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方法文章

in vivo 条件下小鼠肺血管内皮表面层的测量

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DOI：

10.3791/50322

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2013年2月22日

 ,  , 
1Division of Pulmonary Sciences and Critical Care Medicine, University of Colorado School of Medicine

本文内容

摘要

内皮糖萼/内皮表面层最适合通过活体显微镜进行研究。在肺等运动器官中，活体显微镜技术上具有挑战性。我们展示了如何结合明场与荧光显微镜技术，在自由运动的组织中估算内皮表面层厚度 体内 小鼠肺

摘要

内皮糖萼是一层由蛋白聚糖及其相关的氨基葡聚糖组成的结构，衬于血管腔内表面。在体条件下，糖萼高度水化，形成显著的内皮表面层（ESL），有助于维持内皮功能。由于内皮糖萼在体外常出现异常，并且在标准组织固定过程中会丢失，因此对ESL的研究需采用活体显微技术。为了最接近肺泡微血管系统的复杂生理状态，理想的肺部活体成像应在自由运动的肺上进行。然而，这类实验通常会受到严重运动伪影的干扰。我们展示了如何通过闭胸活体显微镜观察自由呼吸的小鼠肺，利用荧光标记的高分子量葡聚糖在内皮表面的排除情况来评估糖萼的完整性。这种非恢复性外科技术需要同时对小鼠肺进行明场和荧光成像，可实现对胸膜下微血管的长期观察，且未见诱发混杂性肺损伤的证据。

引言

内皮糖萼是一种位于血管内膜表面的富含蛋白聚糖及相关氨基葡聚糖的细胞外层。在体内，糖萼高度水化，形成显著的内皮表面层（ESL），调控多种内皮功能，包括液体通透性1、中性粒细胞-内皮细胞黏附2以及流体剪切应力的力传导3。

历史上，由于糖萼在培养细胞样本中存在异常，其重要性一直被低估4, 5 及其在标准组织固定与处理过程中的降解6使用量的不断增加7 活体显微镜技术（体内 显微镜技术（IVM）的发展与科学界对健康和疾病状态下血管壁表面层（ESL）在血管功能中重要性的日益关注 coincided。ESL 对光学显微镜不可见，且难以进行标记。 体内，鉴于荧光标记的糖萼结合凝集素易引起红细胞凝集8 以及致死性肺栓塞（未发表的观察结果）。因此，已开发出多种间接方法，用于推断非流动血管床（如提睾肌和肠系膜微循环）中糖萼层厚度（进而反映糖萼完整性）。这些技术包括测量循环微粒在距离内皮膜不同位置处的流速差异（微粒成像测速法）9以及大分子荧光标记血管示踪剂排泄情况的测定（例如 葡聚糖）从内皮表面排除的技术（葡聚糖排除法）10, 11）。在这些技术中，只有葡聚糖排阻法能够通过单一时点的测量来估算糖萼层（ESL）厚度。通过明场显微镜测量血管宽度（该宽度包含“不可见”的ESL）的同时，利用荧光显微镜观察被ESL排阻的血管示踪剂，ESL厚度可计算为两者血管宽度差值的一半。2.

瞬时测量血管内皮糖萼层（ESL）厚度的方法非常适合用于肺部糖萼的研究。由于存在显著的肺部和心脏运动伪影，对肺部进行活体显微成像具有较大挑战性。尽管近期的技术进展已能够实现小鼠肺部在体内的固定in vivo12, 13，但人们仍担忧肺部静止状态可能对生理功能造成影响。肺部不动与内皮一氧化氮信号通路减弱相关14，而该信号通路会影响中性粒细胞黏附15和肺损伤16。此外，固定局部肺组织会使周围可活动的肺泡暴露于有害的剪切力之下（即所谓的“萎陷性损伤”），这符合肺泡相互依赖性的经典生理学概念17。

2008年，Arata Tabuchi、Wolfgang Kuebler 及其同事开发了一种外科技术，可实现对自由活动小鼠肺部的活体显微观察18呼吸运动由此技术产生的伪影可通过高速成像予以消除，包括明场与荧光显微镜的同步测量。本报告详细阐述了如何利用瞬时葡聚糖排阻成像技术，在自由活动动物的胸膜下微循环中测量糖萼层（ESL）厚度， 在体 小鼠肺。该技术可轻松改进，用于测定糖萼功能——特别是完整内皮表面层（ESL）阻止循环成分接近内皮表面的能力。我们近期已采用这些技术，确定肺部ESL完整性在脓毒症等全身性炎症疾病过程中对急性肺损伤发生发展的重要性。2.

