可操控的哺乳动物细胞感染实验：原虫预处理的细菌感染方法

摘要

该技术提供了一种方法，用于收获、标准化并定量在感染哺乳动物细胞之前，经天然原生动物宿主细胞预培养的细菌病原体的胞内生长情况。该方法可进行修改，以适用于多种不同的宿主细胞作为启动阶段的培养系统，以及不同类型的靶细胞。

摘要

许多胞内细菌病原体利用淡水原生动物作为其在自然环境中增殖的天然储存宿主。 嗜肺军团菌，嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）作为军团菌病的致病因子，相较于 体外 从原生动物细胞中首次收获并在感染哺乳动物巨噬细胞之前培养的细菌。这表明重要的毒力因子可能未被正确表达 体外我们已开发出一种可操作的启动系统 L. pneumophila 通过其天然的原生动物宿主 Acanthamoeba castellanii 在感染哺乳动物细胞之前。通过比较经原生动物预处理后突变株与野生型细菌的胞内生长情况，可评估任何毒力因子的作用。表达GFP的野生型和突变株 L. pneumophila 使用菌株感染原生动物单层细胞，进行预感染步骤，并使其达到胞内生长的晚期阶段。随后从感染的细胞中收集荧光标记的细菌，并通过分光光度法进行归一化处理，以获得可用于后续哺乳动物巨噬细胞感染的等量细菌。为实现定量分析，感染后通过荧光显微镜、流式细胞术及菌落计数法对活菌进行监测。该技术通过模拟病原体在自然感染途径中所经历的环境，突出并依赖于宿主细胞依赖性基因表达的作用。该方法可进行调整，适用于任何利用中间宿主以获得致病优势的细菌。

引言

许多细菌病原体已进化出通用策略，以利用宿主细胞在细胞内区室中实现存活与复制。在多数情况下，病原体在原生生物细胞与后生动物细胞中的致病机制相似。然而，这两种微环境存在显著差异，可能导致毒力因子的差异性表达。^1-4军团病细菌 嗜肺军团菌 在全球范围内的淡水环境中普遍存在⁵重要的是， L. pneumophila 在感染人单核细胞之前于原生动物细胞内培养的细菌具有致病优势，表明从原生动物细胞中释放出的细菌其整体基因表达谱与 体外 培养的生物体^6-8在自然界中，淡水阿米巴原虫为入侵细菌的快速扩增提供了富含营养的生存环境。人类通过接触此类环境而感染 L. pneumophila 通常归因于吸入含有该细菌的受污染水滴。这些水滴很可能携带与原生动物细胞相关的细菌，而原生动物细胞对常规水处理措施具有更强的抵抗力。^9,10肺泡巨噬细胞的感染过程与该细菌在原生动物宿主细胞内的胞内生命周期几乎相同。^11-13.

为了在真核细胞内存活并复制，L. pneumophila 利用一种特化的 IVb 型分泌系统（称为 Dot/Icm）将近 300 种“效应蛋白”递送至宿主细胞的细胞质中^14-16。这些效应蛋白共同作用，干扰宿主细胞的正常生理过程，从而为细菌建立一个允许复制的胞内环境

方案

1. 准备用于启动阶段感染的Legionella pneumophila培养物

1. 转化全部 L. pneumophila 使用含有质粒pAM239的菌株，该质粒编码一种异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导型绿色荧光蛋白（GFP）²⁸将菌株划线接种于添加铁和半胱氨酸的N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸培养基上 (含6.25 μg/ml氯霉素（CM）（用于质粒维持）的ACES缓冲活性炭酵母提取物琼脂（CYEA），37 °C培养72小时。
2. 将细菌菌株的接种物转移至添加了6.25 μg/ml CM和1 mM IPTG的ACES缓冲酵母提取物肉汤（AYE）中，在37 °C条件下于摇床中培养至稳定期（O/N）。
3. 确认GFP表达 体外 使用荧光显微镜观察培养物。取10 μl培养物置于载玻片上，加盖盖玻片，使用60倍物镜配合GFP激发/发射滤光片组（AMG EVOS fl）进行成像。
4. 稀释每份100 μl的等分试样 体外 使用无菌 H 将培养物按 1:10 稀释₂O. 使用含1 mM IPTG和6.25 μg/ml cm的100 μl AYE培养基加水制备空白对照。使用分光光度计（Bio-Rad Smart Spec Plus）测定各稀释液的OD600值。计算以MOI = 20感染每个孔所需的体积 体....

