高通量功能筛选：使用自制双发光荧光素酶检测法

摘要

我们介绍一种快速且低成本的筛选方法，通过高通量机器人转染和自制的双荧光素酶检测技术来鉴定转录调控因子。该方案可快速获得数千个基因的直接平行功能数据，并可轻松修改以靶向任何感兴趣的基因。

摘要

我们介绍了一种快速且低成本的高通量筛选方案，用于鉴定与帕金森病相关的α-突触核蛋白基因的转录调控因子。将293T细胞在96孔板中以每孔一个基因的形式，瞬时转染自阵列化ORF表达文库的质粒以及荧光素酶报告质粒。转染48小时后检测萤火虫荧光素酶活性，以评估文库中每个基因对α-突触核蛋白转录的影响，并以内部对照质粒（驱动Renilla荧光素酶表达的人巨细胞病毒hCMV启动子）的表达水平进行归一化。该方案由置于生物安全柜内的台式机器人完成，可在96孔板中执行无菌液体处理操作。我们的自动化转染流程可轻松适用于高通量慢病毒文库制备，或其他需要将大量独特文库质粒与一组共用辅助质粒进行三重共转染的功能筛选实验。此外，我们还提供了一种经济且经过验证的替代方案，取代商业化的双荧光素酶检测试剂，该方法利用PTC124、EDTA和焦磷酸盐在检测Renilla荧光素酶活性前抑制萤火虫荧光素酶活性。利用这些方法，我们筛选了7,670个人类基因，鉴定了68个α-突触核蛋白的调控因子。本方案易于修改，可用于靶向其他感兴趣的基因。

引言

识别关键遗传调控元件及其作用因子的能力对于探索多种生物过程至关重要。然而，在稀有细胞类型（如特定神经元群体）中鉴定调控基因表达的因子仍具挑战性。本文介绍了一种用于鉴定α-突触核蛋白（SNCA）新型转录调控因子的实验方案，SNCA 是一种与帕金森病相关、在中脑黑质致密部多巴胺能神经元中表达的基因。本方法采用高通量双荧光素酶报告系统， 体外 报告基因筛选用于解析293T细胞中α-突触核蛋白的表达。首先将α-突触核蛋白启动子克隆至含有萤光素酶基因的报告质粒中。使用一种市售质粒，其含有 海肾 在组成型活性启动子控制下的荧光素酶作为内参对照。这些报告基因载体与DNA表达文库中的质粒共同转染至96孔板中的293T细胞，使每个孔仅转染一种文库质粒。转染48小时后，使用双荧光发光检测法依次测定每个报告基因的荧光素酶活性。通过萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比值，推断每种文库基因对α-突触核蛋白（alpha-synuclein）表达的相对调控作用。海肾 经基于孔板的标准化后，每孔的荧光素酶活性（F:R 比值）。

本方案能够以最少的人力（1-2人）和最低的成本（每块微孔板检测的试剂成本约为3美元），每周筛选大量基因（约2,500个），评估其激活报告基因表达的能力。该方法适用于筛选神经元基因的转录调控因子。例如α-突触核蛋白）在难以进行遗传操作的培养神经元中难以研究，而本直接功能检测方法可实现两者的并行比较。我们在本方案中提供了包含α-突触核蛋白启动子的质粒的克隆与培养的详细步骤，因为我们发现含有该区域的质粒在常规培养条件下不稳定（见讨论部分）。此外，我们还提供了一种低成本的替代方案，用于替代商业化的双荧光素酶检测试剂，适用于高通量检测。本方案可轻松调整，用于靶向其他感兴趣的调控元件，或适用于任何需要高通量瞬时转染的实验过程。

方案

有关实验概述，请参见图1。

1. 准备含有α-突触核蛋白启动子的报告质粒

α-突触核蛋白基因的调控元件（图2）跨度约为10 kb，从上游NACP（淀粉样肽的非Aβ组分）双核苷酸重复序列^1,2开始，延伸至内含子2³。我们在报告基因载体中包含了该区域的一部分。我们发现，含有内含子2的质粒需要采用特殊的培养方法，具体如下所述。荧光素酶质粒pGL4.10和pGL4.75（图3）可从Promega公司商业购得，并可使用常规分子生物学实验方案进行扩增。

