通过微接触印刷技术生成取向功能性心肌组织

摘要

生成排列整齐的心肌组织是将干细胞生物学的最新进展应用于临床实用目的的关键要求。本文中，我们描述了一种微接触印刷技术，可精确控制细胞形态与功能。利用高度纯化的胚胎干细胞来源的心脏前体细胞，我们进而生成了各向异性的功能性心肌组织。

摘要

晚期心力衰竭是一种主要的未被满足的临床挑战，源于有活力和/或功能完整的心肌细胞的丧失。尽管已有最佳药物治疗，心力衰竭仍是发达国家中导致死亡和疾病负担的主要原因。在药物研发中，一个主要挑战在于鉴定能够准确模拟正常与病变人心肌生理的细胞检测方法。 体外同样，再生心脏生物学面临的主要挑战集中在临床相关数量下，识别并分离患者特异性的心脏前体细胞。随后，这些细胞需要被组装成功能性组织，以模拟天然心脏组织的结构。. 微接触印刷技术能够创建出精确的微图案化蛋白质结构，这些结构类似于心脏的组织架构，从而为空间控制细胞黏附提供几何学线索。本文中，我们描述了一种从多能干细胞分化过程中分离高纯度心肌细胞的方法 体外细胞生长表面的微图形化制备，该表面经细胞外基质蛋白修饰，以及由干细胞衍生的心肌细胞组装成各向异性的心肌组织。

引言

尽管医学治疗取得了近期进展，晚期心力衰竭仍然是发达国家发病率和死亡率的主要原因。该临床综合征源于功能性心肌组织的丧失，进而导致衰竭的心脏无法满足患者的代谢需求。由于心脏的再生能力有限，自体心脏移植是目前唯一被临床认可、旨在补充丧失的功能性心肌组织的治疗方法。然而，心脏移植存在诸多显著局限，包括供体心脏数量有限以及需要长期免疫抑制治疗，因而限制了该疗法的广泛应用。因此，药物治疗仍是心脏病患者的主要治疗手段。在药物研发过程中，一个重大挑战在于鉴定能够准确模拟正常和病变心肌生理状态的细胞检测方法。 体外.

干细胞生物学与组织工程技术的最新融合为心脏再生开辟了新的前景。利用可再生的患者特异性来源生成具有功能的心肌组织将是该领域的一项重大进展。这将有助于开发针对药物研发与发现的疾病特异性细胞检测方法，并为心脏再生医学奠定基础。人类胚胎干细胞（ES细胞）以及更为重要的人类诱导多能干细胞（iPS细胞）代表着一种潜在的、可再生的患者特异性心室前体细胞及成熟心室肌细胞来源。结合干细胞生物学与组织工程策略，有望实现功能性心肌组织的构建 体外 可用于药物发现的细胞检测方法开发，或用于治疗晚期心力衰竭的心脏再生策略。

心脏再生领域的一个核心挑战是确定一种最佳的细胞类型。已有大量不同类型的细胞被研究¹然而迄今为止，尽管已发现来自不同来源的多种多能心脏前体细胞，但尚未明确一种能够满足关键要求的细胞来源，例如具有向肌源性细胞命运分化的特性，同时维持扩增能力 体内 或 体外 且构建出具有功能性的心肌组织已被证明是一个核心难题²我们此前描述了一种双转基因小鼠系统，该系统能够从正在分化的胚胎干细胞中分离出高度纯化的已定型心室前体细胞（CVP）群体 体外我们构建了一种新型的双转基因小鼠，该小鼠在MEF2c基因的Isl1依赖性增强子调控下表达红色荧光蛋白dsRed，并在心脏特异性Nkx2.5增强子调控下表达增强型绿色荧光蛋白。基于这一双色荧光报告系统，可通过荧光激活细胞分选（FACS）技术，根据MEF2c和Nkx2.5基因的表达情况，从发育中的胚胎干细胞中分离出第一和第二心区前体细胞。CVP在心肌标志物的表达模式以及结构和功能特性方面均类似于心肌细胞。³在心脏组织再生方面具有广阔的应用前景。

尽管组织工程领域已取得诸多进展，模拟天然细胞结构仍是关键挑战。解决这一挑战的传统方法包括将细胞接种于生物性或合成支架上 体外由于支架存在诸多缺点，包括降解过快、物理和机械稳定性有限以及细胞密度较低^1,4,5 我们尝试构建无支架的组织。尽管心肌细胞可通过分泌细胞外基质蛋白来修饰其局部微环境，但在缺乏细胞外信号提示的情况下，它们自主排列为杆状心肌细胞的能力较为有限。因此，需要一种能够为细胞提供适当空间和生物学信号的模板，以形成具有功能的心肌组织。微接触印刷技术通过提供一种简单且经济的方法，可精确控制细胞的形态、排列和功能，从而应对这一挑战。^6-8，这些因素对于生成取向排列的功能性心肌组织至关重要。该方法采用微结构化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章，其特征尺寸可小至2 μm⁹ 可在PDMS基底上以精确图案沉积细胞外基质蛋白，从而在空间上调控细胞黏附。

