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方法文章

可操控的哺乳动物细胞感染实验：原虫预处理的细菌感染方法

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DOI：

10.3791/50300

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2013年4月2日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health & Science University

本文内容

摘要

该技术提供了一种方法，用于收获、标准化并定量在感染哺乳动物细胞之前，经天然原生动物宿主细胞预培养的细菌病原体的胞内生长情况。该方法可进行修改，以适用于多种不同的宿主细胞作为启动阶段的培养系统，以及不同类型的靶细胞。

摘要

许多胞内细菌病原体利用淡水原生动物作为其在自然环境中增殖的天然储存宿主。 嗜肺军团菌，嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）作为军团菌病的致病因子，相较于 体外 从原生动物细胞中首次收获并在感染哺乳动物巨噬细胞之前培养的细菌。这表明重要的毒力因子可能未被正确表达 体外我们已开发出一种可操作的启动系统 L. pneumophila 通过其天然的原生动物宿主 Acanthamoeba castellanii 在感染哺乳动物细胞之前。通过比较经原生动物预处理后突变株与野生型细菌的胞内生长情况，可评估任何毒力因子的作用。表达GFP的野生型和突变株 L. pneumophila 使用菌株感染原生动物单层细胞，进行预感染步骤，并使其达到胞内生长的晚期阶段。随后从感染的细胞中收集荧光标记的细菌，并通过分光光度法进行归一化处理，以获得可用于后续哺乳动物巨噬细胞感染的等量细菌。为实现定量分析，感染后通过荧光显微镜、流式细胞术及菌落计数法对活菌进行监测。该技术通过模拟病原体在自然感染途径中所经历的环境，突出并依赖于宿主细胞依赖性基因表达的作用。该方法可进行调整，适用于任何利用中间宿主以获得致病优势的细菌。

引言

许多细菌病原体已进化出通用策略，以利用宿主细胞在细胞内区室中实现存活与复制。在多数情况下，病原体在原生生物细胞与后生动物细胞中的致病机制相似。然而，这两种微环境存在显著差异，可能导致毒力因子的差异性表达。1-4军团病细菌 嗜肺军团菌 在全球范围内的淡水环境中普遍存在5重要的是， L. pneumophila 在感染人单核细胞之前于原生动物细胞内培养的细菌具有致病优势，表明从原生动物细胞中释放出的细菌其整体基因表达谱与 体外 培养的生物体6-8在自然界中，淡水阿米巴原虫为入侵细菌的快速扩增提供了富含营养的生存环境。人类通过接触此类环境而感染 L. pneumophila 通常归因于吸入含有该细菌的受污染水滴。这些水滴很可能携带与原生动物细胞相关的细菌，而原生动物细胞对常规水处理措施具有更强的抵抗力。9,10肺泡巨噬细胞的感染过程与该细菌在原生动物宿主细胞内的胞内生命周期几乎相同。11-13.

为了在真核细胞内存活并复制，L. pneumophila 利用一种特化的 IVb 型分泌系统（称为 Dot/Icm）将近 300 种“效应蛋白”递送至宿主细胞的细胞质中14-16。这些效应蛋白共同作用，干扰宿主细胞的正常生理过程，从而为细菌建立一个允许复制的胞内环境17,18。若构成 Dot/Icm 转运系统的 26 个基因中任意一个发生缺失，均会导致菌株无法在细胞内正常增殖19-23。传统上，单个效应蛋白编码基因的缺失很少引起菌株在细胞内生长能力的减弱。这一现象被认为可能源于多种假说，包括效应蛋白功能的冗余性及其旁系同源拷贝的存在。

某些毒力因子仅在与宿主细胞相关的胞内生长环境中表达24。我们推断，如果某种效应蛋白仅在原生动物感染的背景下表达，那么当该菌株与野生型菌株均在体外培养时，便无法比较该效应蛋白的贡献。L. pneumophila 在培养进入稳定期时，会从复制相转变为传播相25。这种相变表型代表了胞内生长过程中所遇到的营养耗竭状态，并通过鞭毛的组装实现运动能力来体现26。由于从原生动物细胞中收获的L. pneumophila具有更强的侵袭性和毒力，因此我们致力于开发一种更能真实反映该细菌在接触宿主巨噬细胞时致病状态的检测方法。

