或从适配体数据库中使用（

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 S. Douglas 提供的极为宝贵的讨论和建议，以及巴伊兰大学生命科学学院和纳米技术与先进材料研究所巴切莱特实验室所有成员的有益讨论和工作支持。本工作得到了巴伊兰大学生命科学学院及纳米技术与先进材料研究所资助项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Autodesk Maya 2012Autodesk需先创建学生/学术账户（参见 http://cadnano.org 中的平台特定说明）
caDNAno 2.0（软件）（开源）用于设计DNA折纸结构的软件 http://cadnano.org
Cando（网页）（开源）运行DNA折纸形状模拟器的网页 http://cando-dna-origami.org

参考文献

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