方法文章

利用骨髓来源巨噬细胞研究巨噬细胞极化

DOI：

10.3791/50323

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2013年6月23日

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1Department of Animal Science, Texas A&M University, 2Department of Biology, Texas A&M University, 3Department of Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University

本文内容

摘要

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本文描述了一种简便易行的自适应方法 体外 用于研究巨噬细胞极化的模型。在存在GM-CSF/M-CSF的条件下，骨髓来源的造血干细胞/祖细胞被诱导向单核细胞分化，随后接受M1或M2极化刺激。细胞的活化状态可通过细胞表面抗原的变化、基因表达以及细胞信号通路的变化进行追踪。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文描述了一种简便且易于调整的体外模型，用于研究巨噬细胞极化。在GM-CSF/M-CSF存在条件下，骨髓来源的造血干细胞/祖细胞被诱导向单核细胞分化，随后经M1或M2刺激。细胞的活化状态可通过细胞表面抗原、基因表达以及细胞信号通路的变化进行追踪。

引言

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与经典的炎症反应不同，浸润组织的巨噬细胞通常表现出极化的活化状态，在调控宿主组织生理功能中发挥关键作用1-8。在受到刺激后，巨噬细胞的活化可分为经典活化（M1）和替代性活化（M2）2, 4, 9。M1型巨噬细胞的活化依赖于Toll样受体（TLRs）以及核因子κB（NFκB）/c-Jun氨基末端激酶1（JNK1）的激活，从而促进炎症性细胞因子（如TNF-α和IL-1β）的产生，并激活诱导型一氧化氮合酶（iNOS），导致活性氧物质（如一氧化氮，NO）的生成增加10, 11。相比之下，M2型巨噬细胞的活化则涉及PPARγ、PPARδ或IL-4-STAT6信号通路，引发具有抗炎特性的替代性活化（M2），其特征是甘露糖受体CD206和精氨酸酶1（Arg1）的表达上调6, 12-14。

骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）是一种理想的 体外 用于理解调控活化巨噬细胞极化机制的模型15具体而言，M1型巨噬细胞的活化可通过脂多糖（LPS）刺激诱导，而M2型巨噬细胞的极化则可由IL-4和/或IL-13诱导。成熟的骨髓来源巨噬细胞及活化的巨噬细胞可通过流式细胞术检测其表面抗原（如CD11b、F4/80、CD11c、CD206、CD69、CD80和CD86）的表达来进行鉴定。9, 16, 17此外，可通过定量RT-PCR和Western印迹分别检测与巨噬细胞极化相关的细胞因子产生变化及细胞信号通路的变化。总之，小鼠骨髓来源的巨噬细胞可作为研究巨噬细胞极化的相关模型 体外

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方案

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1. 骨髓细胞的分离

  1. 取6-8周龄小鼠的股骨和胫骨，冲洗去毛后切开骨组织。
  2. 使用21G针头和10 ml注射器，用预冷的含2%热灭活胎牛血清（FBS）的PBS冲洗骨髓（每只小鼠3-5 ml）。
  3. 将骨髓细胞通过21G针头反复吹打4-6次，以充分分散细胞。
  4. 将细胞悬液通过70 μm细胞滤网，去除细胞团块、骨碎片、毛发及其他组织成分。
  5. 加入3倍体积的NH4Cl溶液（0.8% NH4Cl溶液，Stemcell Technology），冰上孵育10分钟，以去除红细胞。
  6. 在4 °C下以500 x g离心5分钟，收集细胞沉淀。
  7. 用冷PBS+2%FBS重悬细胞沉淀（体积为20-50 ml，根据细胞数量调整）。

2. 诱导BMDM形成

  1. 用BMDM生长培养基重悬分离的骨髓细胞（2×106 个细胞/mL）。

BMDM 生长培养基：

Iscove 改良的 Dulbecco 培养基（IMDM）+ 10% 胎牛血清（FBS）+ 15% 过滤（0.2 μm）的 L-929 细胞（ATCC, CCL-1）培养上清液（含单核细胞集落刺激因子，M-CSF）或 10 ng/ml M-CSF。

注意： L-929 细胞上清液含有 M-CSF18。为确保条件培养基的有效活性，将 5 × 105 个 L-929 细胞接种于 T75 cm2 培养瓶中，培养 6–7 天后收集培养上清，经 0.45 μm 滤器过滤后使用。分装的培养基可立即使用，或于 -80 °C 保存 1–2 个月。

  1. 将细胞接种于6孔或12孔组织培养板中（根据实验设计而定）（Corning Costar）。
  2. 第3天更换新鲜的BMDM生长培养基。
  3. 第7天，通过流式细胞术分析评估成熟BMDM的形成，并使用荧光素标记的抗体检测表达CD11b和F4/80的细胞。