为此，我们开发了一种通用的原生动物启动检测方法，可适用于任意合适的宿主细胞，用于第一阶段（启动细胞）和第二阶段（靶细胞）的感染。通过使用稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的细菌，该感染过程可被有效追踪。该原生动物的感染模型 Acanthamoeba castellanii 遵循该领域广泛使用的方法学27。对于引发步骤， L. pneumophila 菌株的培养 体外 进入液体培养基的稳定期，以产生标记的“传播型”细菌（图1A）。随后利用细菌感染单层培养的细胞 A. castellanii 孵育18小时以达到细胞内生命周期的晚期阶段。此时可通过荧光显微镜观察到含有细菌的大型液泡。图1A）。然后裂解原生动物细胞，从裂解液中回收细菌，并使用荧光酶标仪在512 nm处检测荧光发射值。通过将荧光值与光密度相关联，计算靶细胞感染的感染复数（MOI）。图1，*相关曲线)。侵袭后（T0) 和入侵后18小时（T18），通过检测荧光强度来定量靶细胞内的细菌数量。荧光信号可通过显微镜和流式细胞术进行监测，活菌数量则通过菌落计数法测定。该致敏实验始终伴随野生型菌株感染进行。 L. pneumophila 以及在Dot/Icm IV型分泌系统中存在缺陷的菌株（ΔdotA) (图1A）。这一点至关重要，可为野生型与感染过程中使用的任何同基因突变株之间的直接比较提供内部对照。包含无毒性的 ΔdotA 引物阶段的菌株培养设定了观察同基因型突变菌株减毒生长表型的阈值 体外.

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方案

1. 准备用于启动阶段感染的Legionella pneumophila培养物

  1. 转化全部 L. pneumophila 使用含有质粒pAM239的菌株，该质粒编码一种异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导型绿色荧光蛋白（GFP）28将菌株划线接种于添加铁和半胱氨酸的N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸培养基上 (含6.25 μg/ml氯霉素（CM）（用于质粒维持）的ACES缓冲活性炭酵母提取物琼脂（CYEA），37 °C培养72小时。
  2. 将细菌菌株的接种物转移至添加了6.25 μg/ml CM和1 mM IPTG的ACES缓冲酵母提取物肉汤（AYE）中，在37 °C条件下于摇床中培养至稳定期（O/N）。
  3. 确认GFP表达 体外 使用荧光显微镜观察培养物。取10 μl培养物置于载玻片上，加盖盖玻片，使用60倍物镜配合GFP激发/发射滤光片组（AMG EVOS fl）进行成像。
  4. 稀释每份100 μl的等分试样 体外 使用无菌 H 将培养物按 1:10 稀释2O. 使用含1 mM IPTG和6.25 μg/ml cm的100 μl AYE培养基加水制备空白对照。使用分光光度计（Bio-Rad Smart Spec Plus）测定各稀释液的OD600值。计算以MOI = 20感染每个孔所需的体积 体外 培养：V = [（接种的阿米巴数量）× 感染复数（MOI）] / OD600 x（稀释倍数）x（常数）] = [（1 × 106) × (20)]/[OD600 x (10) x (1 x 106)] = 2/OD600细菌浓度通过OD值测定600 = 1.0 = 1 × 109 CFU/ml

2. 使用Acanthamoeba castellanii进行启动阶段感染

  1. 在室温下，使用 ATCC 712 PYG 培养基于 175 cm2 培养瓶中培养和维持阿米巴原虫。
  2. 在启动细菌液体培养前 24 小时，更换阿米巴原虫培养物的培养基。在同一天启动液体细菌培养时，使用血细胞计数板在光学显微镜下收集并计数细胞。
  3. 用新鲜培养基将阿米巴原虫稀释至终浓度为 1 × 106 个细胞/ml。使用重复移液器向 12 孔细胞培养板中每孔加入 1 ml 阿米巴原虫悬液，并在室温下孵育过夜。
  4. 孵育后，使用 10 ml 移液管和手动移液辅助器，用 1 ml 无菌 PBS 洗涤 12 孔细胞培养板各孔 3 次。
  5. 吸除 PBS 后，向每孔加入 1 ml 感染培养基（ATCC 712 PYG 培养基，不含葡萄糖、蛋白胨和酵母提取物），并添加 1 mM IPTG 和 6.25 μg/ml 氯霉素（cm）。在室温下孵育 1 小时。
  6. 以 MOI = 20 进行感染。将培养板在 400 × g 条件下离心 5 分钟（Eppendorf 5810R），随后在 37 °C 水浴中漂浮 5 分钟。将培养板转移至 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 18 小时。
  7. 在宿主细胞裂解和细菌收获前，通过荧光显微镜进行活细胞成像以确认感染情况。

