外泌体中稳定存在的微小RNA（miRNA）引起了广泛关注，因其在细胞间通讯中具有重要作用，并在作为生物标志物及治疗干预途径方面展现出巨大潜力。本文展示了从血液和培养基中纯化外泌体，随后通过定量PCR检测其所携带的miRNA。
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摘要
摘要
稳定的miRNA存在于所有体液中，其中一些循环miRNA因被包裹在称为外泌体的小囊泡内而免于降解。外泌体可与细胞质膜融合，从而将RNA和蛋白质转移至靶细胞。其生物学功能包括免疫应答、抗原呈递以及细胞间通讯。通过血液递送能够调控受体细胞基因表达的miRNA，为靶向干预开辟了新的途径。除了为药物或RNA治疗剂的递送提供策略外，外泌体内容物还可作为生物标志物，有助于疾病诊断、治疗方案选择及预后判断。
本文将介绍从血液和细胞培养基中分泌的外泌体分离miRNA和信使RNA（mRNA）并进行定量分析的实验方法。纯化的外泌体将通过蛋白质印迹法检测外泌体标志物，并通过PCR检测特定mRNA。采用透射电子显微镜（TEM）结合免疫胶体金标记技术，验证外泌体的形态特征和结构完整性。从这些外泌体中提取总RNA，以确保可从同一样本中同时研究mRNA和miRNA。在利用Bioanalyzer检测RNA完整性后，将采用中等通量的实时定量PCR（qPCR）方法，使用TaqMan低密度阵列（TLDA）卡片鉴定外泌体中的miRNA，并对目标转录本进行基因表达分析。
这些方案可用于定量分析药物干预前后患者、啮齿类动物模型及细胞培养基中外泌体miRNA的变化。外泌体的内容物因其来源以及分泌外泌体的细胞所处的生理状态不同而存在差异。这些差异有助于揭示细胞和系统如何应对应激或生理扰动。我们的代表性数据显示，从小鼠血液、人血液以及人细胞培养基中纯化的外泌体所含miRNA存在差异。
本文将介绍从血液和细胞培养基中分泌的外泌体分离miRNA和信使RNA（mRNA）并进行定量分析的实验步骤。纯化的外泌体将通过蛋白质印迹法（Western blot）检测外泌体标志物，并通过PCR检测特定mRNA。采用透射电子显微镜（TEM）结合免疫胶体金标记技术，验证外泌体的形态和完整性。从这些外泌体中提取总RNA，以确保能够从同一样本中同时研究mRNA和miRNA。在利用Bioanalyzer检测RNA完整性后，将采用中等通量的实时定量PCR（qPCR）方法，使用TaqMan低密度阵列（TLDA）卡片鉴定外泌体中的miRNA，并对目标转录本进行基因表达分析。
这些方案可用于定量分析患者、啮齿类动物模型以及细胞培养基在药物干预前后外泌体miRNA的变化。外泌体的内容物因其来源以及分泌外泌体的细胞所处的生理状态不同而存在差异。这些差异有助于了解细胞和系统如何应对压力或生理扰动。我们提供的代表性数据显示，从小鼠血液、人血液以及人细胞培养基中纯化的外泌体所含miRNA存在差异
引言
短链非编码miRNA通过与靶标mRNA结合来调控基因表达。约7个碱基的种子序列互补性使miRNA能够结合靶标mRNA，从而抑制翻译过程或降低mRNA的稳定性，这两种机制均可导致靶蛋白表达水平下降1。过去十年的研究已明确证实miRNA在介导细胞功能中具有重要作用。此外，大量研究致力于解析miRNA介导的、与多种疾病相关的分子变化2,3。更重要的是，近年来在体液中发现稳定的miRNA4-6，为其作为适用于临床诊断的新型生物标志物开辟了道路。
体液中miRNA的一种运输方式是通过外泌体，即通过全身血液循环将mRNA、蛋白质、脂质介质和miRNA传递给靶细胞的小囊泡7-14。这会导致靶细胞中基因表达的调控，代表了一种新型的细胞间通讯机制。例如，细胞可通过分泌和/或吸收含有参与炎症过程的生物分子（如白细胞介素-1β（IL1β）、肿瘤坏死因子-α（TNFα）、转化生长因子-β5（TGFβ5）以及调控这些基因的miRNA）的外泌体来调节免疫调控过程13。由于miRNA表达异常是多种人类疾病的共同特征，这些分子为发现和验证新的治疗靶点提供了令人期待的新机遇2。
循环miRNA存在于所有体液中，已知外泌体的组成因其释放来源的细胞不同而有所差异。因此，它们为研究细胞的生理状态以及细胞在应对压力（包括疾病）时如何改变信号传导事件提供了途径。研究外泌体组成的变化有助于深入了解信号转导机制，并探讨其作为生物标志物或治疗干预靶点的潜在应用价值。