1. 使用 表1 中的配方和 表2 中的引物，通过两轮独立的PCR分别扩增α-突触核蛋白启动子的2 个组分。
2. 在琼脂糖凝胶上验证PCR产物，并使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）进行纯化，用50 μl TE（Tris-EDTA）洗脱。将洗脱得到的0.9 kb片段于-20 °C保存以备后续使用。
3. 用SacI和XhoI酶切3.4 kb PCR片段的全部体积以及5 μg的pGL4.10质粒。用小牛肠碱性磷酸酶（Roche）处理载体，并使用PureLink Quick Gel Extraction试剂盒（Invitrogen）进行凝胶纯化。
4. 使用T4 DNA连接酶（NEB）将片段与载体连接。用PureLink PCR Micro试剂盒（Invitrogen）纯化连接反应产物，以10 μl TE缓冲液洗脱。
5. 取2 μl纯化后的连接反应产物，转入20 μl ElectroMAX Stbl4感受态细胞（Invitrogen）中，按照制造商说明进行电穿孔。在30 °C、225 rpm条件下振荡培养90分钟。取2 倍体积涂布于含100 mg/ml氨苄青霉素的LB平板，30 °C培养2 天。
6. 用牙签挑选4–6个单菌落，接种至2 ml TB（Terrific Broth）培养基中。在30 °C摇床中过夜培养。
7. 使用PureLink HiPure质粒小提试剂盒（Invitrogen），从各小提培养物的1.5 ml中提取质粒DNA。
8. 用BamHI酶切小提质粒，并在琼脂糖凝胶上进行电泳。正确克隆应产生2.8 kb和4.9 kb的片段。
9. 将正确克隆剩余的小提培养物在新鲜的LB（Luria Broth）平板上重新划线，30 °C培养2 天。
10. 挑选一个单菌落，接种至1.5 ml TB预培养液中，30 °C振荡过夜培养。注意预培养液不可达到饱和生长。
11. 将整个预培养液接种至150 ml预热的TB培养基中，30 °C振荡培养2 天。在进入下一步前，取1.5 ml该培养物进行额外的小提质粒及酶切验证，以确认克隆在复制过程中未发生突变。
12. 使用PureLink HiPure质粒大提试剂盒（Invitrogen）从剩余培养物中提取质粒DNA。该中间质粒的预期产量为每150 ml培养物50–150 μg。
13. 解冻第1.2步中保存的0.9 kb片段。重复步骤1.3至1.12，将0.9 kb片段克隆至中间质粒中，但酶切时改用KpnI和SacI。连接、转化、筛选并按前述方法培养以进行大提质粒。用BamHI酶切应产生5.8 kb和2.8 kb的片段。该质粒将用于后续筛选实验。

2. 准备293T细胞、报告质粒和文库DNA用于筛选

首先将293T细胞接种至96孔板中，并于次日进行转染。报告基因质粒和文库DNA被稀释后加入96孔板。我们所用的转染级文库DNA由麻省总医院DNA核心实验室提供（dnacore.mgh.harvard.edu）。本方案将单个文库DNA板转染至2 个相同的293T细胞板中（图1），因此每块待筛选的文库板需准备2 块细胞板。

注意：培养细胞时应使用不含酚红和抗生素的培养基，因为酚红会干扰荧光素酶检测，而抗生素会增加转染过程中的细胞毒性。

1. 对于每个待筛选的文库板，将胰蛋白酶消化后的293T细胞用含14%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基重悬，调整细胞浓度至1.5 × 10⁵ 个细胞/mL。倒入无菌储液槽（Axygen）中。
2. 将储液槽、2 个平底96孔板（Corning）以及一盒滤芯吸头（Agilent）放置于机器人工作台。向每块板的每个孔中加入100 μL细胞悬液，使每孔细胞密度为1.5 × 10⁴ 个细胞。
3. 以50 × g离心细胞板2分钟，使用低加速度升速模式，以确保各孔中细胞分布均匀。随后在37 °C、10% CO₂ 条件下过夜培养。
4. 将萤光素酶（firefly）和Renilla报告基因质粒用无血清培养基稀释至5 ng/μL。按体积比5:3将萤光素酶质粒与Renilla质粒混合，加入15 mL圆底离心管中。
5. 用移液器将混合后的质粒溶液加入96孔板的各孔中，每块文库板每孔加入17 μL，并额外多加2–10 μL作为余量。
6. 获取如上所述的转染级DNA文库板，用无内毒素水稀释至13.3 ng/μL。每孔最小体积应为28 μL。

