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方法文章

活体小鼠血管炎症和血栓形成过程中活化内皮上血小板-中性粒细胞异型相互作用的实时成像

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DOI：

10.3791/50329

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2013年4月2日

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago , 2Department of Anesthesiology, University of Illinois at Chicago

本文内容

摘要

本文报道了一种荧光活体显微技术，用于在活体小鼠的血管炎症和血栓形成过程中，可视化活化内皮上血小板与中性粒细胞之间的异型相互作用。该显微技术将有助于研究血管疾病的分子机制，并可在病理生理条件下评估药理学试剂的作用。

摘要

活化的血小板与白细胞（主要是中性粒细胞）在活化的内皮细胞上的相互作用介导了血栓形成和血管炎症。1,2 在小动脉损伤部位形成血栓的过程中，黏附于活化内皮细胞及内皮下基质蛋白的血小板可促进中性粒细胞的滚动和黏附。3 相反，在小静脉炎症条件下，黏附于活化内皮细胞的中性粒细胞能够促进循环血小板的黏附与聚集。血小板-中性粒细胞异型聚集需要细胞间特异性受体与对应受体相互作用的连续过程。4 已知活化的内皮细胞会释放血管性血友病因子等黏附分子，从而在高剪切力条件下启动血小板的黏附与聚集。5 此外，在低剪切力条件下，活化的内皮细胞分别通过表达选择素和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）来促进中性粒细胞的滚动和黏附。4 血小板P选择素通过P选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）与中性粒细胞相互作用，从而诱导中性粒细胞β2整合素的活化及两类细胞间的牢固黏附。尽管在该领域已取得进展 体外 在全血或分离细胞中测定异型血小板-中性粒细胞相互作用的实验，6,7 这些研究无法在血管疾病过程中调控氧化应激条件。本报告中，我们使用荧光标记的、针对小鼠血小板和中性粒细胞标志物的特异性抗体，详细描述了一种活体显微成像实验方案，用于监测活体小鼠肌腓肠肌微血管中，在TNF-α诱导的炎症反应期间或激光诱导损伤后，血小板与中性粒细胞在活化内皮上的异型相互作用。

方案

1. 活体显微镜的准备（图1A）

  1. 配制灌流缓冲液（125 mM NaCl、4.5 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1 mM MgCl2 和 17 mM NaHCO3，pH 7.4）。
  2. 开启循环水浴，将缓冲液和温控毯维持在 37 °C。用氮气（5% CO2 与氮气平衡）对缓冲液进行通气。
  3. 启动显微镜系统（Sutter Lambda DG-4 高速波长切换器、工作站计算机、Olympus BX61W 显微镜、MPC-200 多通道操纵器、ROE-200 载物台控制器、高速相机和图像增强器）。
  4. 在血管炎症模型中，使用 100% 二向色镜。若需通过激光损伤诱导血栓形成，则将 100% 镜替换为 50/50% 镜，并开启 Micropoint 激光消融系统。

2. 活体显微镜用提睾肌的制备（图1B）

  1. 通过腹腔注射氯胺酮（125 mg/kg 体重 (BW)）和赛拉嗪（12.5 mg/kg BW）麻醉雄性小鼠（6-8 周龄，C57BL/6）。所有动物护理和实验程序均经伊利诺伊大学动物护理与使用机构委员会批准。为建立血管炎症模型，在成像前 3 小时（手术前 2-2.5 小时）向小鼠阴囊内注射小鼠 TNF-α（0.5 μg 溶于 250 μl 生理盐水）。
  2. 将小鼠置于体温控制毯上，保持 37 °C，并放置于活体显微镜载物台。
  3. 用镊子提起颈部表面皮肤，用剪刀沿中线水平切开皮肤，长度约 1 cm。
  4. 用钝头剪刀轻柔地分开颈肌，并去除气管周围的肌肉组织。
  5. 将 PE90 导管插入气管，以缓解呼吸困难。
  6. 轻柔地去除左侧颈肌，并从周围组织中分离出颈外静脉。
  7. 将 PE10 导管插入左侧颈外静脉，用于输注抗体及追加麻醉剂。
  8. 轻柔地拉出并水平切开阴囊皮肤。为在整个实验过程中维持组织完整性，需将预热缓冲液持续灌流于手术区域。
  9. 用一把镊子按压下腹部，用另一把镊子小心地拉出一侧睾丸。
  10. 去除睾丸周围的结缔组织。
  11. 纵向切开提睾肌，并通过固定其边缘将肌肉展平于活体显微镜载物台的玻璃盖玻片上。
  12. 在开始数据采集前，让肌肉稳定 10-20 分钟。本研究选取直径为 30-45 μm 的提睾肌小动脉（用于血栓形成研究）和小静脉（用于血管炎症研究）。
  13. 为维持麻醉状态，约每 30 分钟通过颈静脉导管输注 30-50 ml 相同麻醉剂。