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方案

1. 手术导管、血管导管和胸壁窗口的制备

  1. 活体显微镜观察平台。 我们自行设计了一个丙烯酸材质的观察平台，用于在显微镜检查期间放置麻醉状态的小鼠。该平台可容纳一块15 cm × 10 cm的柔性塑料砧板（用于小鼠麻醉诱导、气管切开术和静脉插管时放置小鼠），以及一个尺寸相似的加热元件（位于砧板下方）。
  2. 小鼠胸腔造口管制备（图1）。截取一段10 cm长的PE 50导管（Intramedic，内径0.58 mm，外径0.965 mm）。将其一端连接至一根弯头23号钝针的钝端；该针将用于在关闭胸腔窗之前，将导管从胸壁内侧穿至外侧（内→外）。
    导管远端（长度1.5 cm，与连接23号针的一端相对）用30号针头反复穿刺，形成“侧孔”，以促进胸腔内气体的有效抽吸。
    该带孔段随后通过数圈4:0丝线缝合环扎与导管其余部分隔开；这些缝线环将作为“限位器”，最终将1.5 cm长的带孔段固定于胸腔内。
  3. 颈静脉导管。 截取两段15 cm长的PE 10导管（Intramedic，内径0.28 mm，外径0.61 mm）。使用手术刀将导管末端削成斜面，以提高静脉穿刺的便利性。通过连接在导管非斜面端的1 ml注射器（内含6% 150 kDa葡聚糖溶液（溶于PBS））冲洗导管。
  4. 胸壁观察窗制备（图2）。 将透明聚偏二乙烯膜（New Kure Wrap, Kuresha, Tokyo）裁剪成椭圆形（长轴6 cm，短轴4 cm）。使用α-氰基丙烯酸酯胶（Pattex flüssig, Henkel, Düsseldorf）将一个直径5 mm的圆形#1盖玻片（Bellco）固定于膜上。
  5. 气胸诱导用导管（“吹气管”）。 将一段10 cm长的导管（内径3 mm，外径5 mm）连接至5 ml注射器；其另一端用于在胸壁观察窗植入前向动物胸腔内注入空气。
  6. 物镜水浸用注射器。 将一根23号针头连接至装有蒸馏水的30 ml注射器。针尖经金属锉钝化处理，以防止损伤物镜。

2. 小鼠麻醉

  1. 用氯胺酮（10 mg/ml）和赛拉嗪（2 mg/ml）的混合物对小鼠进行腹腔注射麻醉，剂量为每克小鼠体重 8 μl。镇静作用在 3 - 6 分钟内出现，且不应抑制自主呼吸。
  2. 使用电动剃刀剃除小鼠的喉部、胸部、腹部及右侧体表毛发。
  3. 用胶带将小鼠固定在一块薄塑料切板上，小鼠头部朝向操作者（图 3）。通过穿过上齿的缝合线环施加轻柔张力，以保持头部伸展。切板置于加热垫上，以在气管切开术和静脉导管置入期间维持小鼠正常体温。
  4. 用 100% 乙醇润湿已剃毛的区域。
  5. 通过夹捏尾巴或足掌确认麻醉深度。若反应微弱，可继续操作；若麻醉不足，应追加一次氯胺酮/赛拉嗪剂量。

