通过微接触印刷技术生成取向功能性心肌组织

摘要

生成排列整齐的心肌组织是将干细胞生物学的最新进展应用于临床实用目的的关键要求。本文中，我们描述了一种微接触印刷技术，可精确控制细胞形态与功能。利用高度纯化的胚胎干细胞来源的心脏前体细胞，我们进而生成了各向异性的功能性心肌组织。

摘要

晚期心力衰竭是一种主要的未被满足的临床挑战，源于有活力和/或功能完整的心肌细胞的丧失。尽管已有最佳药物治疗，心力衰竭仍是发达国家中导致死亡和疾病负担的主要原因。在药物研发中，一个主要挑战在于鉴定能够准确模拟正常与病变人心肌生理的细胞检测方法。 体外同样，再生心脏生物学面临的主要挑战集中在临床相关数量下，识别并分离患者特异性的心脏前体细胞。随后，这些细胞需要被组装成功能性组织，以模拟天然心脏组织的结构。. 微接触印刷技术能够创建出精确的微图案化蛋白质结构，这些结构类似于心脏的组织架构，从而为空间控制细胞黏附提供几何学线索。本文中，我们描述了一种从多能干细胞分化过程中分离高纯度心肌细胞的方法 体外细胞生长表面的微图形化制备，该表面经细胞外基质蛋白修饰，以及由干细胞衍生的心肌细胞组装成各向异性的心肌组织。

引言

尽管医学治疗取得了近期进展，晚期心力衰竭仍然是发达国家发病率和死亡率的主要原因。该临床综合征源于功能性心肌组织的丧失，进而导致衰竭的心脏无法满足患者的代谢需求。由于心脏的再生能力有限，自体心脏移植是目前唯一被临床认可、旨在补充丧失的功能性心肌组织的治疗方法。然而，心脏移植存在诸多显著局限，包括供体心脏数量有限以及需要长期免疫抑制治疗，因而限制了该疗法的广泛应用。因此，药物治疗仍是心脏病患者的主要治疗手段。在药物研发过程中，一个重大挑战在于鉴定能够准确模拟正常和病变心肌生理状态的细胞检测方法。 体外.

干细胞生物学与组织工程技术的最新融合为心脏再生开辟了新的前景。利用可再生的患者特异性来源生成具有功能的心肌组织将是该领域的一项重大进展。这将有助于开发针对药物研发与发现的疾病特异性细胞检测方法，并为心脏再生医学奠定基础。人类胚胎干细胞（ES细胞）以及更为重要的人类诱导多能干细胞（iPS细胞）代表着一种潜在的、可再生的患者特异性心室前体细胞及成熟心室肌细胞来源。结合干细胞生物学与组织工程策略，有望实现功能性心肌组织的构建 体外 可用于药物发现的细胞检测方法开发，或用于治疗晚期心力衰竭的心脏再生策略。

心脏再生领域的一个核心挑战是确定一种最佳的细胞类型。已有大量不同类型的细胞被研究¹然而迄今为止，尽管已发现来自不同来源的多种多能心脏前体细胞，但尚未明确一种能够满足关键....

方案

生成取向功能性心肌组织的方案可分为三个主要部分。使用软光刻技术制备微图案化模板不属于以下方案的内容，但可根据已建立的方法进行制备⁶。

1. 将纤连蛋白微接触印刷至PDMS基底

1. 按10:1的基料与固化剂比例混合Sylgard 184（Dow Corning）PDMS弹性体，并使用真空干燥器脱气以去除所有气泡。
2. 将PDMS置于先前制备的模具上固化，该模具具有20 μm宽、2 μm高、间距为20 μm的脊状结构，在室温下固化2天或在65 °C下固化4小时，以获得微结构化的PDMS印章。

* 建议在干燥器中固化，以消除任何气泡。

3. 将PDMS旋涂在玻璃盖玻片上（例如 使用Headway匀胶机以5,000 rpm转速离心2分钟，制备厚度为15 μm的薄而均匀的PDMS基底（22×22 mm）。
4. 用70%乙醇清洁印章以去除灰尘和污物颗粒，然后让其自然晾干。

* 印章可多次使用，但由于随时间推移表面会发生磨损，建议定期更换PDMS印章。

5. 将印模放入 SPI Plasma-Prep II 等离子清洗仪中，在....