本文中，我们提出将组织生物工程技术与干细胞生物学相结合，以构建各向异性的功能性心肌组织。为此，我们在此展示我们近期发表的方法，具体包括以下步骤：（1）通过微接触印刷技术在PDMS基底上制备微图案化蛋白表面，从而形成用于定向心肌组织生长的模板；（2）从正在分化的小鼠胚胎干细胞中分离高纯度的心脏前体细胞 体外以及（3）结合这两种技术以生成取向排列的功能性心肌组织。

方案

生成取向功能性心肌组织的方案可分为三个主要部分。使用软光刻技术制备微图案化模板不属于以下方案的内容，但可根据已建立的方法进行制备⁶。

1. 将纤连蛋白微接触印刷至PDMS基底

1. 按10:1的基料与固化剂比例混合Sylgard 184（Dow Corning）PDMS弹性体，并使用真空干燥器脱气以去除所有气泡。
2. 将PDMS置于先前制备的模具上固化，该模具具有20 μm宽、2 μm高、间距为20 μm的脊状结构，在室温下固化2天或在65 °C下固化4小时，以获得微结构化的PDMS印章。

* 建议在干燥器中固化，以消除任何气泡。

3. 将PDMS旋涂在玻璃盖玻片上（例如 使用Headway匀胶机以5,000 rpm转速离心2分钟，制备厚度为15 μm的薄而均匀的PDMS基底（22×22 mm）。
4. 用70%乙醇清洁印章以去除灰尘和污物颗粒，然后让其自然晾干。

* 印章可多次使用，但由于随时间推移表面会发生磨损，建议定期更换PDMS印章。

5. 将印模放入 SPI Plasma-Prep II 等离子清洗仪中，在 275 mTorr 条件下处理 1 分钟，使 PDMS 表面亲水化。

* 应密切观察氧气等离子体处理过程。处理时间过长可能导致弹性体开裂。

6. 用70%乙醇对印章消毒1分钟，然后用压缩空气快速吹干。

* 为保持无菌状态，后续步骤应在生物安全柜中进行。

7. 用纤连蛋白溶液（50 μg/ml，溶于ddH₂O）覆盖印章表面，使其吸附至少10分钟。
8. 甩去印章表面的纤连蛋白溶液，并用压缩空气快速吹干。
9. 将印章与PDMS基底紧密贴合接触2分钟，并施加适当压力。
10. 用ddH₂O冲洗微图案化基底。若非立即使用，可将其保存在ddH₂O中，4 °C下最多保存2周。PDMS印章也应存放在ddH₂O中。

2. 双转基因胚胎干细胞系的维持

首先，准备以下培养基用于培养小鼠胚胎干细胞：

小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养基：Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），10% 胎牛血清（FBS）（胚胎干细胞级或分化级），1% 青霉素-链霉素（P/S）

胚胎干细胞（ESC）培养基：DMEM，15% 胚胎干细胞级胎牛血清（FBS），1% 非必需氨基酸（NEAA），0.5% 青霉素-链霉素（P/S），0.2% 白血病抑制因子（LIF），0.0007% 2-巯基乙醇（2-ME）

1. 用无菌的 ddH₂O 中 0.1% 明胶包被 6 孔板，在 37 °C 下吸附 15 分钟。
2. 将解冻后的 MEFs 加入含 50 ml PBS 的锥形管中，于 1,000 rpm 离心 5 分钟。用 MEF 培养基重悬 MEFs。
3. 吸附完成后，吸除多余的明胶，将 MEFs 加入孔中。静置 1 天使 MEFs 贴壁。

* 1000万个MEF细胞的等分试样足以用于3块6孔板。

4. 待MEF贴壁后，将冻存的ES细胞取出，加入50 ml PBS至锥形管中，1,000 rpm离心5 min。用ESC培养基重悬ES细胞，然后加入含有MEF的孔中。在ESC培养基中培养ES细胞，直至细胞融合。