3. 气管切开术

  1. 在喉部做一长约1 cm的切口。分离下方结缔组织，将唾液腺向两侧牵开。切除气管前方的胸骨舌骨肌。
  2. 将一根4-0缝线环从气管下方穿过（图4）。随后剪断该缝线环，形成两条位于气管下方的独立缝线。尾侧缝线用于固定气管切开套管；头侧缝线则在放置气管切开套管时用于牵拉气管，提供张力。
  3. 用两根手指夹住上方的缝线，并对气管施加轻柔张力。在上下两根缝线之间沿气管做一水平切口，切口长度应大约占气管周径的三分之二。将带法兰的气管切开套管（Harvard Apparatus，外径1.22 mm）插入远端气管，并用尾侧气管缝线固定。
  4. 将气管切开套管连接至容量控制式小型动物呼吸机（Inspira，Harvard Apparatus），以吸入氧浓度40%、潮气量9 ml/kg对小鼠进行通气（该参数设置已在本实验室优化，可维持充分的氧合与通气）。此时暂不启用呼气末正压（PEEP）。需注意，呼吸机参数应根据各实验室的具体条件进行优化。可通过在呼吸机管路Y型接头与气管切开套管之间连接不同长度的冗余管路来调节死腔，从而确保在选定潮气量下实现稳定的肺泡通气。

4. 静脉插管

  1. 通过从远端静脉分支向近端追踪，可确定颈内静脉与颈外静脉的汇合处。颈外静脉位于翻起的唾液腺下方，可沿其向近端追踪以找到颈外-颈内静脉汇合处。
  2. 使用轻柔的钝性分离法将颈静脉汇合处与其周围的结缔组织分开。
  3. 使用4:0缝线，在颈静脉汇合处远端（头侧）结扎颈外静脉和颈内静脉。
  4. 在颈静脉汇合处的隆嵴处做一个小切口；出血应极少。
  5. 可将两根导管逐步经切口插入并推进至颈静脉主干。轻柔抽吸确认回血后，使用4:0缝线将导管固定于静脉内。
  6. 用胶带将静脉导管固定在操作板上，以防意外脱出。

5. 小鼠活体肺显微成像手术（改编自 Tabuchi et al.18）

  1. 将固定有麻醉小鼠及已用胶带固定的静脉导管的手术板转移至活体显微镜载物台上，以进行后续外科操作。插入直肠温度探针，该探针与位于手术板下方的自适应加热系统相连接，用于维持小鼠正常体温。
  2. 一条颈静脉导管连接至注射泵，以每小时200 μl的速度输注氯胺酮（10 mg/ml）-赛拉嗪（2 mg/ml）混合液。通过尾部/足部夹捏反应再次确认麻醉深度是否充分。
  3. 从颈部向剑突作正中切口，然后向右侧横向延伸（图5).
  4. 使用电灼术去除胸部肌肉组织，暴露胸廓。操作时需确保完全止血。
  5. 将小鼠右后肢交叉至左侧并用胶带固定。由此产生的腹部扭转可使胸腔轻微旋转，便于手术操作。
  6. 将载物台置于45度角图6）；这种体位可使肺在气胸形成后自然远离胸壁。
  7. 1st 用镊子夹住最下缘的肋骨并提起；将弯头镊子钝性推入肋骨下方，以分离壁层胸膜与胸壁。操作过程中应保持胸膜完整，避免穿刺。
  8. 使用吹管和注射器，将空气强力注入壁层胸膜。这会导致胸膜表面破裂并形成气胸，而不会损伤 underlying 肺组织。 underlying 肺组织将随之与胸壁分离，从而可置入电灼钳而不损伤肺。此步骤通常无需降低呼吸机的潮气量。
  9. 使用电凝镊解剖胸壁肌肉组织，并横行切开第5肋间th 和 6th 肋骨/壁层胸膜，于胸壁上制造一个约8 mm的圆形孔洞。必须彻底止血，因为出血会干扰显微镜观察图7).
  10. 使用持针器将胸腔造口管插入胸壁切口。针应穿刺胸壁，并从胸窗下方和外侧穿出胸腔图7注意避免刺穿膈肌。然后轻轻将导管从胸壁拉出，直至遇到位于导管开窗部分边缘的缝线“限位结”所产生的阻力为止。
  11. 将载物台放平。
  12. 加入3 cm H₂O2将呼气末正压（PEEP）调节至呼吸机，以辅助肺部重新扩张。
  13. 将胶水（Pattex gel，Henkel）沿胸窗周围均匀涂抹。将膜固定，使盖玻片朝向胸腔外侧。使用棉签仔细地沿周围将膜压贴至胶水上，确保贴合。
  14. 在进行肺复张操作（3 次潮气量通气期间阻塞 PEEP 呼吸机端口）的同时，对胸腔引流管施加 -3 mm Hg 的负压吸引。肺组织应持续贴近胸膜腔内膜，并在潮气量通气过程中自由移动。图8).
  15. 将小鼠的右前肢交叉至左侧，使其呈左侧卧位。可使用海绵楔形垫辅助固定小鼠体位，使胸部成像窗口与显微镜的水浸物镜对齐。
  16. 在显微镜检查前，将蒸馏水滴加至盖玻片上，以便使用水浸物镜观察肺组织。成像过程中需间歇性补充水分。

