高通量功能筛选：使用自制双发光荧光素酶检测法

摘要

我们介绍一种快速且低成本的筛选方法，通过高通量机器人转染和自制的双荧光素酶检测技术来鉴定转录调控因子。该方案可快速获得数千个基因的直接平行功能数据，并可轻松修改以靶向任何感兴趣的基因。

摘要

我们介绍了一种快速且低成本的高通量筛选方案，用于鉴定与帕金森病相关的α-突触核蛋白基因的转录调控因子。将293T细胞在96孔板中以每孔一个基因的形式，瞬时转染自阵列化ORF表达文库的质粒以及荧光素酶报告质粒。转染48小时后检测萤火虫荧光素酶活性，以评估文库中每个基因对α-突触核蛋白转录的影响，并以内部对照质粒（驱动Renilla荧光素酶表达的人巨细胞病毒hCMV启动子）的表达水平进行归一化。该方案由置于生物安全柜内的台式机器人完成，可在96孔板中执行无菌液体处理操作。我们的自动化转染流程可轻松适用于高通量慢病毒文库制备，或其他需要将大量独特文库质粒与一组共用辅助质粒进行三重共转染的功能筛选实验。此外，我们还提供了一种经济且经过验证的替代方案，取代商业化的双荧光素酶检测试剂，该方法利用PTC124、EDTA和焦磷酸盐在检测Renilla荧光素酶活性前抑制萤火虫荧光素酶活性。利用这些方法，我们筛选了7,670个人类基因，鉴定了68个α-突触核蛋白的调控因子。本方案易于修改，可用于靶向其他感兴趣的基因。

引言

识别关键遗传调控元件及其作用因子的能力对于探索多种生物过程至关重要。然而，在稀有细胞类型（如特定神经元群体）中鉴定调控基因表达的因子仍具挑战性。本文介绍了一种用于鉴定α-突触核蛋白（SNCA）新型转录调控因子的实验方案，SNCA 是一种与帕金森病相关、在中脑黑质致密部多巴胺能神经元中表达的基因。本方法采用高通量双荧光素酶报告系统， 体外 报告基因筛选用于解析293T细胞中α-突触核蛋白的表达。首先将α-突触核蛋白启动子克隆至含有萤光素酶基因的报告质粒中。使用一种市售质粒，其含有 海肾 在组成型活性启动子控制下的荧光素酶作为内参对照。这些报告基因载体与DNA表达文库中的质粒共同转染至96孔板中的293T细胞，使每个孔仅转染一种文库质粒。转染48小时后，使用双荧光发光检测法依次测定每个报告基因的荧光素酶活性。通过萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值，推断每种文库基因对α-突触核蛋白（alpha-synuclein）表达的相对调控作用。海肾 经基于孔板的标准化后，每孔的荧光素酶活性（F:R 比值）。

本方案能够以最少的人力（1-2人）和最低的成本（每块微孔板检测的试剂成本约为3美元），每周筛选大量基因（约2,500个），评估其激活报告基因表达的能力。该方法适用于筛选神经元基因的转录调控因子。例如α-突触核蛋白）在难以进行遗传操作的培养神经元中难以研究，而本直接功能检测方法可实现两者的并行比较。我们在本方案中提....

方案

有关实验概述，请参见图1。

1. 准备含有α-突触核蛋白启动子的报告质粒

α-突触核蛋白基因的调控元件（图2）跨度约为10 kb，从上游NACP（淀粉样肽的非Aβ组分）双核苷酸重复序列^1,2开始，延伸至内含子2³。我们在报告基因载体中包含了该区域的一部分。我们发现，含有内含子2的质粒需要采用特殊的培养方法，具体如下所述。荧光素酶质粒pGL4.10和pGL4.75（图3）可从Promega公司商业购得，并可使用常规分子生物学实验方案进行扩增。

1. 使用 表1 中的配方和 表2 中的引物，通过两轮独立的PCR分别扩增α-突触核蛋白启动子的2 个组分。
2. 在琼脂糖凝胶上验证PCR产物，并使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）进行纯化，用50 μl TE（Tris-EDTA）洗脱。将洗脱得到的0.9 kb片段于-20 °C保存以备后续使用。
3. 用SacI和XhoI酶切3.4 kb PCR片段的全部体积以及5 μg的pGL4.10质粒。用小牛肠碱性磷酸酶（Roche）处理载体，并使用PureLink Quick Gel Extraction....