3. 肿瘤坏死因子-α诱导的血管炎症的活体显微成像

  1. 将小鼠放置于活体显微镜上后，打开 SlideBook 5.0 软件，点击菜单栏中的“Focus Window”，设置合适的光学参数和物镜（60X）。
  2. 通过颈静脉插管注入 Dylight 488 标记的大鼠抗小鼠 CD42c 抗体（0.1 μg/g 体重，溶于 100 μl 生理盐水中）和 Alexa Fluor 647 标记的大鼠抗小鼠 Gr-1 抗体（0.05 μg/g 体重，溶于 100 μl 生理盐水中）。
  3. 进入菜单栏，点击工具栏中的“Image Capture”。
  4. 新菜单将弹出；在“Image”选项中，选择“Bin Factor”为 1x1，并将宽度设为“640”，高度设为“460”。
  5. 在“Filter Set”中，勾选所需成像的通道，并为每个通道设置曝光时间。例如，开放通道：10 毫秒，FITC 通道：50 毫秒，Cy5 通道：50 毫秒。
  6. 选择“Time-Lapse Capture”以调整时间点数量和时间间隔。在炎症模型中，时间点数量设置为 1,000–1,500，时间间隔为 200 毫秒（总持续时间：5 分钟）。
  7. 点击“Test”以查看该通道在指定曝光时间下的单层图像。调整曝光时间和/或显微镜光照强度，直至直方图显示适当的强度分布（对于多通道成像，需对每个通道重复此过程）。
  8. 在“Image Capture”中完成所有参数（通道、曝光时间等）设置后，点击“Start”开始图像采集。
  9. 在血管炎症模型中，监测发炎小鼠提睾肌微静脉上半部分的滚动和黏附血小板及中性粒细胞，持续 5 分钟。每只小鼠记录 8 至 10 条不同的微静脉。
  10. 图像采集使用总放大倍数 60X（1.0 NA 水浸物镜），成像视野大小为 157 μm × 118 μm。
  11. 实验结束后，通过颈椎脱臼法处死小鼠。

4. 小静脉炎症模型的数据分析

  1. 打开 SlideBook 5.0 软件，点击菜单栏上的“Folder”以打开文件。
  2. 点击下拉通道菜单，选择“Open, FITC, Cy5, etc.”。
  3. 点击“Renormalize (red and green bars)”并选择通道。将红色和绿色条向左或向右拖动，以大致优化荧光信号。
  4. 点击“Apply”和“OK”以更新图像。
  5. 点击“Thumbnail Button”，将当前显示设为默认。
  6. 播放采集的延时图像，并在5分钟内计数滚动和粘附的中性粒细胞。
  7. 分析血小板血栓形成，进入“Mask”并选择“Create”。
  8. 命名一个掩膜，并勾选“In the current image”。
  9. 在主视图的“Marquee Tool”中点击“Large pencil icon”。
  10. 在主视图中对血管外区域进行着色，以设置背景掩膜。
  11. 进入“Mask”，点击“Copy This Plane”，点击“Copy mask in current timepoint”，选择“All timepoints”，然后点击“OK”。
  12. 计算背景信号，进入“Statistics”并点击“Mask Statistics”。
  13. 在图像范围（Image Scope）中点击“Current 2D Time Lapse or 4D Image(s)”，在掩膜范围（Mask Scope）中选择“Entire Mask”。在特征（Features）中，于采集日期（Date of Capture）下选择“Elapsed Time (hh:mm:ms)”，在形态测量（Morphometry）下选择“Area (pixels)”，在强度（Intensity）下选择“Maximum Intensity”，然后点击“Export”（此统计方法可用于计算自体荧光强度，即背景信号）。
  14. 在 MS Office Excel 中打开文本文件，并计算整个记录期间背景信号的平均值。此即为背景荧光强度。
  15. 确定血栓强度，再次在主视图的“Marquee Tool”中点击“Large pencil icon”。
  16. 在主视图中对血管内部进行着色，以设置血小板信号。
  17. 进入“Mask”，点击“Copy This Plane”，点击“Copy mask in current timepoint”，选择“All timepoints”，然后点击“OK”。
  18. 进入“Statistics”并点击“Mask Statistics”。
  19. 在图像范围（Image Scope）中点击“Current 2D Time Lapse or 4D Image(s)”，在掩膜范围（Mask Scope）中选择“Entire Mask”。在特征（Features）中，于采集日期（Date of Capture）下选择“Elapsed Time (hh:mm:ms)”，在形态测量（Morphometry）下选择“Area (pixels)”，在强度（Intensity）下选择“Sum Intensity”，然后点击“Export”（此统计方法可用于计算血管内部的荧光强度）。
  20. 在 MS Office Excel 中打开文本文件。通过从血管内部的总荧光强度中减去背景强度的平均值乘以面积（像素），计算血小板的荧光信号。此即为血小板血栓的荧光强度。
  21. 在3–5只不同小鼠的30个不同微静脉中重复该操作，然后计算血小板荧光强度的中位数值。
  22. 分析中性粒细胞滚动与粘附，在每条微静脉中测定5分钟内的中性粒细胞滚动流入量，并以每分钟细胞数表示。对静止时间超过>30秒、缓慢爬行（30秒内移动距离<10 μm）但未发生滚动的粘附中性粒细胞进行计数，并以每5分钟细胞数表示。