3. 进行转染

第2天 将报告质粒和文库DNA转染至293T细胞中。

1. 对于每个文库板，在聚苯乙烯管中将107.5 μl RT Optifect（Invitrogen）与4.3 ml无血清培养基（1:40稀释）混合。室温孵育5分钟，然后将每块文库板44 μl的混合液分配至96孔聚苯乙烯V型底板（Greiner）的每个孔中。
2. 将稀释后的Optifect板、报告质粒（步骤2.5）、文库DNA（步骤2.6）以及一盒移液吸头放置于机器人操作台上。
3. 依次吸取17 μl报告质粒、43 μl稀释后的Optifect和26 μl文库DNA，每次吸取之间保留5 μl空气间隔。为防止交叉污染，应最后吸取文库DNA。将吸头中的内容物排入一个新的聚苯乙烯V型底板中，混匀，覆盖后静置20分钟，以形成脂质体/DNA复合物。若需转染多个文库板，则更换移液吸头和文库板，并重复上述操作。
4. 打开Optifect/DNA混合液板，将其与两块293T细胞板一同置于机器人操作台上。使用同一盒移液吸头，吸取80 μl Optifect:DNA混合液，并缓慢将40 μl分别加入每块细胞板中。若转染多个文库板，需对所有Optifect:DNA板重复此步骤。覆盖细胞板。
5. 将细胞板在1,200 x g条件下离心30分钟。覆盖后放回培养箱。
6. 继续孵育细胞4–6小时。在此期间，为每块转染的文库板配制新鲜培养基：将含10%胎牛血清和10 μg/ml环丙沙星（CellGro）的DMEM培养基12 ml混合均匀，并倒入无菌储液槽中。
7. 将2 盒机器人用吸头、一块细胞板、装有新鲜培养基的储液槽以及废液槽放置于机器人操作台上。从细胞中吸取100 μl旧培养基，排入预先装有部分70%乙醇的废液槽中。使用新的吸头吸取100 μl新鲜培养基，并缓慢加入细胞板中。对所有细胞板重复此操作。
8. 将细胞板放回培养箱继续孵育48小时。

4. 进行双荧光素酶检测

第4天 屏幕的火萤和 海肾 进行荧光素酶检测。

注意：双荧光素酶检测需要依次加入 2 检测缓冲液，3X 萤光素酶检测缓冲液和 3X 海肾 检测缓冲液，如所述 表3萤火虫和 海肾 荧光素酶不会被分泌，因此在检测荧光素酶活性前必须裂解细胞。萤火虫荧光素酶检测试剂缓冲液可裂解细胞并为萤火虫荧光素酶提供底物。 海肾 检测缓冲液可淬灭萤光素酶信号，并为后续反应提供底物 海肾 荧光素酶

1. 针对每块文库板，按照表3所述方法，从储备液中配制8 ml的3倍浓度萤光素酶检测缓冲液，并向每块96孔V型底板的每个孔中加入82 μl。
2. 针对每块文库板，同时配制12 ml的3倍浓度Renilla检测缓冲液，并向每块96孔V型底板的每个孔中加入122 μl。将萤光素酶和Renilla检测缓冲液分别放置备用。
3. 将一盒移液器吸头、废液槽以及2 块细胞板（来自同块文库板的转染细胞）放置于机器人操作台上。
4. 从每块细胞板中吸取60 μl培养基，并弃入装有部分70%乙醇的废液槽中。盖好细胞板并放置备用。若同时转染多个文库板，请对所有细胞板组重复此步骤。
5. 将2 盒移液器吸头、盛有3倍浓度萤光素酶检测缓冲液的板以及一组细胞板放置于机器人操作台上。
6. 吸取40 μl的3倍浓度萤光素酶检测缓冲液，加入第一块细胞板中，并充分混匀。更换新的吸头后，对第二块细胞板重复此操作。将细胞板在室温下放置10分钟，以完成细胞裂解。若同时转染多个文库板，请更换吸头盒和细胞板，并重复上述步骤。
7. 使用化学发光仪记录每块细胞板各孔的发光信号，每孔记录1秒。记录完成后将细胞板放回机器人操作台。
8. 将2 盒移液器吸头、盛有3倍浓度Renilla检测缓冲液的板以及一组细胞板放置于机器人操作台上。
9. 吸取60 μl的3倍浓度Renilla检测缓冲液，加入第一块细胞板中，并充分混匀。更换新的一盒移液器吸头后，对第二块细胞板重复此操作。若同时转染多个文库板，请对所有细胞板组重复此步骤。
10. 如前所述，使用化学发光仪记录所有细胞板各孔的发光信号，每孔记录1秒。随后弃去细胞板。