结果

单个半板典型的荧光素酶值、F:R 比值及诱导值如图所示 图4注意 H2 孔中的阳性结果，为 32 倍诱导。导致毒性过强的基因（例如 E3 孔）或转染效果较差的孔，将导致萤光素酶和海肾荧光素酶的检测值均较低。 海肾 荧光素酶，但为平均诱导值。某些基因可能导致荧光素酶活性的非特异性诱导，或许 通过 与pGL4骨架的相互作用将诱导荧光素酶和 海肾 荧光素酶的表达水平相等，从而得到平均诱导值。若重复样本间的诱导值存在较大差异，则应怀疑实验操作中存在错误。重要的是要确认筛选实验在报告基因检测的线性范围内进行，以确保引起表达升高的克隆能够被准确反映为荧光素酶活性的增加。我们转染了不同浓度的每种报告基因，以验证在本实验条件下报告基因检测的线性关系。图5）。孵育步骤后也应尽快进行检测，以避免因底物耗尽导致的非线性结果。我们在加入试剂后1小时内均观察到显著的萤火虫荧光素酶活性。图6).

讨论

α-突触核蛋白作为路易小体的组成成分，已被证实与帕金森病（PD）相关⁴，而路易小体是该疾病的特征性细胞内包涵体。大量全基因组关联研究已将α-突触核蛋白基因中的单核苷酸多态性与散发性帕金森病风险升高相关联^5,6,7。尽管家族性帕金森病较散发性帕金森病少见，但其也可能由α-突触核蛋白基因的突变⁸，以及α-突触核蛋白基因位点的重复或三倍重复所引起^9,10,11，这一现象在散发性帕金森病中亦有发现¹²。综上所述，这些研究进一步强调了α-突触核蛋白在帕金森病发病机制中的核心作用。本项筛选的目的是鉴定调控α-突触核蛋白的基因，从而可能揭示其在帕金森病发病机制中的作用。利用本实验方案，我们对7,670个人类基因进行了筛选，初步鉴定出154个阳性候选基因（至少3倍诱导效应），对应140个独特的基因。这些候选基因随后使用新制备的DNA样本进行二次检测，以评估其可重复性。在后续的荧光素酶检测中，诱导倍数在3倍左右的候选基因可重复率为28%；而在4倍、5倍和5倍以上诱导的候选基因中，可重复率分别提高至59%、69%和78%。诱导效应超过7倍的候选基因.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
QIAQuick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28106
PureLink 快速凝胶回收试剂盒	Invitrogen	K2100-12
PureLink PCR 微量纯化试剂盒	Invitrogen	K310250
PureLinkHiPure 质粒小量提取试剂盒	Invitrogen	K2100-03
PureLinkHiPure 质粒大量提取试剂盒	Invitrogen	K2100-07
Bravo 机器人	Agilent	-
带滤芯的机器人移液吸头	Agilent	19477-022
不带滤芯的机器人移液吸头	Agilent	19477-002
透明底 96 孔板	Corning	3610
储液槽	Axygen	RES-SW96-HP-SI
聚苯乙烯 V 型底 96 孔板	Greiner	651101
聚丙烯 V 型底 96 孔板	Greiner	651201
粘性板盖	CryoStuff	#FS100
试剂
Phusion DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0530L
BAC 2002-D6	Invitrogen	2002-D6
小牛肠碱性磷酸酶	Roche	10713023001
T4 DNA 连接酶	New England Biolabs	M0202L
pGL4.10	Promega	E6651
pGL4.74	Promega	E6931
ElectroMAX Stbl4 感受态细胞	Invitrogen	11635-018
Subcloning Efficiency DH5α 感受态细胞	Invitrogen	18265-017
不含酚红的 DMEM	Invitrogen	31053-028
Optifect	Invitrogen	12579017
环丙沙星	CellGro	61-277-RF
Tris-盐酸粉末	Sigma	93287
Tris-碱粉末	Sigma	93286
Triton X-100 纯液体	Fisher	BP151-100
DTT	Invitrogen	15508-013
C–nzyme A	Nanolight	309
ATP	Sigma	A6419
荧光素	Invitrogen	L2912
h-CTZ	Nanolight	301
PTC124	SelleckBiochemicals	S6003