本文将基于已发表的方案，演示从多种来源纯化外泌体的方法。这些外泌体将用于RNA提取，随后进行qPCR，以鉴定并定量外泌体中存在的miRNA水平。
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方案
所有使用人类和啮齿类动物血液样本的实验均严格遵守相关指南、法规及监管机构的要求。人类受试者的纳入均在获得知情同意后进行，该研究方案已获德雷塞尔大学医学院机构审查委员会批准；所有涉及动物的实验程序均经德雷塞尔大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 从血液中纯化外泌体（约 5.5 小时）
提示
- 我们将一管血液（约10 ml人血和约2 ml小鼠血）中的外泌体重悬于300 μl mirVana miRNA提取试剂盒中的RNA裂解缓冲液中。
- 为从细胞培养上清中纯化外泌体，需先将上清在500 × g条件下离心10分钟以去除细胞，并在12,000 × g离心后经0.22 μm滤器过滤。从细胞培养上清中纯化外泌体无需在PBS中稀释、PBS洗涤或第二次超速离心步骤。
- 如果纯化的外泌体将用于蛋白质组学研究，在超速离心步骤后增加蔗糖梯度离心可减少蛋白聚集体和污染物的含量15。
- 外泌体在透射电镜（TEM）下的形态可能因来源及样品处理步骤的不同而有所差异。我们未观察到此前报道中归因于样品处理差异的杯状形态9,15。我们的TEM图像（包括免疫胶体金标记）与既往来自血液、胆汁及皮层培养来源外泌体的研究报道相似9,16,17。
- 将含有血液的EDTA抗凝管颠倒5次，室温直立放置10–60分钟。
- 在4 °C条件下，以2,000 × g离心15分钟。
- 收集上层血浆，转移至15 ml离心管中，并置于冰上保存。
- 用等体积的PBS稀释液体，在4 °C条件下以2,000 × g离心30分钟。
- 转移至离心管中，加入1× PBS至总体积为24 ml，在4 °C条件下以12,000 × g离心45分钟。
- 转移至超速离心管中，在4 °C条件下以110,000 × g离心2小时。
- 将沉淀重悬于PBS中，在4 °C条件下以100,000 × g离心1小时。
- 将沉淀重悬于适当的缓冲液（RNA裂解缓冲液）中。
- 分别用PBS或RIPA缓冲液重悬沉淀，用于透射电子显微镜观察和Western印迹分析。
2. 使用改良的 mirVana miRNA 分离试剂盒进行 RNA 纯化（约 1 小时）
提示
- 在进行RNA分离前，应穿戴个人防护装备（PPE），使用RNase Zap擦拭实验台面和移液器，并使用无菌的滤芯吸头和离心管。
- 尽管试剂盒说明书提供了仅纯化miRNA的选项，但我们始终提取包括mRNA和miRNA在内的总RNA，以便能够从同一样本中同时研究两者。
- 增加柱上DNase处理步骤可去除可能残留的DNA。根据外泌体来源的不同，已有报道显示，从小鼠和人肥大细胞系中纯化的外泌体不含DNA8，但在培养的心肌细胞培养基中纯化的外泌体中已检测到染色体DNA序列18。
- 我们将洗涤液1的体积减少至350 μl（如下步骤2.4所述），因为试剂盒中提供的洗涤液1仅够一次700 μl的添加量；若不减少体积，则剩余溶液不足以完成整个试剂盒的操作。其余步骤均按照制造商的建议进行。
- 加入1/10体积的miRNA匀浆添加剂（30 μl），冰上孵育10分钟。
- 用与初始裂解液体积相等的酸性酚:氯仿溶液进行抽提。离心后，将上层液体转移至新的离心管中。
- 加入1.25倍体积的100%乙醇（375 μl），涡旋混匀。将溶液转移至过滤柱中，于10,000 × g离心15秒。
- 加入推荐体积一半的miRNA Wash Solution 1（350 μl），在10,000 × g条件下离心15秒。
- 每个样品中加入10 μl DNase 1和70 μl RDD缓冲液（Qiagen），混匀后取80 μl加入柱中，室温孵育15分钟。
- 加入洗涤液1（350 μl），在10,000 × g条件下离心15秒。
- 加入漂洗液2/3（500 μl），于10,000 × g离心15秒。重复一次。
- 用40 μl 95 °C的无核酸酶水洗脱2O.