* 胚胎干细胞（ES细胞）达到汇合状态后，需进行传代培养，以避免过度生长并维持ES细胞集落。

5. 准备 ES 细胞进行传代。吸除 ESC 培养基，并用无菌 PBS 洗涤一次。
6. 吸除 PBS，加入 500 μl 胰蛋白酶。在 37 °C 下处理 3.5 分钟。
7. 将胰蛋白酶溶液反复吹打数次以分散 ES 细胞集落，并加入 500 μl ESC 培养基中和反应。
8. 按所需比例传代 ES 细胞，例如，取 33 μl 接种至预先准备有 MEF 的新孔中，实现 1/30 的传代比例。将 ES 细胞维持在 ESC 培养基中培养。

* 1/30 的传代比例可使 ES 细胞在 3 天内达到汇合状态。请根据您的体外分化时间表进行 ES 细胞传代。

3. 体外 双转基因胚胎干细胞系的分化及心脏前体细胞的分离与接种

首先，准备以下实验所需的培养基 体外 胚胎干细胞的分化：

适应培养基：伊氏改良杜尔贝科培养基（IMDM），15% 胎牛血清（ES 细胞级），1% 非必需氨基酸（NEAA），0.5% 青霉素-链霉素（P/S），0.2% 白血病抑制因子（LIF），0.0007% 2-巯基乙醇（2-ME）

分化培养基： IMDM，15% 胎牛血清（分化级），1% 非必需氨基酸（NEAA），0.5% 青霉素-链霉素（P/S），0.35% 0.1 M 抗坏血酸，0.0007% 2-巯基乙醇（2-ME）

1. 开始 体外 当 ES 细胞达到汇合时进行分化。用无菌的 0.1% 明胶 ddH₂O 溶液包被 10 cm 培养皿。₂O，并在37 °C下吸附15分钟。

* 请注意体外分化过程的持续时间。从开始到能够分离出心脏前体细胞需要 8 天。请据此合理规划实验。

2. 按照之前的方法收获 ES 细胞。吸附后，吸去多余的明胶，将约三分之一至二分之一的 ES 细胞悬液加入含适应培养基的预处理培养皿中。培养细胞 2 天。

* 根据您的实验选择适应的 ES 细胞数量。

3. 使用1.5 ml胰蛋白酶将适应后的ES细胞收集至含有PBS的50 ml锥形管中。将解离的ES细胞以1,000 rpm离心5分钟，并用分化培养基重悬。
4. 使用多通道移液器在15 cm培养皿中，以每10 μl液滴约含1,000个细胞的比例形成拟胚体（EBs）。将培养皿倒置，于37 °C培养2.5天，使EBs以悬滴方式生长。
5. 培养2.5天后，将6–8个15 cm培养皿中的EBs用分化培养基合并至一个培养皿中，继续在37 °C培养3.5天。
6. 培养3.5天后，将EBs收集至一个50 ml锥形管中，静置约5分钟使其沉降至管底。吸除上清液，并用无菌PBS洗涤EBs，再次静置约5分钟使其沉降。
7. 在37 °C水浴中加入2.5 ml胰蛋白酶处理EBs 2分钟，同时轻轻振荡管子以解离EBs。然后向胰蛋白酶溶液中加入2.5 ml无菌PBS，使用10 ml血清移液器反复吹打约8–10次以打散细胞团块。加入含7.5% FBS（ES细胞级或分化级）和0.01% DAPI的PBS配制的FACS缓冲液10 ml以中和胰蛋白酶。
8. 将解离后的EBs以1,000 rpm离心5分钟，弃上清，用约1 ml FACS缓冲液重悬。使用1 ml移液器反复吹打约8–10次，进一步打散细胞团块。

* 根据估计的解离拟胚体数量加入FACS缓冲液。细胞浓度过高可能导致流式细胞分选（FACS）过程中堵塞，而浓度过低则可能不必要地延长FACS时间。

9. 将细胞转移至无菌圆底管中，使用35 μm细胞筛网过滤，以获得单细胞悬液。
10. 使用FACSAria流式细胞仪分选已分化的ES细胞，获得纯化的CVP细胞群。

