海马脑片培养中突触蛋白的包埋后免疫金标记

摘要

蛋白质的定位与分布为其细胞功能的研究提供了重要信息。电子显微镜（EM）具有较高的空间分辨率，可用于免疫组织化学后特定抗原亚细胞定位的确定。对于中枢神经系统（CNS）组织而言，在电子显微镜研究中同时保持结构完整性和抗原性尤为困难。本文采用一种已用于保存CNS中结构与抗原的方法，以研究和表征大鼠海马CA1区锥体神经元中的突触蛋白。

摘要

免疫电子显微镜技术是研究亚细胞水平生物分子的有力工具。与胶体金等电子致密标记物偶联的抗体可揭示特定抗原在各种组织中的定位与分布¹。目前应用最广泛的两种技术是包埋前免疫标记法和包埋后免疫标记法。在包埋前免疫金标电子显微镜（EM）技术中，组织必须先进行通透处理，以允许抗体渗透，然后再进行包埋。这类方法在结构保存方面效果理想，但抗体渗透性差（通常仅前几微米）是一个显著缺点²。包埋后标记法则可避免这一问题，因为标记过程是在固定组织的切片上进行的，抗原更易接近。多年来，多种技术改进已显著优化了包埋后标记方法，提高了免疫反应性并更好地保留了超微结构^3-5。

组织固定是电镜研究中的关键步骤。固定剂通过化学交联大分子，使组织结构得以稳定保存。固定剂的选择不仅影响结构的保存效果，还会影响抗原性和对比度。四氧化锇（OsO₄）、甲醛和戊二醛数十年来一直是标准固定剂，尤其适用于在化学和物理处理过程中极易受损的中枢神经系统（CNS）组织。然而，OsO₄反应性极强，已被证明会掩盖抗原⁶，导致标记效果差且不充分。为避免化学固定，替代方法包括组织冷冻。但这些技术操作困难，且需要昂贵的仪器设备。为解决上述部分问题并改善中枢神经系统组织的标记效果，Phend et al. 以醋酸铀（UA）和单宁酸（TA）替代四氧化锇（OsO₄），并成功引入了其他改进措施，以提高脑和脊髓组织中抗原检测的敏感性和结构保存质量⁷。我们采用了这种无锇后包埋法处理大鼠脑组织，并优化了免疫胶体金标记技术，用于检测和研究突触蛋白。

本文介绍了一种用于确定大鼠海马CA1区锥体神经元中突触蛋白超微结构定位的方法。我们采用海马器官型培养切片，该切片可维持海马的三突触回路，因此特别适用于研究突触可塑性——这一机制被广泛认为是学习与记忆的基础。出生后第5至第6天的小鼠或大鼠海马组织可制备成器官型切片，方法如前所述⁸，此类切片特别适用于急性敲低或过表达外源性蛋白。我们此前已利用该方案对神经颗粒素（neurogranin, Ng）进行了表征，Ng是一种神经元特异性蛋白，在调控突触功能中具有关键作用^8,9。我们也用该方法研究了钙调蛋白（calmodulin, CaM）以及钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（Ca²⁺/CaM-dependent protein kinase II, CaMKII）的超微结构定位¹⁰。如结果所示，该方案可良好保存树突棘的超微结构，并实现Ng的高效标记，有助于阐明其在树突棘内的分布特征⁸。此外，本文所述方法亦可广泛应用于研究参与神经元功能的其他多种蛋白。

方案

1. 固定

固定剂具有致癌性；操作时应佩戴手套，并在通风橱中处理固定剂。除非另有说明，所有孵育步骤均在冰上进行，所有溶液使用前均需过滤。请使用电子显微镜级别的试剂。

第1天

1. 实验条件处理后（例如 病毒注射、药物处理）后，将带有海马体脑片的膜置于盛有冰冷的0.1 M磷酸盐缓冲液（Sorensen磷酸盐缓冲液，pH 7.3）的60 × 15 mm聚苯乙烯培养皿中。直接在脑片上方加入1–2 ml的0.1 M磷酸盐缓冲液，以保持其低温状态。

关键步骤：务必使用新鲜配制的缓冲液和固定剂。确保缓冲液的pH值处于所需范围内。若未做到这一点，可能会损伤细胞结构。

2. 为分离切片中的CA1区，使用一次性手术刀在紧邻齿状回（DG）处沿CA1细胞层平行方向轻轻横向切割切片（图1）。随后垂直切割剩余切片，以去除CA3区和下托。可切去切片的一个角，以帮助识别组织的上表面。

注意：如果无需通过病毒递送目的蛋白，可在移除培养基后用预冷缓冲液轻轻冲洗，然后对整个组织切片进行固定，之后再切取CA1区。

关键步骤：请始终标记组织的上表面，以便后续对载网进行正确切片。

3. 使用手术刀背面小心地将组织从膜上取下。用巴氏吸管轻轻将组织转移至含有 0.1 M 磷酸盐缓冲液的 12 孔板中。
4. 吸去孔板中孔内的缓冲液，加入 500 μl - 1 ml 冰冷固定液（pH 7.3），固定液成分如下：0.1% 苦味酸、1% 多聚甲醛和 2.5% 戊二醛溶于 0.1 M 磷酸盐缓冲液中。在 4 °C 下孵育 2 小时。