- 测定RNA浓度，并将RNA稀释至100 ng/μl。
3. 使用Taqman低密度阵列（TLDA）卡片对血液来源外泌体进行miRNA表达谱分析（约6.5小时）
提示
- 进行RNA分离前，应穿戴个人防护装备（PPE），使用RNase Zap擦拭实验台面和移液器，并使用无菌滤芯吸头和离心管。
- 建议对1–350 ng RNA样本进行预扩增（pre-amp）步骤（350–1,000 ng样本在cDNA合成后无需预扩增）。必须确定您的样本是否需要预扩增，因为所有样本必须在相同条件下处理。预扩增步骤会增加成本，且Ct值的可接受截断值较低（32而非40）。
- 根据每天可运行的芯片数量，使用条状管而非孔板来配制cDNA反应体系可能更为方便。这可以尽量减少未在当天处理的cDNA样本经历冻融循环。
- 从不同来源收集的外泌体所含RNA量不同。本方案中cDNA合成反应最多可加入3 μl RNA模板。根据来源不同，可提取的外泌体RNA量可能受限。通常组织样本可获得足量RNA，使得cDNA合成可使用3 μl体积中含100 ng RNA；而人血液或人细胞培养上清来源的外泌体通常RNA含量较低，cDNA合成需使用较少起始材料。小鼠血液外泌体RNA含量较高，通常可在3 μl中获得至少100 ng RNA。
- 使用Megaplex Pools逆转录引物（Pool A和Pool B分别含有对应于微流控芯片Array A和Array B上miRNA的引物）从纯化的RNA制备cDNA时，将反应组分置于冰上解冻。
- 标记两个无RNase的1.5 ml离心管，分别用于Pool A引物或Pool B引物的逆转录反应，并按图表顺序加入各组分。若进行两管或更多反应，应额外增加至少一倍的组分体积，或按照试剂供应商的建议配制总反应混合液（master mix）。
| RT反应组分 | 组分浓度 | 单个样品所需体积（总体积/样品 = 4.5 μl） |
| 无核酸酶水 | 0.20 μl | |
| Megaplex RT缓冲液（10X） | 1X | 0.80 μl |
| dNTPs（100 mM） | 4.4 mM | 0.20 μl |
| MgCl2（25 mM） | 5 mM | 0.90 μl |
| RNase抑制剂（20U/μl） | 2 U | 0.10 μl |
| Megaplex RT引物A或B（10X） | 1X | 0.80 μl |
| MultiScribe反转录酶 | 75 U | 1.50 μl |
- 将离心管颠倒6次并短暂离心。然后，用移液器将4.5 μl反转录反应混合液加入MicroAmp 8联管条或96孔MicroAmp光学反应板中。
- 加入100 ng RNA，并用DEPC处理水调整体积至3 μl；或直接加入3 μl总RNA，用移液器枪头轻轻搅动混匀，密封管子或反应板。短暂离心后，置于冰上孵育5分钟。
- 将反应体系放入PCR仪中，并按照以下条件运行程序（依据Applied Biosystems Megaplex Pools方案推荐）：
| 阶段 | 温度 | 时间 |
| 循环 (40次) | 16 °C | 2 min |
| 42 °C | 1 min | |
| 50 °C | 1 sec | |
| 保持 | 85 °C | 5 min |
| 保持 | 4 °C | ∞ |
- 将 cDNA 储存在 -20 °C（至少可稳定保存一周），或直接进行预扩增步骤，预扩增产物可保存一周。
- 将 Pool A 和 Pool B 的预扩增引物置于冰上解冻，并轻轻颠倒混匀。同时将 TaqMan 预扩增主混合液轻轻涡旋混匀，并保持在冰上。
- 根据下表配制反应体系，若进行两轮或更多反应，应额外增加至少一个反应的试剂体积；或按照试剂供应商的建议配制主混合液。
| 预扩增反应组分 | 单个样本体积 |
| 无核酸酶水 | 7.5 μl |
