用于生物医学植入物的石墨烯涂层

摘要

石墨烯作为生物医学植入物的涂层材料具有潜在应用价值。在本研究中，我们展示了一种在镍钛合金表面涂覆纳米级厚度石墨烯层的方法，并探究了石墨烯可能如何影响植入物的生物学反应。

摘要

原子级光滑的石墨烯作为表面涂层有望改善植入物性能。本文展示了一种在镍钛合金表面涂覆纳米级厚度石墨烯层的方法，适用于支架材料的应用。石墨烯在铜基底上生长 通过 采用化学气相沉积法在镍钛合金基底上生长石墨烯，随后将其转移至镍钛合金基底表面。为探究石墨烯涂层对生物学响应的影响，检测了大鼠主动脉内皮细胞和大鼠主动脉平滑肌细胞的细胞活力。此外，利用荧光共聚焦显微镜考察了石墨烯涂层对细胞黏附行为和形态的影响。细胞经肌动蛋白和细胞核染色后，原始镍钛合金样品与石墨烯涂层样品之间表现出明显差异。通过Western blot检测了大鼠主动脉平滑肌细胞的总肌动蛋白表达水平。采用凝胶电泳法测定血清白蛋白和纤维蛋白原的蛋白吸附特性，以评估潜在的血栓形成倾向。此外，利用拉曼光谱推断纤维蛋白原向基底的电荷转移情况。研究发现，镍钛合金基底上的石墨烯涂层满足支架材料的功能要求，并较未涂层镍钛合金改善了生物学响应。因此，石墨烯涂层镍钛合金是可用于支架材料的可行候选方案。

引言

过去三十年见证了基于新材料的疗法和用于疾病治疗与诊断的设备的发现。新型合金材料，如镍钛诺（NiTi）和不锈钢，因其优异的机械性能，常被用于生物医学植入物的制造。^1-3 然而，由于外源性材料的细胞毒性以及生物相容性和血液相容性问题，仍存在诸多挑战。这些合金的金属特性会导致金属离子溶出，当其与流动血液接触时（如导管、血管移植物、血管支架、人工心脏瓣膜），会引起细胞黏附性差、细胞增殖受限以及血栓形成，从而导致生物相容性和血液相容性不佳。 等等.). ^{1, 4, 5} 蛋白质或活细胞与植入物表面的相互作用可能引发强烈的免疫反应，继而触发一系列生物化学反应，进而对器械功能产生不利影响。因此，有效调控生物医学植入物与其周围生物环境之间的相互作用至关重要。通常采用表面改性技术来减少或防止由植入材料引发的不良生理反应。理想的表面涂层应具备高附着强度、化学惰性、高光滑度以及良好的血液相容性和生物相容性。此前，已有多种材料被研究用于此目的，包括类金刚石碳（DLC）、SiC、TiN、TiO₂₂ 许多聚合物材料已被测试作为生物相容性植入物表面涂层。 ^{1, 6-23} 然而，这些材料仍然无法满足合适植入物表面涂层的全部功能标准。

原子级厚度层的发现 sp² 碳的一种单原子层二维同素异形体，即石墨烯，为新型多功能材料的开发开辟了道路。由于石墨烯具有化学惰性、原子....

方案

1. 镍钛合金的石墨烯涂层

1. 本研究中使用的石墨烯样品采用化学气相沉积法在铜（Cu）基底上生长，随后转移至4.5 mm²NiTi基底上。
2. 将铜箔（1 cm × 1 cm）置于1英寸石英管炉中，在50 sccm H₂和450 sccm Ar气氛下加热至1,000 °C。
3. 随后，在不同流速下向炉内通入甲烷（1和4 sccm），持续20–30分钟。最后在持续通入H₂、Ar和CH₄的条件下将样品冷却至室温。
4. 接着，将铜箔以4,000 rpm的转速旋涂PMMA（用4%苯甲醚稀释），并在150 °C下热处理5分钟。通过使用Transene Inc.的CE-100蚀刻剂腐蚀铜箔，并用10% HCl和去离子水冲洗10分钟，获得附着在PMMA层上的石墨烯。
5. 将样品转移至NiTi基底（4.5 mm²）上，并在Ar（300 sccm）和H₂（700 sccm）气氛中于450 °C退火2小时以去除PMMA。最后用丙酮清洗基底以溶解残留的PMMA，从而获得Gr-NiTi样品。所有Gr-NiTi样品的显微拉曼表征使用Dilor XY三光栅单色仪（采用100X物镜），激发光源为Ar⁺离子激光器的514.5 nm激光。

