用于生物医学植入物的石墨烯涂层

摘要

石墨烯作为生物医学植入物的涂层材料具有潜在应用价值。在本研究中，我们展示了一种在镍钛合金表面涂覆纳米级厚度石墨烯层的方法，并探究了石墨烯可能如何影响植入物的生物学反应。

摘要

原子级光滑的石墨烯作为表面涂层有望改善植入物性能。本文展示了一种在镍钛合金表面涂覆纳米级厚度石墨烯层的方法，适用于支架材料的应用。石墨烯在铜基底上生长 通过 采用化学气相沉积法在镍钛合金基底上生长石墨烯，随后将其转移至镍钛合金基底表面。为探究石墨烯涂层对生物学响应的影响，检测了大鼠主动脉内皮细胞和大鼠主动脉平滑肌细胞的细胞活力。此外，利用荧光共聚焦显微镜考察了石墨烯涂层对细胞黏附行为和形态的影响。细胞经肌动蛋白和细胞核染色后，原始镍钛合金样品与石墨烯涂层样品之间表现出明显差异。通过Western blot检测了大鼠主动脉平滑肌细胞的总肌动蛋白表达水平。采用凝胶电泳法测定血清白蛋白和纤维蛋白原的蛋白吸附特性，以评估潜在的血栓形成倾向。此外，利用拉曼光谱推断纤维蛋白原向基底的电荷转移情况。研究发现，镍钛合金基底上的石墨烯涂层满足支架材料的功能要求，并较未涂层镍钛合金改善了生物学响应。因此，石墨烯涂层镍钛合金是可用于支架材料的可行候选方案。

引言

过去三十年见证了基于新材料的疗法和用于疾病治疗与诊断的设备的发现。新型合金材料，如镍钛诺（NiTi）和不锈钢，因其优异的机械性能，常被用于生物医学植入物的制造。^1-3 然而，由于外源性材料的细胞毒性以及生物相容性和血液相容性问题，仍存在诸多挑战。这些合金的金属特性会导致金属离子溶出，当其与流动血液接触时（如导管、血管移植物、血管支架、人工心脏瓣膜），会引起细胞黏附性差、细胞增殖受限以及血栓形成，从而导致生物相容性和血液相容性不佳。 等等.). ^{1, 4, 5} 蛋白质或活细胞与植入物表面的相互作用可能引发强烈的免疫反应，继而触发一系列生物化学反应，进而对器械功能产生不利影响。因此，有效调控生物医学植入物与其周围生物环境之间的相互作用至关重要。通常采用表面改性技术来减少或防止由植入材料引发的不良生理反应。理想的表面涂层应具备高附着强度、化学惰性、高光滑度以及良好的血液相容性和生物相容性。此前，已有多种材料被研究用于此目的，包括类金刚石碳（DLC）、SiC、TiN、TiO₂₂ 许多聚合物材料已被测试作为生物相容性植入物表面涂层。 ^{1, 6-23} 然而，这些材料仍然无法满足合适植入物表面涂层的全部功能标准。

原子级厚度层的发现 sp² 碳的一种单原子层二维同素异形体，即石墨烯，为新型多功能材料的开发开辟了道路。由于石墨烯具有化学惰性、原子级光滑表面以及高度耐久性，被认为有望成为理想的植入体表面涂层材料。本研究探讨了石墨烯作为生物医学植入体表面涂层的可行性。研究结果表明，石墨烯涂层镍钛合金（Gr-NiTi）满足所有功能性标准，并能显著促进平滑肌细胞和内皮细胞的生长，从而实现更优的细胞增殖效果。此外，我们发现Gr-NiTi表面的血清白蛋白吸附量高于纤维蛋白原。尤为重要的是：（i）通过详细的光谱学测量证实，石墨烯与纤维蛋白原之间不存在明显的电荷转移，表明石墨烯涂层可抑制植入体引发的血小板活化；（ii）石墨烯涂层未表现出任何显著的 体外 对内皮细胞和平滑肌细胞系无毒性，证实其具有生物相容性；（iii）石墨烯涂层在流动血液环境中化学性质稳定、耐久且不渗透。这些血液相容性和生物相容性特性，结合高强度、化学惰性和耐久性，使石墨烯涂层成为理想的表面涂层。

