蛋白质的定位与分布为其细胞功能的研究提供了重要信息。电子显微镜（EM）具有较高的空间分辨率，可用于免疫组织化学后特定抗原亚细胞定位的确定。对于中枢神经系统（CNS）组织而言，在电子显微镜研究中同时保持结构完整性和抗原性尤为困难。本文采用一种已用于保存CNS中结构与抗原的方法，以研究和表征大鼠海马CA1区锥体神经元中的突触蛋白。
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本文内容
摘要
摘要
免疫电子显微镜技术是研究亚细胞水平生物分子的有力工具。与胶体金等电子致密标记物偶联的抗体可揭示特定抗原在各种组织中的定位与分布1。目前应用最广泛的两种技术是包埋前免疫标记法和包埋后免疫标记法。在包埋前免疫金标电子显微镜（EM）技术中，组织必须先进行通透处理，以允许抗体渗透，然后再进行包埋。这类方法在结构保存方面效果理想，但抗体渗透性差（通常仅前几微米）是一个显著缺点2。包埋后标记法则可避免这一问题，因为标记过程是在固定组织的切片上进行的，抗原更易接近。多年来，多种技术改进已显著优化了包埋后标记方法，提高了免疫反应性并更好地保留了超微结构3-5。
组织固定是电镜研究中的关键步骤。固定剂通过化学交联大分子，使组织结构得以稳定保存。固定剂的选择不仅影响结构的保存效果，还会影响抗原性和对比度。四氧化锇（OsO4）、甲醛和戊二醛数十年来一直是标准固定剂，尤其适用于在化学和物理处理过程中极易受损的中枢神经系统（CNS）组织。然而，OsO4反应性极强，已被证明会掩盖抗原6，导致标记效果差且不充分。为避免化学固定，替代方法包括组织冷冻。但这些技术操作困难，且需要昂贵的仪器设备。为解决上述部分问题并改善中枢神经系统组织的标记效果，Phend et al. 以醋酸铀（UA）和单宁酸（TA）替代四氧化锇（OsO4），并成功引入了其他改进措施，以提高脑和脊髓组织中抗原检测的敏感性和结构保存质量7。我们采用了这种无锇后包埋法处理大鼠脑组织，并优化了免疫胶体金标记技术，用于检测和研究突触蛋白。
本文介绍了一种用于确定大鼠海马CA1区锥体神经元中突触蛋白超微结构定位的方法。我们采用海马器官型培养切片，该切片可维持海马的三突触回路，因此特别适用于研究突触可塑性——这一机制被广泛认为是学习与记忆的基础。出生后第5至第6天的小鼠或大鼠海马组织可制备成器官型切片，方法如前所述8，此类切片特别适用于急性敲低或过表达外源性蛋白。我们此前已利用该方案对神经颗粒素（neurogranin, Ng）进行了表征，Ng是一种神经元特异性蛋白，在调控突触功能中具有关键作用8,9。我们也用该方法研究了钙调蛋白（calmodulin, CaM）以及钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（Ca2+/CaM-dependent protein kinase II, CaMKII）的超微结构定位10。如结果所示，该方案可良好保存树突棘的超微结构，并实现Ng的高效标记，有助于阐明其在树突棘内的分布特征8。此外，本文所述方法亦可广泛应用于研究参与神经元功能的其他多种蛋白。
方案
1. 固定
固定剂具有致癌性；操作时应佩戴手套，并在通风橱中处理固定剂。除非另有说明，所有孵育步骤均在冰上进行，所有溶液使用前均需过滤。请使用电子显微镜级别的试剂。
第1天
- 实验条件处理后（例如 病毒注射、药物处理）后，将带有海马体脑片的膜置于盛有冰冷的0.1 M磷酸盐缓冲液（Sorensen磷酸盐缓冲液，pH 7.3）的60 × 15 mm聚苯乙烯培养皿中。直接在脑片上方加入1–2 ml的0.1 M磷酸盐缓冲液，以保持其低温状态。
关键步骤：务必使用新鲜配制的缓冲液和固定剂。确保缓冲液的pH值处于所需范围内。若未做到这一点，可能会损伤细胞结构。
- 为分离切片中的CA1区，使用一次性手术刀在紧邻齿状回（DG）处沿CA1细胞层平行方向轻轻横向切割切片（图1）。随后垂直切割剩余切片，以去除CA3区和下托。可切去切片的一个角，以帮助识别组织的上表面。
注意：如果无需通过病毒递送目的蛋白，可在移除培养基后用预冷缓冲液轻轻冲洗，然后对整个组织切片进行固定....
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结果
图2B 展示了内源性Ng分子在海马CA1区锥体神经元树突棘中分布的一个示例。载有海马CA1区超薄组织切片（厚度60 nm，如图2A所示）的镍网先用1% T/PB和50 mM甘氨酸处理，随后用2.5% BSA和2.5%血清进行封闭，再与抗Ng抗体孵育。经T/PB洗涤后，将镍网置于连接有10 nm金颗粒的山羊抗兔二抗溶液中。最后，镍网再次用T/PB洗涤，并用2%戊二醛后固定，接着用2%醋酸铀和Reynold's柠檬酸铅染色以增强对比度。左图：代表性透射电镜图像，显示不对称型突触。突触后区可通过电子致密的突触后密度（PSD，箭头所示）以及清晰的质膜结构加以识别。右图：每个Ng分子（箭头所示）到质膜的最短距离被标准化为树突棘的半径。位于树突棘内（但不在PSD处）的Ng分子倾向于靠近质膜分布。该直方图最初发表于《EMBO杂志》8。
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讨论
在本实验方案中，我们采用了Phend和Weinberg的方法处理大鼠脑和脊髓组织，以研究海马脑片培养中的树突棘。海马CA3-CA1区的树突棘是精细的结构，含有多种蛋白质，在调控神经元功能中发挥重要作用。该方法在增强抗原性的同时，保持了良好的超微结构保存效果（图2A），实现了适度的标记效率和良好的可重复性，有助于表征特定抗原在树突棘内的分布情况。在此，我们使用10 nm胶体金标记了Ng，并对金颗粒进行定量分析，以生成Ng的标记模式，从而帮助理解其在突触功能中的作用（图2B）8。
免疫金标记的定量分析可通过多种方式进行11-13。然而，此类定量结果的解释并不总是直接明了。标记效率、金颗粒大小、样品处理过程中的变异以及不同样品间抗原数量的差异均可能影响金颗粒的定量结果。这些问题超出了本实验方案的范围，但已有若干综述对其中部分问题进行了探讨14-17。
在此方法中，以硫代乙酰胺（TA）、铀酰乙酸（UA）.......
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
作者感谢 Matthew Florence 在海马脑片培养制备方面的工作。本研究由美国国家衰老研究所和阿尔茨海默病协会的资助支持，资助对象为 NZG。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 60 x 15 mm 聚苯乙烯培养皿 | Falcon | 351007 | |
| 一次性手术刀 | EXELINT | 29552 | |
| 细胞培养小室 | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm 羊抗兔金标 | 电子显微镜科学公司 | 25108 | |
| 抗神经颗粒素抗体 | Millipore | AB5620 | |
| 100% 苦味酸 | 电子显微镜科学公司 | 19550 | |
| 96% 多聚甲醛 | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% 戊二醛（电镜级） | Sigma | G5882 | |
| 醋酸铀酰 | 电子显微镜科学公司 | 22400 | |
| 对苯二胺 | Sigma | P6001 | |
| 四氯化铂 | Sigma | 379840 | |
| 单宁酸 | 电子显微镜科学公司 | 21710 |
参考文献
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. His....
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