6. 肺血管内皮表面层厚度的测量

  1. 胸壁关闭后立即通过第二根（非麻醉用）颈静脉导管注入500 μl FITC标记的150 kDa葡聚糖（PBS中6%溶液）。此推注剂量既用于容量复苏，也作为血管示踪剂以测量内皮表面层（ESL）。该葡聚糖推注剂量不影响中性粒细胞黏附或肺水肿形成2。
  2. 将水浸物镜置于盖玻片正上方。物镜的选择至关重要：为观察ESL厚度的微小差异，需要高数值孔径（> 0.8），同时保持2–3 mm的工作距离（允许光线穿透肺窗和胸膜表面）。本实验中我们使用尼康CFI 75 LWD 16x（NA 0.8）和CFI 75 LWD 25x（NA 1.1）物镜。
  3. 为在运动器官中准确测量ESL厚度，必须同时获取明场和荧光血管宽度图像。可通过图像分光器（Dual View, Photometrics）实现明场反射光微分干涉差（DIC，明场）与FITC图像的同步采集（图9）。
  4. 在5秒吸气暂停期间进行连续成像并记录。之后可回放这些图像以筛选出焦清晰的帧。
  5. 选取焦清晰的帧，识别紧邻胸膜下的微血管（< 20 μm直径）；通常单帧图像中可发现至少3条微血管。实验结束后，由不知分组情况的观察者测量DIC与FITC-葡聚糖血管宽度，每条微血管取三条垂直截线长度的平均值。假设血管两侧ESL厚度相等，则ESL大小可定义为DIC与FITC-葡聚糖血管宽度之差的一半，具体计算方法见“代表性结果”部分。
  6. 通常情况下，活体显微镜观察可持续> 90分钟，且无肺损伤或低血压迹象2。应预先开展实验以确认小鼠在观察期间的生命体征稳定（血压、氧合、通气、肺损伤情况）。实验药物可在操作过程中任意时间通过第二根（非麻醉用）颈静脉导管给予。

7. 肺血管内皮表面层完整性的替代测量方法

完整的内皮表面层具有（部分）功能，可阻止循环成分接触内皮表面2因此，可通过循环元件维持完整性的能力来测量ESL的完整性（例如 荧光微球）以接触并相互作用于细胞表面黏附分子（如ICAM-1）。

  1. 手术前制备抗ICAM-1标记的荧光微球。将链霉亲和素包被的0.97 μm荧光微球与生物素标记的抗ICAM-1抗体（YN1/1.7.4克隆，1:50，eBioscience）或同型对照抗体在室温下孵育30分钟。微球经三次洗涤后，重悬于PBS中，浓度为每毫升1 × 109个微球。
  2. 活体显微观察期间，将微球悬液（100 μl）注入颈静脉导管。循环15分钟后，连续采集5分钟的荧光图像。对停留时间>5分钟的静止微球视为已黏附，并通过图像处理软件进行定量分析。