| Taqman PreAmp Master Mix (2X) | 12.5 μl |
| Megaplex PreAmp 引物 A 或 B (10X) | 2.5 μl |
- 取2.5 μl反转录产物加入MicroAmp 8联管或96孔MicroAmp光学反应板中，并向每孔加入22.5 μl预扩增反应混合液。
- 密封反应板，冰上孵育5分钟，然后将样品放入PCR仪中。按以下条件运行反应。
| 阶段 | 温度 | 时间 |
| 保持 | 95 °C | 10 min |
| 保持 | 55 °C | 2 min |
| 保持 | 72 °C | 2 min |
| 循环（12次） | 95 °C | 15 sec |
| 60 °C | 4 min | |
| 保持 | 99.9 °C | 10 min |
| 保持 | 4 °C | ∞ |
- 预扩增反应结束后，短暂离心管或板，然后向每个孔或管中加入 75 μl 0.1X TE（pH 8.0）。
- 密封后充分混匀并短暂离心。将稀释产物于 -20 °C 保存一周，或直接进行下一步的板加载操作。
- 在冰上，于无 RNase 的 1.5 ml 离心管中混合以下组分。
| 组分 | 每张芯片的体积 |
| Taqman Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG (2X) | 450 μl |
| 稀释后的预扩增产物 | 9 μl |
| 无核酸酶水 | 441 μl |
- 倒置试管以混匀，并短暂离心。将100 μl PCR反应混合液加入Taqman MicroRNA Array卡的每个孔中。
- 以1,000 × g离心卡板2次，每次1分钟。密封卡板，并按照Applied Biosystems操作手册中提供的引物模板以及384孔Taqman低密度阵列设置运行程序。我们使用Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR系统。
4. 采用Taqman法进行mRNA分析（约1.5小时）
- 进行qPCR反应配制时，按照图表中的顺序混合反应组分。所有样品将使用目的基因的引物探针以及作为内参基因的18S rRNA进行分析。
| Taqman 反应组分 | 单个样本的体积 |
| 无核酸酶水 | 7 μl（根据单个样本调整） |
| Taqman Fast Master Mix (2X) | 10 μl |
| Taqman 引物探针 (20x) | 1 μl |
| 由 100 ng RNA 反转录得到的 cDNA | 2 μl（根据单个样本调整） |
- 按照制造商推荐的方法，使用快速96孔板（Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System）运行96孔板。
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结果
从血液或细胞培养基中分离外泌体后，可通过电子显微镜（EM）和蛋白质印迹法（western blot）检测外泌体的纯度（图1A 和 图1B）。我们使用多种抗体，通过电子显微镜和蛋白质印迹法验证了来自不同来源的外泌体制备物。图1A 显示了电子显微镜图像，证实外泌体结构完整，直径约为 30–100 nm，并通过免疫胶体金标记检测到其含有 CD81。常用的外泌体标志物包括 Hsp70 以及四跨膜蛋白家族糖蛋白 CD63、CD81 和 CD914。在确认纯化外泌体结构完整后，我们在 图1B 中对外泌体中的 Hsp70 进行了蛋白质印迹分析，结果显示外泌体含有 Hsp70，而单独的培养基（阴性对照）则不含。Bioanalyzer 谱图显示，从 RAW 细胞培养基中分离的外泌体含有多种 RNA，但不含全细胞 RNA 中常见的大量核糖体 RNA（图1C）。图1D 显示了对全血及血液来源外泌体中 mRNA 的 qPCR 分析结果。使...