结果

整个感染过程的典型结果概述如下 图1活细胞荧光显微图像，显示单层细胞 A. castellanii 感染野生型 L. pneumophila 引物结合阶段如图所示 图1A成功的启动步骤检测结果应显示约90%的宿主细胞中含有大量被GFP标记的细菌所占据的空泡（在此感染复数下）。感染后18小时，大多数 A. castellanii 细胞已达到最大细菌载量，但群体裂解程度极低。在光学显微镜下，成功的引物感染将显示出呈圆形且脱离的阿米巴样细胞。Gentamycin [25 μg/ml可在感染后30分钟至1小时将]加入培养基，以消除胞外细菌的干扰。ΔdotA 无法支持 Dot/Icm 介导效应蛋白转运的突变菌株，不应在其中生长 A. castellanii 尽管 体外 培养物应与野生型菌株一样发出荧光，而该菌株在感染后18小时应仅检测到最低程度的荧光。阿米巴虫会呈现扁平状，单层结构应保持完整。

总裂解物中含有 .......

讨论

细菌基因表达通过生命周期进程与周围微环境信号响应的共同作用而受到严密调控。当空泡内病原体（如 L. pneumophila）被分隔在吞噬体中时，会响应多种宿主细胞来源的信号。由于宿主细胞内营养物质耗竭的综合作用，该细菌通过表达促进成功传播至下一个宿主细胞所必需的因子来进行补偿²⁵。L. pneumophila 已适应于高效寄生多种原生动物细胞，因此携带了大量效应蛋白以驱动这一过程。这些效应蛋白在感染过程中由 Dot/Icm IVb 型分泌系统直接转运至宿主细胞质中¹⁶。效应蛋白的转运是必需的，因为导致转运蛋白缺陷的突变会完全阻断该菌在任何类型宿主细胞内的胞内增殖。然而奇怪的是，单个效应蛋白的缺失通常极少引起胞内生长减弱。已有近 300 种效应蛋白（约占编码蛋白质基因组的 10%）被证实为 Dot/Icm 的底物^14,15。针对效应蛋白缺失后缺乏可观察表型的现象，已提出多种假说加以解释，包括存在旁系同源拷贝，或由于 L. pneumophila 宿主范围广泛而水平获得了直系同源酶类。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
氯霉素	Fisher Scientific	BP904-100	抗生素
IPTG	Fisher Scientific	BP1755-10
ACES	Sigma	A9758-1KG	培养基组分
ATCC 培养基：712 PYG	ATCC		原生动物生长培养基
1× PBS	Fisher Scientific	SH30256FS	磷酸盐缓冲液
活性炭	Fisher Scientific	C272-212	培养基组分
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-500	培养基组分
蛋白胨	BD Diagnostics	211677	培养基组分
琼脂	Fisher Scientific	BP1423-2	培养基组分
L-半胱氨酸，99%以上	Acros Organics	173601000	培养基添加剂
硝酸铁九水合物	Fisher Scientific	I110-100	培养基添加剂
设备
EVOS fl	AMG	EVOS fl	荧光显微镜
Smart Spec Plus	Bio-Rad	170-2525	分光光度计
5810 R 离心机	Eppendorf	22627023	台式离心机
Repeater plus	Eppendorf	22230201	多通道移液器
SpectraMax Gemini EM	Molecular Devices		酶标仪
Softmax Pro 5.3	Molecular Devices	0200-310	酶标仪软件
5424 微型离心机	Eppendorf	22620401	台式微量离心机
Fast-release pipette pump II	Scienceware	379111010	移液辅助器
FACS Calibur	BD Bioscience		流式细胞仪
FlowJo 7.6.1	FlowJo	license	流式细胞术分析软件
15 ml 离心管	BD Falcon	352096	聚丙烯圆锥形离心管
1.6 ml 微量离心管	Neptune	3745.X	微量离心管