结果

图 1. a) 在铜箔上通过化学气相沉积（CVD）生长的多晶石墨烯，其形貌模仿了金属晶粒结构（比例尺：10 μm）。b) 1 sccm（4 sccm）石墨烯的拉曼光谱显示出强（相对较弱）的 G' 峰，表明所制备的石墨烯为单层（少层）结构。c) 转移到 NiTi 上的石墨烯的原子力显微镜（AFM）图像显示其表面粗糙度约为 5 nm。比例尺 = 500 nm。

讨论

生物相容性与细胞毒性： 化学气相沉积（CVD）方法制备出的多晶石墨烯样品模拟了铜晶粒的结构，如图1a所示。我们采用拉曼光谱确认了在1 sccm（4 sccm）样品上存在单层（少层）石墨烯（见图1b）。显然，1 sccm（4 sccm）样品表现出强烈（相对较弱）的G'峰，表明其为单层（少层）石墨烯。图1c展示了NiTi基底上少层石墨烯的原子力显微镜（AFM）图像。我们详细的测量结果显示，转移后的石墨烯层（Gr-NiTi）表面粗糙度R_q = 5 nm。众所周知，纳米结构的表面形貌会显著影响内皮细胞和平滑肌细胞的细胞形态及细胞骨架组装。这些细胞系会通过改变脂双层流动性来响应机械应力，这可能对蛋白质转位以及钙等激活因子进入细胞产生不利影响。更重要的是，细胞膜应力梯度的增加可改变细胞表面受体的构象和密度。为了研究石墨烯涂层对细胞应力梯度的影响，我们利用显微技术观察了平滑肌细胞和内皮细胞的形态。

如图2.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ATCC	30-2002
噻唑蓝四氮唑溴盐	Sigma-Aldrich	M2128
CellTiter 96 Aqueous One 溶液细胞增殖检测试剂盒（MTS）	Promega	G3582
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D8418
36.5% 甲醛	Sigma-Aldrich	F8775
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Alexafluor 488 鬼笔环肽	Life Technologies	A12379
含 DAPI 的 VECTASHIELD 封片剂	Vector Laboratories	H-1200
人血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9511
人纤维蛋白原
Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	161-0732
Ready Gel Tris-HCl 凝胶	Bio-Rad	161-1158
乙酸	Sigma-Aldrich	45726
SYPRO Red	Life Technologies	S-6653
蛋白低浓度 BCA 检测试剂盒	Lamda Biotech	G1003
Precision Plus Protein Kaleidoscope 标准品	Bio-Rad	161-0375
Immun-Blot PVDF 膜	Bio-Rad	162-0177
Blotting grade blocker 脱脂奶粉	Bio-Rad	170-6404XTU
兔源抗肌动蛋白抗体	Sigma-Aldrich	A2066
BM 化学发光 Western Blot 试剂盒（小鼠/兔）	Roche Applied Science	11520709001
RIPA 缓冲液	Sigma-Aldrich	R0278
NiTi（51% Ni，49% Ti）	Alfa-Aesar	44953
设备
Horiba JobinYvon	拉曼光谱仪	Dilor XY 98
Nikon	共聚焦显微镜	Eclipse TI 显微镜
Thermoscientific	酶标仪
Bio-Rad	电源	164-5050	PowerPac basic 电源
Bio-Rad	电泳槽	165-8004	Mini-PROTEAN tetra 电泳槽
Bio-Rad	凝胶支架盒	170-3931	Mini 凝胶支架盒