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讨论
在本实验方案中，我们展示了如何对通过差速离心法从血液和培养基中纯化的外泌体中的miRNA和mRNA进行定量分析。外泌体的组分因其来源不同而具有多样性，并参与多种生物学功能，包括免疫应答、抗原呈递、细胞间通讯以及RNA和蛋白质的转移9,11,12,19,20。尽管大小和形态是判断外泌体纯度的重要依据，但多篇展示外泌体电镜数据的研究表明，这些囊泡的大小和形态会因其分泌来源以及固定和成像方法的不同而有所差异9,15。公认的外泌体大小范围为30–100 nm，这是一个平均范围，包含了部分直径较大的外泌体亚群，具体取决于其来源21,22，这也是为何需要采用多种方法来验证外泌体纯度的原因之一。分泌型miRNA具备优良生物标志物所需的多项特征23，同时也有望成为多种疾病的潜在治疗靶点2,3,24。该纯化方法提供了一种无创手段，可用于表征多种体液中外泌体内容物随时间变化的生物学动态，而通过qPCR进行miRNA谱型分析则可全面概述miRNA的组成情况2。目前已知有超过4,500种蛋白质、1,639种mRNA、764种miR...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由Seena Ajit获得的丽塔·艾伦基金会资助项目提供资金支持。作者谨此感谢南卡罗来纳大学电子显微镜中心的Erika Balogh和Soumitra Ghoshroy博士在仪器使用及科学与技术方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| EDTA 涂层真空采血管（10 ml 管） | BD Diagnostics | 366643 | 用于从人血中纯化外泌体 |
| EDTA 涂层真空采血管（2 ml 管） | BD Diagnostics | 367841 | 用于从小鼠血液中纯化外泌体 |
| PAXgene 血液 RNA 管 | BD Diagnostics | 762165 | 用于从全血中分离 miRNA |
| miRVana microRNA 分离试剂盒 | Ambion | AM1561 | |
| 酸性酚: 氯仿（CHCl3） | Ambion | 9721G | |
| DNase 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan 通用 PCR 主混合液，不含 AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | 用于 TLDA 芯片 |
| Megaplex RT 大鼠池组 v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex 预扩增大鼠池组 v3.0 | Applied Biosystems | 4444747 | |
| Taqman Array 大鼠 microRNA A+B 芯片组 v3.0 | Applied Biosystems | 4444909 | |
| Megaplex RT 人池组 v3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex 预扩增人池组 v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array 人 microRNA A+B 芯片组 v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman MicroRNA RT 试剂盒 | Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman 快速通用 PCR 主混合液 | Applied Biosystems | 4366072 | 用于 mRNA qRT-PCR |
| 肿瘤坏死因子（引物探针） | Applied Biosystems | Hs01113624_g1 | |
| 血管内皮生长因子 A（引物探针） | Applied Biosystems | Hs00900055_m1 | |
| Maxima 第一链 cDNA 合成试剂盒（用于 RT-qPCR） | Thermo Scientific | K1642 | 用于 mRNA |
| HSP70 抗体 | Abcam | ab94368 | 用于 Western 印迹 |
| 抗兔 IgG-胶体金 | Sigma | G7402 | 用于电子显微镜 |
| 兔抗 CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| 镍 300 目碳支持膜载网 | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Ni | |
| 铜 300 目碳支持膜载网 | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu | |
| 表 1. 特异性试剂列表。 |
参考文献
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