3. BMDM 极化激活

  1. 第7天更换为新鲜的刺激培养基：对于M1活化，使用含有10% FBS以及100 ng/ml LPS，或100 ng/ml LPS联合50 ng/ml IFNγ的IMDM；对于M2活化，使用含有10% FBS以及10 ng/ml IL-4和/或10 ng/ml IL-13的IMDM。
  2. 通过使用温热的0.05%胰蛋白酶将刺激后的BMDM从培养皿上解离下来，随后用含10% FBS的PBS洗涤细胞两次。

注意： 分化完成后，为解离并重悬成熟的巨噬细胞，可使用含0.48 mM EDTA的0.05%胰蛋白酶溶液（Invitrogen）或无钙、无镁的PBS或Hank's平衡盐溶液（HBSS）中含2–5 mM EDTA的溶液。若使用含胰蛋白酶的消化液，细胞在37 °C处理时间应少于10分钟，以避免因过度消化导致表面蛋白丢失。

  1. 使用抗体通过标准流式细胞术染色程序，在不同时间点检测细胞表面抗原（包括 CD11b、F4/80、CD11c、CD206、CD69、CD80 或 CD86）的表达。
  2. 采用 qRT-PCR 检测活化的 M1 和 M2 巨噬细胞特征性基因的表达，如 IL-1β、TNF-α 和 IL-6（M1 活化）或 IL-10、IL-13、arginase1 和 PPARγ（M2 活化）。通过 Western 印迹分析检测参与 M1 或 M2 巨噬细胞活化的细胞信号通路的激活情况。

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结果

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骨髓来源巨噬细胞（BMDM）的制备流程示意图如（图1）所示。在第7天可观察到成熟巨噬细胞的高纯度，此时它们占CD11b+F4/80+细胞的95%至99%（图2）。可通过使用抗CD11b、F4/80、CD11c和CD206抗体进行流式细胞术分析来检测极化后的巨噬细胞。如（图3）所示，M1型巨噬细胞表现为CD11b+F4/80+CD11c+CD206-细胞（Q2区域），而M2型巨噬细胞为CD11b+F4/80+CD11c-CD206+细胞（Q4区域）。BMDM的活化状态可通过细胞体积增大（图4A，FSC-A信号右移）以及巨噬细胞表面活化标志物CD69、CD80或CD86表达水平升高（设门：CD11b+F4/80+）来确认，如（图4B）所示。M1或M2型巨噬细胞中的细胞因子分泌、基因表达及细胞信号通路活化情况可通过定量RT-PCR或Western blotting进行评估。如（图5）所示，在10 ng/ml IL-4刺激下，M2型巨噬细胞中精...

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讨论

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我们在此报告一种简单且易于调整的方法 体外 诱导骨髓来源前体细胞分化获得的巨噬细胞活化的操作步骤。该方法可用于研究巨噬细胞极化相关机制。采用本方案获得的成熟巨噬细胞纯度平均为95%至99%，无需额外的纯化步骤。为研究特定目的基因在巨噬细胞极化过程中的功能，可在细胞培养第7天转染后进行外源性基因表达或基因特异性敲低。本方案还提供了为期7天的培养窗口，可用于研究某些因素或基因对巨噬细胞形成、成熟及表型的影响。

活化的巨噬细胞在不同刺激下表现出复杂的细胞和分子特征，并具有高度可塑性3, 9, 19。例如，脂多糖（LPS）可诱导强烈的促炎性M1型反应，该反应在干扰素γ（IFNγ）或肿瘤坏死因子（TNF）存在时可进一步增强；而白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-13（IL-13）均可刺激M2型活化；然而，这些活化特征并不完全重叠3, 4, 9, 15, 19, 20。本实验方案中呈现的结果仅代表通过流式细胞术、定量RT-PCR和蛋白质印迹法分析骨髓来源巨噬细胞的典型实验结果。与巨噬细胞活化相关的表面抗原表达及细胞信号通路在巨噬...

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披露

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未声明任何利益冲突。

致谢

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本工作由美国心脏协会资助（资助号 BGIA 7850037，授予周 Beiyan 博士）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
IMDMThermo ScientificSH30259.01
胎牛血清Invitrogen10438-026
小鼠 GM-CSFPeproTech315-03
NH4ClStemCell Technologies7850
L-929ATCCCCL-1
70 μm 细胞筛BD Biosciences352350
10 x PBSThermo ScientificAP-9009-10
抗小鼠 CD11b-APCeBioscience17-0112-81
抗小鼠 F4/80-FITCeBioscience11-4801-81
抗小鼠 CD69-PEeBioscience12-0691-81
抗小鼠 CD86-PEeBioscience12-0862-81
碘化丙啶InvitrogenP3566

参考文献

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  1. Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
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  4. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
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  7. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
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