注意：苦味酸在干燥时可能具有爆炸性。应将其用水润湿后置于密闭容器中保存。储存于干燥且通风良好的场所。

5. 从孔中移除固定剂，并用 0.1 M 磷酸缓冲液清洗样品 3 次，每次 20 分钟。
6. 在 0.1 M 马来酸盐缓冲液（pH 6.0）中含 1% 鞣酸（w/v）的溶液中孵育 40 分钟。
7. 用马来酸盐缓冲液冲洗两次，每次 20 分钟。
8. 在避光条件下，于马来酸盐缓冲液中含 1% 醋酸铀酰（w/v）的溶液中孵育 40 分钟。醋酸铀酰对光敏感且具有放射性。溶解时需用 Parafilm 封住烧杯，并将未用完的缓冲液避光保存于 4 °C。
9. 用马来酸盐缓冲液冲洗两次，每次 20 分钟。
10. 在含 0.5% 氯化铂（w/v）的马来酸盐缓冲液中孵育 20 分钟。
11. 用马来酸盐缓冲液冲洗两次，每次 20 分钟。将样品在 4 °C 保存，直至进行后续处理。

2. 脱水与包埋

环氧丙烷具有致癌性。操作时应在通风橱中进行，以避免接触其蒸气。使用无水、100%纯乙醇，确保不含任何水分。用此无水乙醇稀释，制备不同浓度用于脱水。

第2天

1. 在50%乙醇中孵育5分钟，然后在70%乙醇中孵育5分钟。
2. 在新配制的70%乙醇中含1% p-苯二胺（PPD）溶液中孵育15分钟。
3. 用70%乙醇冲洗三次。
4. 在80%乙醇中孵育5分钟，然后在95%乙醇中孵育5分钟。
5. 在100%乙醇中孵育两次，每次5分钟。
6. 准备带螺口盖的玻璃小瓶，并确保其清洁且完全干燥。将组织切片转移至玻璃小瓶中，并对每个小瓶进行简单清晰的标记。
7. 在1:1乙醇:丙烯酸氧化物溶液中孵育5分钟。
8. 在100%丙烯酸氧化物中孵育两次，每次5分钟。
9. 向每个小瓶中加入树脂（Epon），使其与丙烯酸氧化物形成1:1混合液，轻轻混合2小时。避免剧烈震荡小瓶，以防产生气泡而影响包埋效果。
10. 加入树脂，使其与丙烯酸氧化物形成3:1混合液，并混合2小时。
11. 转移至100%树脂中，过夜孵育。

第3天

12. 将样品夹在ACLAR塑料片之间，并在60 °C下固化24小时。

3. 切片与载网贴附

第4天

1. 切取半薄（0.5 μm）切片，用1%亚甲蓝和1%硼砂染色，以确定样品的正确取向。
2. 切取超薄切片（60 nm），并将切片转移至镍网上，每张镍网放置一个切片。

4. 免疫组织化学

所有缓冲液和水在使用前均应过滤。

第5天

1. 在平坦表面上的一块干净的Parafilm上滴加一滴（约50 μl）pH 7.5的1% Tween-20/磷酸盐缓冲液（T/PB）。用干净的镊子轻轻夹住铜网边缘，将铜网（切片面朝下）漂浮于缓冲液上，在室温下孵育10分钟。
2. 将铜网切片面朝上置于滤纸上，吸去多余液体，然后将其漂浮于含50 mM甘氨酸的T/PB中，在室温下孵育15分钟。

关键步骤：在孵育过程中，为避免溶液从一个液滴过多“携带”到下一个液滴，每次更换溶液后，应将载网边缘轻轻接触#1滤纸以沥去多余液体。同时，用一小条滤纸轻轻插入夹持载网的电镜镊子臂之间，吸除镊子臂间滞留的溶液，注意确保切片不会完全干燥。

3. 用滤纸将载网干燥，然后在含有2.5% BSA和2.5%次级抗体来源动物血清的T/PB溶液中室温下封闭30分钟。
4. 加入一抗（溶于T/PB中），在室温或4 °C过夜孵育。最佳孵育时间、温度以及抗体浓度需通过实验确定。
5. 用T/PB洗涤载网三次，每次2分钟。
6. 加入次级抗体（1:20稀释的与10 nm金颗粒偶联的抗兔或抗小鼠抗体），室温孵育1小时。
7. 用T/PB洗涤三次，每次2分钟。
8. 用含2%戊二醛的T/PB溶液在室温下后固定5分钟。
9. 先用T/PB洗涤三次，每次2分钟，再用过滤水洗涤三次，每次2分钟。
10. 用2%醋酸铀水溶液孵育10分钟。