5. 数据分析

1. 计算萤光素酶：海肾 发光比值（"F:R 比值"每个孔的荧光素酶信号计数除以海肾荧光素酶信号计数 海肾 信号
2. 通过将每孔的 F:R 比值除以该酶标板的平均 F:R 比值（排除最高和最低 25% 的孔）来计算诱导值。
3. 对单个转染文库板的重复样本中的诱导值取平均值。将诱导或抑制α-突触核蛋白表达超过三倍的基因视为 "命中" 在此筛选中被识别，需进一步验证和进行二次筛选。

结果

单个半板的典型荧光素酶值、F:R 比值及诱导值如图所示 图4注意H2孔中的阳性信号，为32倍诱导。导致毒性过强的基因（例如E3孔）或转染效果较差的孔，其萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的检测值均会偏低。 海肾 荧光素酶，但为平均诱导值。某些基因可能导致荧光素酶活性的非特异性诱导，或许 通过 与pGL4载体骨架相互作用，将诱导荧光素酶和 海肾 荧光素酶的表达水平保持一致，从而获得平均诱导值。若重复样本间的诱导值存在较大差异，则应怀疑实验操作中存在错误。必须验证筛选实验是在报告基因检测的线性范围内进行的，以确保引起表达升高的克隆能够被准确反映为荧光素酶活性的增加。我们转染了不同浓度的每种报告基因，以验证在本实验条件下报告基因检测的线性关系。图5）。孵育步骤后也应尽快进行检测，以避免因底物耗尽导致的非线性结果。我们在加入试剂后1小时内均观察到显著的萤火虫荧光素酶活性（图6).

讨论

α-突触核蛋白作为路易小体的组成成分，已被证实与帕金森病（PD）相关⁴，而路易小体是该疾病的特征性细胞内包涵体。大量全基因组关联研究已将α-突触核蛋白基因中的单核苷酸多态性与散发性帕金森病风险升高相关联^5,6,7。尽管家族性帕金森病较散发性帕金森病少见，但其也可能由α-突触核蛋白基因的突变⁸，以及α-突触核蛋白基因位点的重复或三倍重复所引起^9,10,11，这一现象在散发性帕金森病中亦有发现¹²。综上所述，这些研究进一步强调了α-突触核蛋白在帕金森病发病机制中的核心作用。本项筛选的目的是鉴定调控α-突触核蛋白的基因，从而可能揭示其在帕金森病发病机制中的作用。利用本实验方案，我们对7,670个人类基因进行了筛选，初步鉴定出154个阳性候选基因（至少3倍诱导效应），对应140个独特的基因。这些候选基因随后使用新制备的DNA样本进行二次检测，以评估其可重复性。在后续的荧光素酶检测中，诱导倍数在3倍左右的候选基因可重复率为28%；而在4倍、5倍和5倍以上诱导的候选基因中，可重复率分别提高至59%、69%和78%。诱导效应超过7倍的候选基因...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
QIAQuick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28106
PureLink 快速凝胶回收试剂盒	Invitrogen	K2100-12
PureLink PCR 微量纯化试剂盒	Invitrogen	K310250
PureLinkHiPure 质粒小量提取试剂盒	Invitrogen	K2100-03
PureLinkHiPure 质粒大量提取试剂盒	Invitrogen	K2100-07
Bravo 机器人	Agilent	-
带滤芯的机器人移液吸头	Agilent	19477-022
不带滤芯的机器人移液吸头	Agilent	19477-002
透明底 96 孔板	Corning	3610
储液槽	Axygen	RES-SW96-HP-SI
聚苯乙烯 V 型底 96 孔板	Greiner	651101
聚丙烯 V 型底 96 孔板	Greiner	651201
粘性板盖	CryoStuff	#FS100
试剂
Phusion DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0530L
BAC 2002-D6	Invitrogen	2002-D6
小牛肠碱性磷酸酶	Roche	10713023001
T4 DNA 连接酶	New England Biolabs	M0202L
pGL4.10	Promega	E6651
pGL4.74	Promega	E6931
ElectroMAX Stbl4 感受态细胞	Invitrogen	11635-018
Subcloning Efficiency DH5α 感受态细胞	Invitrogen	18265-017
不含酚红的 DMEM	Invitrogen	31053-028
Optifect	Invitrogen	12579017
环丙沙星	CellGro	61-277-RF
Tris-盐酸粉末	Sigma	93287
Tris-碱粉末	Sigma	93286
Triton X-100 纯液体	Fisher	BP151-100
DTT	Invitrogen	15508-013
C–nzyme A	Nanolight	309
ATP	Sigma	A6419
荧光素	Invitrogen	L2912
h-CTZ	Nanolight	301
PTC124	SelleckBiochemicals	S6003