结果

FACS 分选纯化 体外 分化的ES细胞揭示了四种不同的前体细胞群体（图1）。通过免疫荧光显微镜确认了微图案化纤连蛋白的存在，结果显示连续的纤连蛋白条带被完整转移（图2). 将FACS分选的前体细胞接种至纤维连接蛋白微图案上，可导致R的排列⁺G⁺ 以及R的一部分^-G⁺ 群体。尽管使用了Pluronic F-127作为抑制细胞黏附的辅助阻断剂，但R⁺G^- 和 R^-G^- 细胞群体未遵循纤连蛋白的各向异性结构，而是生长进入相邻蛋白线条之间的区域（图3).

讨论

在此方案中，我们介绍了一种分离纯化的心源性前体细胞群体的方法，并将其接种于微图形化纤维连接蛋白基质上，使其能够排列整齐并呈现类似心肌细胞的杆状形态。正常的细胞排列对于组织的正常功能至关重要。^8,10 ，尤其是心肌组织。研究表明，心肌细胞在力学性能方面得到显著改善^11,12 以及电生理特性^11,13 在形成各向异性细胞阵列时，由于在微图形化纤连蛋白基底上培养的心脏前体细胞会分化为杆状心肌细胞 体外，这代表了心脏组织生物工程中的一个关键步骤。

微接触印刷是一种简单且低成本的工具，可用于制备模拟心肌组织的二维模板 体外然而，细胞外基质蛋白的有效且成功的图案化在很大程度上依赖于所选蛋白的种类。尽管已有多种不同的蛋白被成功地印迹到PDMS基底上，但某些蛋白（如I型胶原）在进行微接触印刷前，需要对PDMS基底进行表面修饰。¹⁴此外，施加在印章上的压力大小以及压印时间的长短也会显著影响微接触印刷的效率和保真度。

该方案.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
L-抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A4544	配制 0.1 M 的 ddH₂O 溶液2O
真空干燥器，10 英寸	Nova-Tech International, Inc.	55206
4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）	Life Technologies	D1306
杜尔贝科改良伊格尔培养基	赛默飞世尔科技	SH30022.01
DPBS	Gibco	14190
FACSAria II 流式细胞仪	BD 生物科学
胎牛血清 ES细胞级	Gemini Bio-Products	100-106
胎牛血清 分化级	Gemini Bio-Products	100-500
牛血浆来源的纤连蛋白	Sigma-Aldrich	F4759	溶解至 ddH₂O 中，浓度为 1 mg/ml2O
Fisherfinest 高级盖玻片 22x22mm	Fisher Scientific	12-548-B
猪皮明胶	Sigma-Aldrich	G1890	制备 0.1% 的 ddH₂O 溶液2O
Headway 旋涂仪	Headway Research, Inc.	PWM32-PS-CB15
Iscove改良的Dulbecco培养基	赛默飞世尔科技	SH30228.01
白血病抑制因子	由分泌LIF的细胞系自备		配制500倍浓缩液
MEM非必需氨基酸	Gibco	11140-050
2-巯基–乙醇	Sigma-Aldrich	M6250
小鼠胚胎成纤维细胞	从小鼠胚胎第12至15天采集
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	在ddH₂O中配制1%溶液2O
圆底管配35 μm细胞滤筛	BD 生物科学	352235
SPI Plasma-Prep II 等离子清洗机	SPI Supplies	11005-AB
Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒	道康宁	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-056
真空计	SPI Supplies	11019-AB