3. 靶细胞阶段感染的 THP-1 细胞接种

  1. （在接种液体细菌培养物前 24 小时开始此步骤）。将 THP-1 细胞在含有 10% 热灭活胎牛血清（FBS）的 RPMI 1640 培养基中，于 75 cm2 培养瓶内培养至接近汇合状态。
  2. 使用血细胞计数板对悬浮细胞进行计数，将 THP-1 细胞用含 10% FBS 和 100 ng/ml 佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸盐（PMA）的 RPMI 1640 培养基稀释至浓度为 1 × 106 个细胞/ml，每孔加入 1 ml 接种于 12 孔细胞培养板中。于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 48 小时。

4. 初始感染阶段后用于靶细胞阶段感染的细菌处理

  1. 吸出已预处理的阿米巴培养液。
  2. 使用500 μl 冰冷、无菌超滤（UF）H2O，并在室温下孵育10分钟。
  3. 根据菌株类型合并裂解液，并取一份 E512 nm 使用荧光酶标仪（Molecular Devices Spectramax Gemini EM）对每份混合裂解液进行检测。
  4. 计算 OD600 混合裂解液的测量：calcOD600 = 0.0008(E512 - 裂解液本底）+ 0.0019。该公式先前通过绘制 OD 值直接比较的图表确定600 和 E512 nm 稀释液的测量 L. pneumophila 表达GFP的野生型，处于静止期 体外 培养图1*）未感染阿米巴原虫的裂解液在与感染阿米巴原虫相同的实验条件下处理，用作空白对照，并提供校正值（例如 裂解液背景），该参数已纳入方程。针对每种裂解液样本，计算在感染复数（MOI）= 20 时感染一个孔所需的体积：V = [(接种的 THP-1 细胞数) × MOI] / [calcOD600 x（常数）] = [（1 × 106) × (20)] / [calcOD600 x（1 × 106)] = 20 / calcOD600.
  5. 用 PBS 洗涤 THP-1 细胞 3 次，每孔加入 1 ml 新鲜 RPMI 1640 培养基（含 10% FBS）。将 THP-1 细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 1 小时2.
  6. 使用混合裂解液，按照计算出的感染复数（MOI）感染THP-1细胞。保留一组孔不进行感染，作为流式细胞术分析的阴性对照。启动阶段的处理应在30分钟内完成。裂解液需置于冰上，以限制感染前细菌基因表达的变化。
  7. 离心培养板，漂浮以升高温度，并按照引发阶段的条件进行孵育。
  8. 感染一小时后，用移液枪吸除培养基，并用 PBS 洗涤孔板 3 次，以去除细胞外细菌。
  9. 向孔中加入 1 ml 新鲜 RPMI 1640 培养基（含 10% FBS），并将培养板放回培养箱。培养基更换后的即刻时间记为零时（T0）。将THP-1细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育14–16小时2.

5. 实验分析

5.1 活细胞成像

使用荧光显微镜（AMG EVOS fl）在10倍或20倍放大倍数下对感染的孔进行成像（图1A-D）。可通过定性或定量方式比较图像，以确定引发阶段和靶细胞阶段感染的水平。

5.2 流式细胞术

  1. 可通过流式细胞术（BD FACS Calibur）比较不同感染的发射峰。用移液器将感染的 THP-1 细胞在 PBS 中轻轻吹打重悬以从孔中收集，并进行消化处理。
  2. 按菌株类型将细胞收集至 15 ml Falcon 管中，在台式离心机中以 1,800 × g 离心 2 分钟，形成细胞沉淀。
  3. 将沉淀重悬于 1 ml PBS 中，并转移至 1.5 ml 微量离心管。
  4. 将悬液在 Eppendorf 5424 离心机中以 1,800 × g 离心，然后将沉淀重悬于 1 ml PBS 中。如果所得悬液浑浊度较高（OD600 ≥ 1.0），则需用额外的 PBS 稀释（1:3），以防止流式细胞仪管路堵塞。
  5. 使用无菌过滤的 PBS 对流式细胞仪进行平衡，并用于样品进样间的洗涤步骤。在注入感染样品前，先绘制未感染靶细胞的前向散射/侧向散射图。
  6. 使用 488 nm 激光激发和 FL1 通道，每种条件下收集总计 20,000 个事件。
  7. 设门获取感染后的细胞群体，排除未感染细胞，并在直方图中绘制荧光强度（FlowJo）（图 1E）。