8. 安乐死

操作完成后，通过直接心脏穿刺放血法处死麻醉小鼠。通过双侧气胸法确认动物安乐死后，取出肺组织并迅速冷冻，以备后续分析。

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结果

步骤 1-6 中描述的实验方法可用于获取多帧同时记录的微分干涉差（DIC，明场）和荧光图像。为测定内皮表面层（ESL）厚度，实验方案完成后，由一位不知分组信息的观察者对所记录的图像进行回顾分析。选择一幅焦平面清晰的图像，识别胸膜下微血管（直径 < 20 μm）；通常在单帧图像中可发现至少 3 条微血管（图 10）。使用图像分析软件（NIS Elements，Nikon），由不知分组信息的观察者通过测量每条微血管三条垂直截线长度的平均值来确定血管宽度。由于 ESL 在 DIC 成像中不可见，DIC 测得的血管宽度是从一侧内皮膜至对侧内皮膜，因此包含了 ESL 的厚度9, 10。相比之下，FITC-葡聚糖（150 kDa）被排除在 ESL 之外，因此 FITC 测得的血管宽度不包含 ESL 厚度。假设血管两侧的 ESL 厚度相等，则 ESL 的大小可通过 DIC 与 FITC-葡聚糖测得的血管宽度之差的一半来确定。

若干潜在的技术陷阱可能干扰实验结果的解读。术中出血进入显微镜视野将遮蔽对胸膜下微血管的微分干涉差显微（D...

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讨论

与日益广泛的使用同时发生 在体 显微镜技术，人们对糖萼层（ESL）的巨大尺寸及其对血管功能的多种贡献有了越来越深入的认识。然而，这些新兴数据主要来源于对体循环血管系统的研究。事实上，利用 体内 由于明显的肺部和心脏运动伪影，肺部显微成像在技术上具有挑战性。

近期几项技术进步使得活动中的小鼠肺得以稳定，从而更有利于将活体成像技术应用于肺微循环研究12, 13。然而，这些方法可能因肺部静止所带来的生理影响而受到干扰。由于肺在进化上是一个旨在持续运动的器官，肺静止直观上会改变肺生理功能。事实上，肺静止与内皮型一氧化氮信号通路的改变相关，该通路在健康肺和受损肺中均具有广泛的下游效应14, 16。此外，肺部某一区域的固定会使周围肺泡暴露于有害的剪切力之下，这与呼吸机诱导肺损伤中典型的“肺不张性损伤”一致19。这些以及其他尚未明确的肺静止后果，可能会影响对肺微血管（病理）生理过程的活体观察结果的解读。

鉴于这些担...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

我们感谢多伦多大学的 Arata Tabuchi 博士和 Wolfgang Kuebler 博士在活体显微镜技术方面的指导。我们感谢尼康仪器公司的 Andrew Cahill 在显微镜设计与实施方面的协助。本研究由美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所（NIH/NHLBI）资助，基金编号为 P30 HL101295 和 K08 HL105538（授予 E.P.S.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂名称
FITC-葡聚糖（150 kDa）SigmaFD150S
TRITC-葡聚糖（150 kDa）SigmaT1287
链霉亲和素包被的荧光微球Bangs LaboratoriesCP01F/10428Dragon Green 荧光（类似于 FITC）
氯胺酮Moore Medical
赛拉嗪Moore Medical
抗 ICAM-1 生物素化抗体eBioscience克隆株 YN1/1.7.41:50 稀释
同型对照生物素化抗体eBioscienceIgG2b eB149/10H51:50 稀释
设备
机械呼吸机Harvard ApparatusInspira
气管切开导管Harvard Apparatus730028
电凝装置DRE MedicalValleylab SSE-2L
双极电凝镊Olsen Medical10-1200I9.9 cm McPherson
温度控制系统World Precision InstrumentsATC1000
注射泵Harvard ApparatusPump 11 Elite
显微镜（宽场）NikonLV-150
显微镜（共聚焦）NikonA1R
图像分光器PhotometricsDV2
CCD 相机PhotometricsCoolSNAP HQ2
图像处理软件NikonNIS Elements
聚偏二氟乙烯膜Kure Wrap
圆形盖玻片Bellco5CIR-1-BEL5 mm，#1 厚度
胶水（用于粘合盖玻片与膜）PattexFlussig（液体）用于将盖玻片固定在膜上
胶水（用于粘合盖玻片与小鼠）PattexGel用于将膜固定在小鼠身上
手术导管IntramedicPE50、PE10
缝合线Fisher4:0 丝线
电动剃须刀Oster78997
弯头手术镊Roboz
直头手术镊Roboz
手术剪刀Roboz
手术显微剪刀Roboz
手术持针器Roboz
手术胶带Fisher
厨房海绵（切成楔形）各种品牌

参考文献

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