*我们开发了一种多步设门策略，用于分离高纯度的有色细胞。简而言之，我们首先根据前向散射振幅（FSC-A）和侧向散射振幅（SSC-A）进行设门（图1A），以将完整细胞与细胞碎片区分开来。接着，我们根据FSC-A和前向散射宽度（FSC-W）进行设门（图1B），以从双联体及其他细胞聚集体中分离出单细胞。随后，我们根据SSC-A和侧向散射宽度（SSC-W）进行设门（图1C），以进一步提高单细胞的纯度。然后，我们根据DAPI染色情况进行设门，将活细胞（DAPI阴性）与非活细胞（DAPI阳性）分离（图1D）。接下来，我们根据藻红蛋白振幅（PE-A）和藻红蛋白-花青素7染料振幅（PE-Cy7-A）进行设门，以获得真正的红色阳性（R⁺）和真正的红色阴性（R^-）细胞，并排除自发荧光的红色阴性细胞（图1E）。随后，将R⁺和R^-细胞分别根据异硫氰酸荧光素振幅（FITC-A）和PE-A进行设门，以在这两类细胞群中进一步分选出真正的绿色阳性（G⁺）和真正的绿色阴性（G^-）细胞（图1F+1G）。最终得到四类细胞群体：R⁺G⁺、R⁺G^-、R^-G⁺和R^-G^-（图1H）。

11. 用1% Pluronic F-127溶于ddH₂O中，对微图案化基底进行10分钟的钝化处理，随后用无菌PBS洗涤3次。

* Pluronic F-127 是一种可阻断细胞黏附的表面活性剂，有助于将细胞黏附限制在微图案化区域。

12. 在图案化区域周围安装PDMS垫圈并压紧。随后，将CVP细胞接种到纤连蛋白微图案基底上。

结果

FACS 纯化 体外 分化的ES细胞揭示了四种不同的前体细胞群体（图1）。通过免疫荧光显微镜确认了微图案化纤连蛋白的存在，结果显示连续的纤连蛋白条带被完整转移（图2). 将FACS分选的前体细胞接种于纤维连接蛋白微图案上，可导致R的排列⁺G⁺ 以及R的一部分^-G⁺ 群体。尽管使用了Pluronic F-127作为抑制细胞黏附的阻断剂，但R⁺G^- 和 R^-G^- 细胞群体未遵循纤连蛋白的各向异性结构，而是生长进入相邻蛋白线条之间的空隙图3).

讨论

在此方案中，我们介绍了一种分离纯化的心源性前体细胞群体的方法，并将其接种于微图形化纤维连接蛋白基质上，使其能够排列整齐并呈现类似心肌细胞的杆状形态。正常的细胞排列对于组织的正常功能至关重要。^8,10 ，尤其是心肌组织。研究表明，心肌细胞在力学性能方面得到显著改善^11,12 以及电生理特性^11,13 在形成各向异性细胞阵列时，由于在微图形化纤连蛋白基底上培养的心脏前体细胞会分化为杆状心肌细胞 体外，这代表了心脏组织生物工程中的一个关键步骤。

微接触印刷是一种简单且低成本的工具，可用于制备模拟心肌组织的二维模板 体外然而，细胞外基质蛋白的有效且成功的图案化在很大程度上依赖于所选蛋白的种类。尽管已有多种不同的蛋白被成功地印迹到PDMS基底上，但某些蛋白（如I型胶原）在进行微接触印刷前，需要对PDMS基底进行表面修饰。¹⁴此外，施加在印章上的压力大小以及压印时间的长短也会显著影响微接触印刷的效率和保真度。

该方案...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
L-抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A4544	配制 0.1 M 的 ddH₂O 溶液2O
真空干燥器，10 英寸	Nova-Tech International, Inc.	55206
4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）	Life Technologies	D1306
杜尔贝科改良伊格尔培养基	赛默飞世尔科技	SH30022.01
DPBS	Gibco	14190
FACSAria II 流式细胞仪	BD 生物科学
胎牛血清 ES细胞级	Gemini Bio-Products	100-106
胎牛血清 分化级	Gemini Bio-Products	100-500
牛血浆来源的纤连蛋白	Sigma-Aldrich	F4759	溶解至 ddH₂O 中，浓度为 1 mg/ml2O
Fisherfinest 高级盖玻片 22x22mm	Fisher Scientific	12-548-B
猪皮明胶	Sigma-Aldrich	G1890	制备 0.1% 的 ddH₂O 溶液2O
Headway 旋涂仪	Headway Research, Inc.	PWM32-PS-CB15
Iscove改良的Dulbecco培养基	赛默飞世尔科技	SH30228.01
白血病抑制因子	由分泌LIF的细胞系自备		配制500倍浓缩液
MEM非必需氨基酸	Gibco	11140-050
2-巯基–乙醇	Sigma-Aldrich	M6250
小鼠胚胎成纤维细胞	从小鼠胚胎第12至15天采集
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	在ddH₂O中配制1%溶液2O
圆底管配35 μm细胞滤筛	BD 生物科学	352235
SPI Plasma-Prep II 等离子清洗机	SPI Supplies	11005-AB
Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒	道康宁	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-056
真空计	SPI Supplies	11019-AB