方案

1. 镍钛合金的石墨烯涂层

1. 本研究中使用的石墨烯样品采用化学气相沉积法在铜（Cu）基底上生长，随后转移至4.5 mm²NiTi基底上。
2. 将铜箔（1 cm × 1 cm）置于1英寸石英管炉中，在50 sccm H₂和450 sccm Ar气氛下加热至1,000 °C。
3. 随后，在不同流速下向炉内通入甲烷（1和4 sccm），持续20–30分钟。最后在持续通入H₂、Ar和CH₄的条件下将样品冷却至室温。
4. 接着，将铜箔以4,000 rpm的转速旋涂PMMA（用4%苯甲醚稀释），并在150 °C下热处理5分钟。通过使用Transene Inc.的CE-100蚀刻剂腐蚀铜箔，并用10% HCl和去离子水冲洗10分钟，获得附着在PMMA层上的石墨烯。
5. 将样品转移至NiTi基底（4.5 mm²）上，并在Ar（300 sccm）和H₂（700 sccm）气氛中于450 °C退火2小时以去除PMMA。最后用丙酮清洗基底以溶解残留的PMMA，从而获得Gr-NiTi样品。所有Gr-NiTi样品的显微拉曼表征使用Dilor XY三光栅单色仪（采用100X物镜），激发光源为Ar⁺离子激光器的514.5 nm激光。

2. 体外 Gr-NiTi的毒性

大鼠主动脉内皮细胞（Cell Application Inc.）在经明胶包被的8孔载玻片上进行培养。为检测细胞生长情况，将未经处理的原始材料和Gr-NiT基底置于未经明胶包被的孔中。扫描电子显微镜图像使用日立S-4800型扫描电镜（SEM）获取。此外，大鼠主动脉平滑肌细胞作为对照组在CellBind 96孔板（Corning）中培养，培养基为杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium, ATCC）。

1. 为检测细胞活力，将细胞（包括内皮细胞和平滑肌细胞）以每孔10⁵个细胞的密度接种于含有原始NiTi、1 sccm或4 sccm Gr-NiTi基底的孔中，其中所述sccm值对应于化学气相沉积（CVD）生长石墨烯过程中所用的甲烷流量。细胞在37 °C、5% CO₂的培养箱中培养至所需时间，每隔一天更换一次培养基。
2. 在终点时间点，移除培养基，并向每孔加入含有0.5 mg/ml噻唑蓝四氮唑溴化物（或购自Sigma公司的MTT）的新鲜培养基。随后将细胞继续孵育3小时。对于MTS检测，在最终时间点移除培养基，替换为120 μl MTS工作液（Cell Tier 96 Aqueous, Promega），并孵育3小时。
3. 接着，轻柔移除培养基，并向每孔加入100 ml二甲基亚砜（Sigma）。待MTT结晶溶解10分钟后，将溶液转移至另一块孔板。对于MTS检测，无需向孔中添加二甲基亚砜，直接将孔内液体转移至新孔板中。
4. 在490 nm波长下测定吸光度，并通过将各孔吸光度归一化至原始NiTi样品的平均吸光度来计算细胞活力百分比。每种样品类型至少重复五次。

3. 细胞形态的共聚焦显微镜研究

1. 为进行大鼠主动脉平滑肌细胞的共聚焦成像，将基底材料置于8孔载玻片（Thermo Scientific）中。细胞以每孔25,000个细胞的密度接种，并在37 °C、5% CO₂条件下培养3天。
2. 用含4%甲醛的磷酸盐缓冲液固定细胞，固定时间为20分钟。
3. 用0.1% Triton-X处理细胞1分钟以进行透化。
4. 用Alexa Fluor 488鬼笔环肽（Life Technologies）对肌动蛋白进行染色。将200单位/毫升的Alexa Fluor 488鬼笔环肽100 μl加入1.9 ml磷酸盐缓冲液中。每孔加入250 μl染色液，染色45分钟后，用磷酸盐缓冲液洗涤两次。
5. 用含DAPI的VectaShield荧光封片剂（Vector Laboratories）封片以显示细胞核。使用Nikon共聚焦显微镜TI采集共聚焦图像。以未添加任何基底材料的细胞孔作为对照。

4. 蛋白质吸附研究

1. 在开始蛋白质吸附实验之前，使用卡尺测量基底的尺寸。对近似方形样品的每一边进行三次测量，并取平均值以获得长度和宽度。
2. 将每个样品（原始 NiTi、1sccm 和 4sccm Gr-NiTi）分别与 1 mg/ml 白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS）或 1 mg/ml 纤维蛋白原的 PBS 在室温下孵育 3 小时。
3. 将相似的样品与 200 μl 还原性上样缓冲液一起加入微量离心管中，并在沸水中加热 5 分钟。
4. 然后将样品用 Tris/Glycine/SDS 缓冲液（Bio-Rad）稀释，并在 4–15% Tris 聚丙烯酰胺电泳凝胶（Bio-Rad）中以 90 V 电压运行 100 分钟。
5. 随后用 SYPRO Red 对凝胶进行染色。将 SYPRO Red（Life Technologies）储存液用 7.5 v/v% 乙酸按 1:5,000 比例稀释，染色 60 分钟。
6. 使用 Flourchem SP（Alpha Innotech）成像凝胶。采用 ImageJ 软件对荧光强度进行定量分析。将每个样品的荧光强度根据基底总面积进行归一化处理，并比较纤维蛋白原吸附与白蛋白吸附的水平。

