使用[13C]-辛酸呼气试验评估非肥胖型糖尿病小鼠的胃排空

摘要

采用无创的[¹³C]-辛酸呼气试验测定雌性NOD LtJ小鼠胃排空，用于追踪胃轻瘫。

摘要

由于缺乏能够在同一只动物体内连续监测胃排空变化的技术，小鼠胃排空研究一直受到限制，因为最常用的方法需要处死动物并通过死后取餐法来检测食物残留量^1,2。这种方法无法开展纵向研究，因而难以评估胃排空随年龄增长或疾病进展发生的变化。常用于人类的[¹³C]-辛酸呼气试验³ 已被改良并应用于小鼠^4-6 和大鼠⁷，我们先前的研究表明，该改良方法在检测药物干预及糖尿病进展过程中胃排空变化方面具有良好的可靠性和敏感性⁸。本视频演示将详细讲解该改良呼气试验的原理及实际操作流程。与之前的研究一致，本实验采用NOD LtJ小鼠，这是一种1型糖尿病模型⁹。其中部分小鼠会发展出胃轻瘫症状，这是糖尿病的一种并发症，表现为在无胃机械性梗阻的情况下出现胃排空延迟¹⁰。

本文演示了如何训练小鼠进行检测，如何制备测试餐并获取4小时胃排空数据，以及如何分析所获得的数据。本研究所使用的碳同位素分析仪适用于同时自动采集最多12只小鼠的空气样本。该技术可实现对患有糖尿病或其他慢性疾病的小鼠群体进行胃排空的纵向随访观察。

引言

本文阐述了在小鼠中进行胃排空无创测量所涉及的技术与方法学考量。通过遵循此处描述的实验方案，研究人员能够可靠且可重复地监测疾病发展所致的胃排空变化，研究药物对胃排空的影响，并评估基础疾病或缺陷治疗后胃排空的反应^6,8,11,12。在以往的研究中，¹³C辛酸呼气试验已被证明是测量人类和动物胃排空的有效方法^3,8。本文详细描述了在糖尿病小鼠胃排空纵向研究中，为获得可靠数据所需在6至8个月内执行的各项操作步骤。与先前发表的方法相比，遵循本方案的优势在于研究人员可确保所获得的数据具有可靠性和可重复性。此外，本文所述用于采集和分析气体样本的自动化系统，可提高在一项研究中同时监测的动物数量。总体而言，本文旨在确定维持小鼠对检测适应性的关键因素，并减少实验结果的变异性。

为了进行胃排空的体内测量，小鼠需禁食过夜，然后放入具有恒定气流的透明塑料测试舱中。待小鼠适应测试管后，测定其呼出气体中¹³CO₂的基础水平，并相应调整气流。随后，给予小鼠一种由蛋黄与¹³C标记的辛酸混合组成的测试餐。由于小鼠处于禁食状态且经过训练，通常会在2分钟内吃完测试餐。所给予的辛酸在胃中不被吸收，而是在十二指肠被吸收，并在肝脏中代谢为¹³CO₂，随后释放并经呼气排出，导致周围空气中的¹³CO₂

方案

1. 小鼠的训练与适应

1. 分析前，将所有小鼠放入检测室中，保持持续气流，持续 2-4 小时，以使其适应检测条件。这能显著降低应激水平，避免因应激导致胃排空延迟的异常检测结果。操作方式应与进行胃排空实验时完全相同。准备蛋黄（见下文），不添加辛酸，每只小鼠喂食 0.2 g。
2. 重复此过程，直至小鼠充分训练（通常 2-3 次）。只要环境条件保持一致，小鼠通常很容易适应。

注意：未适应环境的小鼠在转移至实验箱后会持续活动约1小时，并频繁排便和排尿；而经过环境适应的小鼠则会迅速安顿于新环境中，安静休息。

注意： 实验过程中：应监测动物是否出现习惯化丧失的迹象，例如过度排尿、排便、对食用鸡蛋缺乏兴趣等。若出现此类情况，建议在获取胃排空数据前，于空箱中重新进行1至2次习惯化。本实验中保持一致性极为重要。只有每次以完全相同的方式操作，才能获得可靠且可重复的结果。这包括每天在同一时间给予处理（例如胰岛素），除非绝对必要否则不将小鼠与其笼内同伴分离，同时进行禁食并在同一时间开始胃排空检测，以及以相同方式抓取和处理小鼠。

2. 含同位素测试餐的制备

1. 在50 ml离心管中称取5 g蛋黄。每次实验当天均需重复这些步骤，以制备....

结果

来自三只不同小鼠的代表性数据集如图2所示。黑色曲线代表胃排空正常小鼠的数据点，显示的是呼出气体中回收的¹³C占给药剂量的百分比随时间（每小时）的变化情况。蓝色曲线来自胃排空加速的小鼠，其半排空时间（T half）为40分钟；红色曲线来自胃排空延迟的小鼠，其半排空时间为168分钟。根据本实验室先前的一项研究⁷，非糖尿病NOD小鼠（9–15周龄）的正常胃半排空时间范围为62至131分钟，如图中灰色区域所示。随后，数据点通过以下方程进行非线性回归曲线拟合⁸：

y = at^be^-ct

其中 y 表示每小时呼出气体中¹³C 的回收百分比（t），a、b 和 c 为针对每条呼气与时间曲线估算的回归常数。半排空时间（T_1/2）

通过使用逆伽马函数的数值积分过程进行计算。我们已从数千项研究中获得结果，其小.......

讨论

本文所述技术可对小鼠的固体胃排空进行重复且无创的体内测量。该系统的优点在于，动物在测量过程中无需被固定，可在测量腔内自由移动和转身。由于该环境对小鼠而言较为陌生，仍需对其进行训练并使其适应测试腔，以避免应激反应对胃排空的影响。通常情况下，若同一只小鼠在连续胃排空测试中的个体内变异小于10%，则认为胃排空数据可靠。

本报告是对我们先前关于小鼠胃排空测量研究的进一步详细阐述^8,11,12 ，并新增了有关系统故障排查的补充信息。主要改进之处在于采用LGR同位素分析仪来测定气体水平。本研究所使用的分析仪可每秒连续测定¹²CO₂、¹³CO₂和H₂O的浓度。多通道进样单元中的计算机控制阀门可自动在25秒间隔内轮流将各小鼠代谢舱的气流切换至检测器。因此，可同时对12只小鼠进行分析，每次读数间隔为5分钟。需要注意的是，数据也可通过手动采集呼出气体样本并进行后续分析获得。若采用手动采样或使用其他设备，应确保读数间隔约为10分钟。本系统的高灵敏度以及高频.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
恒定的空气供应源，包括流速和气体成分	研究设施中的中央空气供应系统
130 ml采样室，带有空气入口、空气出口和食物给入孔 用于供气的塑料管	自行研制
辛酸	Cambridge Isotope Laboratories（安多弗，马萨诸塞州）	CLM-293-1
制备蛋餐所需材料： 小烧杯 50 ml塑料离心管 本生灯 鸡蛋 刮勺	任意供应商		尽量保持鸡蛋供应商的一致性，因为鸡蛋的营养成分和适口性可能影响摄食量和胃排空速度
二氧化碳同位素分析仪	Los Gatos Research Inc.（芒廷维尤，加利福尼亚州）