血液及培养基来源外泌体的纯化与microRNA谱分析

摘要

外泌体中稳定存在的微小RNA（miRNA）引起了广泛关注，因其在细胞间通讯中具有重要作用，并在作为生物标志物及治疗干预途径方面展现出巨大潜力。本文展示了从血液和培养基中纯化外泌体，随后通过定量PCR检测其所携带的miRNA。

摘要

稳定的miRNA存在于所有体液中，其中一些循环miRNA因被包裹在称为外泌体的小囊泡内而免于降解。外泌体可与细胞质膜融合，从而将RNA和蛋白质转移至靶细胞。其生物学功能包括免疫应答、抗原呈递以及细胞间通讯。通过血液递送能够调控受体细胞基因表达的miRNA，为靶向干预开辟了新的途径。除了为药物或RNA治疗剂的递送提供策略外，外泌体内容物还可作为生物标志物，有助于疾病诊断、治疗方案选择及预后判断。

本文将介绍从血液和细胞培养基中分泌的外泌体分离miRNA和信使RNA（mRNA）并进行定量分析的实验方法。纯化的外泌体将通过蛋白质印迹法检测外泌体标志物，并通过PCR检测特定mRNA。采用透射电子显微镜（TEM）结合免疫胶体金标记技术，验证外泌体的形态特征和结构完整性。从这些外泌体中提取总RNA，以确保可从同一样本中同时研究mRNA和miRNA。在利用Bioanalyzer检测RNA完整性后，将采用中等通量的实时定量PCR（qPCR）方法，使用TaqMan低密度阵列（TLDA）卡片鉴定外泌体中的miRNA，并对目标转录本进行基因表达分析。

这些方案可用于定量分析药物干预前后患者、啮齿类动物模型及细胞培养基中外泌体miRNA的变化。外泌体的内容物因其来源以及分泌外泌体的细胞所处的生理状态不同而存在差异。这些差异有助于揭示细胞和系统如何应对应激或生理扰动。我们的代表性数据显示，从小鼠血液、人血液以及人细胞培养基中纯化的外泌体所含miRNA存在差异。

本文将介绍从血液和细胞培养基中分泌的外泌体分离miRNA和信使RNA（mRNA）并进行定量分析的实验步骤。纯化的外泌体将通过蛋白质印迹法（Western blot）检测外泌体标志物，并通过PCR检测特定mRNA。采用透射电子显微镜（TEM）结合免疫胶体金标记技术，验证外泌体的形态和完整性。从这些外泌体中提取总RNA，以确保能够从同一样本中同时研究mRNA和miRNA。在利用Bioanalyzer检测RNA完整性后，将采用中等通量的实时定量PCR（qPCR）方法，使用TaqMan低密度阵列（TLDA）卡片鉴定外泌体中的miRNA，并对目标转录本进行基因表达分析。

这些方案可用于定量分析患者、啮齿类动物模型以及细胞培养基在药物干预前后外泌体miRNA的变化。外泌体的内容物因其来源以及分泌外泌体的细胞所处的生理状态不同而存在差异。这些差异有助于了解细胞和系统如何应对压力或生理扰动。我们提供的代表性数据显示，从小鼠血液、人血液以及人细胞培养基中纯化的外泌体所含miRNA存在差异

引言

短链非编码miRNA通过与靶标mRNA结合来调控基因表达。约7个碱基的种子序列互补性使miRNA能够结合靶标mRNA，从而抑制翻译过程或降低mRNA的稳定性，这两种机制均可导致靶蛋白表达水平下降¹。过去十年的研究已明确证实miRNA在介导细胞功能中具有重要作用。此外，大量研究致力于解析miRNA介导的、与多种疾病相关的分子变化^2,3。更重要的是，近年来在体液中发现稳定的miRNA^4-6，为其作为适用于临床诊断的新型生物标志物开辟了道路。

体液中miRNA的一种运输方式是通过外泌体，即通过全身血液循环将mRNA、蛋白质、脂质介质和miRNA传递给靶细胞的小囊泡^7-14。这会导致靶细胞中基因表达的调控，代表了一种新型的细胞间通讯机制。例如，细胞可通过分泌和/或吸收含有参与炎症过程的生物分子（如白细胞介素-1β（IL1β）、肿瘤坏死因子-α（TNFα）、转化生长因子-β5（TGFβ5）以及调控这些基因的miRNA）的外泌体来调节免疫调控过程¹³。由于miRNA表达异常是多种人类疾病的共同特征，这些分子为发现和验证新的治疗靶点提供了令人期待的新机遇²。

循环miRNA存在于所有体液中，已知外泌体的组成因其释放来源的细胞不同而有所差异。因此，它们为研究细胞的生理状态以及细胞在应对压力（包括疾病）时....