5.3 菌落形成单位（CFU）涂布

  1. 通过将用于流式细胞术的收获细胞进行CFU平板培养，检测感染效率。用超滤的H制备样品的系列稀释液2O₂ 在 10-1, 10-2，和10-3.
  2. 将每种稀释液各取 20 μl，涂布于含 6.25 μg/ml CM 的 CYEA 平板的三分之一区域。
  3. 将培养板在37 °C孵育72小时。
  4. 使用牙签和细胞计数器对菌落进行计数。

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结果

整个感染过程的典型结果概述如下 图1活细胞荧光显微图像，显示单层细胞 A. castellanii 感染野生型 L. pneumophila 引物结合阶段如图所示 图1A成功的启动步骤检测结果应显示约90%的宿主细胞中含有大量被GFP标记的细菌所占据的空泡（在此感染复数下）。感染后18小时，大多数 A. castellanii 细胞已达到最大细菌载量，但群体裂解程度极低。在光学显微镜下，成功的引物感染将显示出呈圆形且脱离的阿米巴样细胞。Gentamycin [25 μg/ml可在感染后30分钟至1小时将]加入培养基，以消除胞外细菌的干扰。ΔdotA 无法支持 Dot/Icm 介导效应蛋白转运的突变菌株，不应在其中生长 A. castellanii 尽管 体外 培养物应与野生型菌株一样发出荧光，而该菌株在感染后18小时应仅检测到最低程度的荧光。阿米巴虫会呈现扁平状，单层结构应保持完整。

总裂解物中含有 ...

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讨论

细菌基因表达通过生命周期进程与周围微环境信号响应的共同作用而受到严密调控。当空泡内病原体（如 L. pneumophila）被分隔在吞噬体中时，会响应多种宿主细胞来源的信号。由于宿主细胞内营养物质耗竭的综合作用，该细菌通过表达促进成功传播至下一个宿主细胞所必需的因子来进行补偿25。L. pneumophila 已适应于高效寄生多种原生动物细胞，因此携带了大量效应蛋白以驱动这一过程。这些效应蛋白在感染过程中由 Dot/Icm IVb 型分泌系统直接转运至宿主细胞质中16。效应蛋白的转运是必需的，因为导致转运蛋白缺陷的突变会完全阻断该菌在任何类型宿主细胞内的胞内增殖。然而奇怪的是，单个效应蛋白的缺失通常极少引起胞内生长减弱。已有近 300 种效应蛋白（约占编码蛋白质基因组的 10%）被证实为 Dot/Icm 的底物14,15。针对效应蛋白缺失后缺乏可观察表型的现象，已提出多种假说加以解释，包括存在旁系同源拷贝，或由于 L. pneumophila 宿主范围广泛而水平获得了直系同源酶类。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢 Craig Roy 博士和 Dario Zamboni 博士提供原生动物细胞感染实验的模板。感谢 Jagdeep Obhrai 博士、Georgiana Purdy 博士、Fred Heffron 博士以及 Todd Wisner 提供仪器和试剂；感谢 Lulu Cambronne 博士对稿件的审阅。流式细胞术在俄勒冈健康与科学大学（OHSU）共享资源流式细胞术平台完成。本研究部分得到俄勒冈医学研究基金会资助以及美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R21 AI088275（E.D.C.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
氯霉素Fisher ScientificBP904-100抗生素
IPTGFisher ScientificBP1755-10
ACESSigmaA9758-1KG培养基组分
ATCC 培养基：712 PYGATCC原生动物生长培养基
1× PBSFisher ScientificSH30256FS磷酸盐缓冲液
活性炭Fisher ScientificC272-212培养基组分
酵母提取物Fisher ScientificBP1422-500培养基组分
蛋白胨BD Diagnostics211677培养基组分
琼脂Fisher ScientificBP1423-2培养基组分
L-半胱氨酸，99%以上Acros Organics173601000培养基添加剂
硝酸铁九水合物Fisher ScientificI110-100培养基添加剂
设备
EVOS flAMGEVOS fl荧光显微镜
Smart Spec PlusBio-Rad170-2525分光光度计
5810 R 离心机Eppendorf22627023台式离心机
Repeater plusEppendorf22230201多通道移液器
SpectraMax Gemini EMMolecular Devices酶标仪
Softmax Pro 5.3Molecular Devices0200-310酶标仪软件
5424 微型离心机Eppendorf22620401台式微量离心机
Fast-release pipette pump IIScienceware379111010移液辅助器
FACS CaliburBD Bioscience流式细胞仪
FlowJo 7.6.1FlowJolicense流式细胞术分析软件
15 ml 离心管BD Falcon352096聚丙烯圆锥形离心管
1.6 ml 微量离心管Neptune3745.X微量离心管

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