5. 激光诱导小动脉血栓形成的活体显微成像

5-1 消融激光的校准

  1. 将镜面载玻片放置在显微镜载物台上，在载玻片顶部滴加一滴蒸馏水，并通过目镜调节光照强度和焦距。
  2. 打开“Focus Window”，在 SlideBook 5.0 软件中选择“FRAP”选项卡。
  3. 将激光功率设置为 40–50，将“Double click repetitions”和“Double click size”均设置为 8。勾选“Guide”框以显示一组十字准线。
  4. 从屏幕顶部的任务栏中选择“Arrow”图标。
  5. 在“FRAP Alignment”选项卡下，点击“Fire next”。显示器左下角附近应出现一个小光斑。光斑出现后，双击其中心位置。点击后，另一个光斑应出现在第一个光斑的右上方；双击该光斑。重复此操作共 16 次（第 16th 个光斑将出现在右下角）。完成后点击“Save”以更新校准参数。
  6. 为测试校准的准确性，点击“Center”按钮——屏幕上应出现一个位于中心的小光斑。若未出现，则重复校准过程，直至达到所需精度。

5-2 激光诱导小动脉血栓形成

  1. 将麻醉后的小鼠（参见步骤2-2至2-12的操作）放置在显微镜载物台上。
  2. 在“Capture”窗口下选择一个已有协议或创建新协议。设置如下：CY5（曝光70毫秒）、Open（曝光10毫秒）、FITC（曝光50毫秒）。图像采集持续20分钟（约2400个时间点，时间间隔为500毫秒）。
  3. 按照前述方法灌注Dylight 488标记的抗小鼠CD42c抗体和Alexa Fluor 647标记的抗小鼠Gr-1抗体。
  4. 优化显微镜参数，包括荧光强度和明场图像，具体操作见步骤3-3至3-7。
  5. 点击“Test”按钮，确认明场强度、抗体信号、小动脉位置及焦距均合适。
  6. 点击“Start”按钮，开始图像采集过程。
  7. 在发射消融激光前，确保已选中鼠标指针图标，并且血管壁处于清晰对焦状态。
  8. 要发射激光，请在血管壁内侧2-3 μm处双击。小动脉内皮细胞的损伤会引起可见的形态变化，该变化应在明场图像中清晰可见，随后出现血小板聚集。激光损伤后持续监测血栓形成过程5分钟。
  9. 激光损伤5分钟后（此时血栓大小应已稳定），暂停并停止图像采集。随后开始新一轮采集，共2400个时间点，时间间隔500毫秒，持续记录黏附血小板以及滚动/黏附的中性粒细胞20分钟。每只小鼠记录3至5条小动脉。
  10. 实验结束后，通过颈椎脱位法处死小鼠。