方案

所有使用人类和啮齿类动物血液样本的实验均严格遵守相关指南、法规及监管机构的要求。人类受试者的纳入均在获得知情同意后进行，该研究方案已获德雷塞尔大学医学院机构审查委员会批准；所有涉及动物的实验程序均经德雷塞尔大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 从血液中纯化外泌体（约 5.5 小时）

提示

• 我们将一管血液（约10 ml人血和约2 ml小鼠血）中的外泌体重悬于300 μl mirVana miRNA提取试剂盒中的RNA裂解缓冲液中。
• 为从细胞培养上清中纯化外泌体，需先将上清在500 × g条件下离心10分钟以去除细胞，并在12,000 × g离心后经0.22 μm滤器过滤。从细胞培养上清中纯化外泌体无需在PBS中稀释、PBS洗涤或第二次超速离心步骤。
• 如果纯化的外泌体将用于蛋白质组学研究，在超速离心步骤后增加蔗糖梯度离心可减少蛋白聚集体和污染物的含量¹⁵。
• 外泌体在透射电镜（TEM）下的形态可能因来源及样品处理步骤的不同而有所差异。我们未观察到此前报道中归因于样品处理差异的杯状形态^9,15。我们的TEM图像（包括免疫胶体金标记）与既往来....

结果

从血液或细胞培养基中分离外泌体后，可通过电子显微镜（EM）和蛋白质印迹法（western blot）检测外泌体的纯度（图1A 和 图1B）。我们使用多种抗体，通过电子显微镜和蛋白质印迹法验证了来自不同来源的外泌体制备物。图1A 显示了电子显微镜图像，证实外泌体结构完整，直径约为 30–100 nm，并通过免疫胶体金标记检测到其含有 CD81。常用的外泌体标志物包括 Hsp70 以及四跨膜蛋白家族糖蛋白 CD63、CD81 和 CD9¹⁴。在确认纯化外泌体结构完整后，我们在 图1B 中对外泌体中的 Hsp70 进行了蛋白质印迹分析，结果显示外泌体含有 Hsp70，而单独的培养基（阴性对照）则不含。Bioanalyzer 谱图显示，从 RAW 细胞培养基中分离的外泌体含有多种 RNA，但不含全细胞 RNA 中常见的大量核糖体 RNA（图1C）。图1D 显示了对全血及血液来源外泌体中 mRNA 的 qPCR 分析结果。使.......

讨论

在本实验方案中，我们展示了如何对通过差速离心法从血液和培养基中纯化的外泌体中的miRNA和mRNA进行定量分析。外泌体的组分因其来源不同而具有多样性，并参与多种生物学功能，包括免疫应答、抗原呈递、细胞间通讯以及RNA和蛋白质的转移^{9,11,12,19,20}。尽管大小和形态是判断外泌体纯度的重要依据，但多篇展示外泌体电镜数据的研究表明，这些囊泡的大小和形态会因其分泌来源以及固定和成像方法的不同而有所差异^9,15。公认的外泌体大小范围为30–100 nm，这是一个平均范围，包含了部分直径较大的外泌体亚群，具体取决于其来源^21,22，这也是为何需要采用多种方法来验证外泌体纯度的原因之一。分泌型miRNA具备优良生物标志物所需的多项特征²³，同时也有望成为多种疾病的潜在治疗靶点^2,3,24。该纯化方法提供了一种无创手段，可用于表征多种体液中外泌体内容物随时间变化的生物学动态，而通过qPCR进行miRNA谱型分析则可全面概述miRNA的组成情况²。目前已知有超过4,500种蛋白质、1,639种mRNA、764种miR.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
EDTA 涂层真空采血管（10 ml 管）	BD Diagnostics	366643	用于从人血中纯化外泌体
EDTA 涂层真空采血管（2 ml 管）	BD Diagnostics	367841	用于从小鼠血液中纯化外泌体
PAXgene 血液 RNA 管	BD Diagnostics	762165	用于从全血中分离 miRNA
miRVana microRNA 分离试剂盒	Ambion	AM1561
酸性酚: 氯仿（CHCl3）	Ambion	9721G
DNase 1	Qiagen	79254
TaqMan 通用 PCR 主混合液，不含 AmpErase UNG	Applied Biosystems	4326614	用于 TLDA 芯片
Megaplex RT 大鼠池组 v3.0	Applied Biosystems	4444746
Megaplex 预扩增大鼠池组 v3.0	Applied Biosystems	4444747
Taqman Array 大鼠 microRNA A+B 芯片组 v3.0	Applied Biosystems	4444909
Megaplex RT 人池组 v3.0	Applied Biosystems	4444745
Megaplex 预扩增人池组 v3.0	Applied Biosystems	4444748
Taqman Array 人 microRNA A+B 芯片组 v3.0	Applied Biosystems	4444913
Taqman MicroRNA RT 试剂盒	Applied Biosystems	4366596
Taqman 快速通用 PCR 主混合液	Applied Biosystems	4366072	用于 mRNA qRT-PCR
肿瘤坏死因子（引物探针）	Applied Biosystems	Hs01113624_g1
血管内皮生长因子 A（引物探针）	Applied Biosystems	Hs00900055_m1
Maxima 第一链 cDNA 合成试剂盒（用于 RT-qPCR）	Thermo Scientific	K1642	用于 mRNA
HSP70 抗体	Abcam	ab94368	用于 Western 印迹
抗兔 IgG-胶体金	Sigma	G7402	用于电子显微镜
兔抗 CD81	Sigma	SAB3500454
镍 300 目碳支持膜载网	Electron Microscopy Sciences	FCF300-Ni
铜 300 目碳支持膜载网	Electron Microscopy Sciences	FCF300-Cu
表 1. 特异性试剂列表。