在染色网格的同时，准备一个无 CO₂ 的培养室：将一块 Parafilm 放在玻璃培养皿中央，然后在培养皿中 Parafilm 周围放置 4–6 粒 NaOH 颗粒，以吸收空气中的 CO₂。将盖子盖上并静置数分钟。使用巴斯德移液管，迅速将少量雷诺氏柠檬酸铅溶液转移至玻璃培养皿中的 Parafilm 上。打开盖子的缝隙仅足以插入巴斯德移液管，以尽量减少 CO₂ 重新进入培养室。

注意：配制雷诺氏柠檬酸铅溶液时，将 100 ml 去离子水在微波炉中煮沸，然后在密闭容器中冷却。取一个带塞的 50 ml 容量瓶，加入 1.33 g 硝酸铅、1.76 g 柠檬酸钠和 30 ml 已煮沸的水，剧烈振荡 1 分钟，随后间歇振荡 30 分钟。向此浑浊溶液中加入 8 ml 1 M 氢氧化钠溶液，缓慢翻转容量瓶数次，溶液将变为澄清。用煮沸过的水将溶液定容至 50 ml。将溶液密封保存。若出现沉淀，则应弃去并重新配制。

11. 在三个较小的烧杯中准备温热的新鲜煮沸去离子水。将载网浸入第一个烧杯中，轻轻旋转30秒，以洗去醋酸铀酰。在其余两个烧杯中重复此步骤。
12. 打开玻璃培养皿盖至刚好能将载网放入柠檬酸铅（Reynold法）溶液液滴中。如有可能，操作时应佩戴口罩，避免呼出气体接触柠檬酸铅，防止沉淀形成。孵育10分钟。
13. 将培养皿盖打开至刚好能取出载网的程度，避免呼吸接触柠檬酸铅。依次将载网浸入盛有温热新鲜煮沸蒸馏水的三个烧杯中，清洗三次。将载网置于滤纸上，切面朝上，自然晾干。样品现可进行透射电子显微镜观察。

结果

图2B展示了内源性神经颗粒蛋白（Ng）分子在海马CA1区锥体神经元树突棘中分布的一个示例。将含有海马CA1区（如图2A所示）的超薄（60 nm）组织切片置于镍网上，先用1% T/PB和50 mM甘氨酸孵育，再用2.5% BSA和2.5%血清封闭，随后与抗Ng抗体孵育。经T/PB洗涤后，将镍网置于与10 nm金颗粒偶联的抗兔二抗中。最后，用T/PB洗涤镍网，并用2%戊二醛后固定，再经2%醋酸铀酰和Reynold's柠檬酸铅染色以增强对比度。左图，代表性电子显微照片显示不对称突触。突触后区的鉴定得益于电子致密的突触后致密区（PSD，箭头所示）以及清晰可见的质膜。右图，每个Ng分子（箭头）到质膜的最短距离被标准化为树突棘的半径。位于树突棘内（但不在PSD处）的Ng分子倾向于定位于质膜附近。该直方图最初发表于《EMBO杂志》⁸。

讨论

在本实验方案中，我们采用了Phend和Weinberg的方法处理大鼠脑和脊髓组织，以研究海马脑片培养中的树突棘。海马CA3-CA1区的树突棘是精细的结构，含有多种蛋白质，在调控神经元功能中发挥重要作用。该方法在增强抗原性的同时，保持了良好的超微结构保存效果（图2A），实现了适度的标记效率和良好的可重复性，有助于表征特定抗原在树突棘内的分布情况。在此，我们使用10 nm胶体金标记了Ng，并对金颗粒进行定量分析，以生成Ng的标记模式，从而帮助理解其在突触功能中的作用（图2B）⁸。

免疫金标记的定量分析可通过多种方式进行^11-13。然而，此类定量结果的解释并不总是直接明了。标记效率、金颗粒大小、样品处理过程中的变异以及不同样品间抗原数量的差异均可能影响金颗粒的定量结果。这些问题超出了本实验方案的范围，但已有若干综述对其中部分问题进行了探讨^14-17。

在此方法中，以硫代乙酰胺（TA）、铀酰乙酸（UA）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
60 x 15 mm 聚苯乙烯培养皿	Falcon	351007
一次性手术刀	EXELINT	29552
细胞培养小室	Millipore	PICM03050
10 nm 羊抗兔金标	电子显微镜科学公司	25108
抗神经颗粒素抗体	Millipore	AB5620
100% 苦味酸	电子显微镜科学公司	19550
96% 多聚甲醛	Acros Organics	AC41678-0030
25% 戊二醛（电镜级）	Sigma	G5882
醋酸铀酰	电子显微镜科学公司	22400
对苯二胺	Sigma	P6001
四氯化铂	Sigma	379840
单宁酸	电子显微镜科学公司	21710