5. 蛋白质表达的蛋白质印迹分析

1. 通过 Western 印迹分析大鼠主动脉平滑肌细胞中的总肌动蛋白。将细胞以每孔 10,000 个细胞的密度接种于 96 孔板中。
2. 细胞培养三天后弃去培养基。使用RIPA缓冲液提取总蛋白，并采用标准BCA法（Lamda）测定总蛋白含量。
3. 样品用RIPA缓冲液稀释至相同浓度，然后在还原性上样缓冲液中煮沸5分钟。
4. 蛋白质通过4-15% Tris-聚丙烯酰胺凝胶进行分离 通过 以90 V电压电泳100分钟。使用Kaleidoscope蛋白标准品（Bio-Rad）测定蛋白质分子量。
5. 蛋白质被转移至PVDF膜，并用1%脱脂奶粉（Bio-Rad）溶液封闭。
6. 总肌动蛋白使用兔抗大鼠肌动蛋白抗体（Sigma）进行标记。一抗的检测采用BM化学发光试剂盒（Roche）。膜信号使用FlourChem SP成像设备采集，荧光强度通过ImageJ软件进行定量分析。荧光强度以未经处理的NiTi样品为基准进行归一化处理。

结果

图1. a) 在铜箔上通过化学气相沉积（CVD）生长的多晶石墨烯，其形貌仿照了金属晶粒结构（比例尺：10 μm）。b) 1 sccm（4 sccm）石墨烯的拉曼光谱显示出强（相对较弱）的G'峰，表明所制备的石墨烯为单层（少层）结构。c) 转移到NiTi基底上的石墨烯的原子力显微镜（AFM）图像显示其表面粗糙度约为5 nm。比例尺 = 500 nm。

图2. 平滑肌细胞在a)对照玻璃片、b)原始NiT...

讨论

生物相容性与细胞毒性： 化学气相沉积（CVD）方法制备出的多晶石墨烯样品模拟了铜晶粒的结构，如图1a所示。我们采用拉曼光谱确认了在1 sccm（4 sccm）样品上存在单层（少层）石墨烯（见图1b）。显然，1 sccm（4 sccm）样品表现出强烈（相对较弱）的G'峰，表明其为单层（少层）石墨烯。图1c展示了NiTi基底上少层石墨烯的原子力显微镜（AFM）图像。我们详细的测量结果显示，转移后的石墨烯层（Gr-NiTi）表面粗糙度R_q = 5 nm。众所周知，纳米结构的表面形貌会显著影响内皮细胞和平滑肌细胞的细胞形态及细胞骨架组装。这些细胞系会通过改变脂双层流动性来响应机械应力，这可能对蛋白质转位以及钙等激活因子进入细胞产生不利影响。更重要的是，细胞膜应力梯度的增加可改变细胞表面受体的构象和密度。为了研究石墨烯涂层对细胞应力梯度的影响，我们利用显微技术观察了平滑肌细胞和内皮细胞的形态。

如图2...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ATCC	30-2002
噻唑蓝四氮唑溴盐	Sigma-Aldrich	M2128
CellTiter 96 Aqueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒（MTS）	Promega	G3582
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D8418
36.5% 甲醛	Sigma-Aldrich	F8775
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Alexafluor 488 鬼笔环肽	Life Technologies	A12379
含 DAPI 的 VECTASHIELD 封片剂	Vector Laboratories	H-1200
人血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9511
人纤维蛋白原
Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	161-0732
Ready Gel Tris-HCl 凝胶	Bio-Rad	161-1158
乙酸	Sigma-Aldrich	45726
SYPRO Red	Life Technologies	S-6653
蛋白低浓度 BCA 检测试剂盒	Lamda Biotech	G1003
Precision Plus Protein Kaleidoscope 标准品	Bio-Rad	161-0375
Immun-Blot PVDF 膜	Bio-Rad	162-0177
Blotting grade blocker 脱脂奶粉	Bio-Rad	170-6404XTU
兔源抗肌动蛋白抗体	Sigma-Aldrich	A2066
BM 化学发光 Western Blot 试剂盒（小鼠/兔）	Roche Applied Science	11520709001
RIPA 缓冲液	Sigma-Aldrich	R0278
NiTi（51% Ni，49% Ti）	Alfa-Aesar	44953
设备
Horiba JobinYvon	拉曼光谱仪	Dilor XY 98
Nikon	共聚焦显微镜	Eclipse TI 显微镜
Thermoscientific	酶标仪
Bio-Rad	电源	164-5050	PowerPac basic 电源
Bio-Rad	电泳槽	165-8004	Mini-PROTEAN tetra 电泳槽
Bio-Rad	凝胶支架盒	170-3931	Mini 凝胶支架盒