6. 小动脉血栓模型的数据分析

  1. 重复步骤 4.1 至 4.5。
  2. 为获得血小板血栓形成过程中的背景荧光强度，重复步骤 4.7 至 4.14。
  3. 进入“Mask”界面，点击“Segment”，在通道中选择 FITC，并在 Low 项中输入背景信号的平均值。点击“Apply”和“OK”。
  4. 为分析血小板血栓的荧光强度（Dylight 488 标记的抗 CD42c 抗体），重复步骤 4.18 至 4.19。为计算抗体信号，以“Sum Intensity”减去背景信号（“Maximum Intensity” × “Area (pixels)”），所得值即为血小板血栓的荧光强度。
  5. 为定量滚动和黏附的中性粒细胞，播放延时图像，并在 20 分钟内计数明显在血小板血栓上滚动的细胞数量。滚动定义为中性粒细胞在与血小板血栓相互作用期间速度降低，且持续至少 2 秒；黏附的中性粒细胞定义为在血小板血栓上持续附着至少 2 分钟的任何中性粒细胞。滚动和黏附的中性粒细胞数量以每 20 分钟的细胞数表示。滚动速度使用粒子追踪系统进行计算。

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结果

通过详细的活体显微镜分析，将荧光标记的血小板标志物（CD42c）或中性粒细胞标志物（Gr-1）抗体注入活体小鼠体内，从而在活化内皮上可视化血小板与中性粒细胞之间的异型相互作用。

在TNF-α诱导的小静脉炎症模型中，大多数滚动的中性粒细胞通过活化的β2整合素与ICAM-1相互作用，稳定黏附于内皮细胞上（记录时间为注射TNF-α后3-4.5小时，图2A）8。由于TNF-α诱导的内皮细胞活化，在视频采集开始前，已可见滚动和黏附的中性粒细胞。在炎症内皮细胞上，滚动和黏附的中性粒细胞数量分别为0.25 ± 0.05 个/分钟和18.5 ± 0.7 个/5分钟（图2B和2C）。大多数中性粒细胞在整个视频采集期间（1-1.5小时）持续黏附于活化的内皮，黏附细胞数量仅有轻微减少，同时滚动细胞数量仅有轻微增加（数据未显示）。我们发现，大多数血小板黏附于已黏附或正在迁移的中性粒细胞，而非炎症的血管壁（图2A，视频1）。血小板血栓在整个视频采集期间反复形成并发生栓塞。黏附血小板相关...

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讨论

本文描述了一种用于实时荧光活体显微成像的详细方案，以观察在血管炎症和血栓形成过程中，活化内皮上血小板与中性粒细胞之间的异型细胞相互作用。此前，已有类似荧光显微技术被用于研究血栓形成的分子机制以及血管炎症过程8,12。由于异型细胞间的相互作用可能在损伤部位引发血管阻塞，该技术将成为研究血管疾病细胞与分子机制的重要工具。实时成像技术的优势在于，能够在炎症和血栓形成条件下，动态监测血管内细胞与活化/受损内皮之间即时发生及后续的相互作用。此外，我们的显微系统还可用于研究循环肿瘤细胞与内皮细胞或血细胞之间的异型相互作用，方法包括使用荧光标记的肿瘤细胞，或针对肿瘤细胞标志物（如人上皮细胞黏附分子 EpCAM）的荧光标记抗体13,14。除了使用荧光标记抗体外，该显微技术也可结合表达荧光蛋白的转基因小鼠进行，例如在特定细胞类型（如 CD41-EYFP+ 巨核细胞）中表达荧光蛋白的小鼠模型15。

利用荧光标记抗体的强度，我们可以确定血管损伤后血小板血栓形成的动力学过程以及血管内活化细胞的分子表达。然而，大多数用于此目的的抗体都会抑制...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本研究部分得到了美国国立卫生研究院（资助号：P30 HL101302 和 RO1 HL109439，授予 J.C.）以及美国心脏协会（资助号：SDG 5270005，授予 J.C.）的资助。A. Barazia 获得了 NIH T32HL007829 培训项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NaCl菲舍尔科技7647-14-5
KCl西格玛-奥德里奇7447-40-7
CaCl2 2H2O西格玛-奥德里奇10035-04-8
MgCl2 6H2O菲舍尔科技7791-18-6
NaHCO3菲舍尔科技144-55-8
0.9% NaCl 生理盐水霍斯皮拉0409-4888-10
氯胺酮霍斯皮拉0409-2051-05
赛拉嗪劳埃德
导管（PE 90）BD 诊断427421
导管（PE 10）BD 诊断427401
小鼠 TNF-αR&D 系统410-MT
Dylight 488 标记的大鼠抗小鼠 CD42b 抗体Emfret 分析X488
Alexa Fluor 647 标记的抗小鼠 Ly-6G/Ly-6C（Gr-1）抗体生物传奇108418
NESLAB EX 水浴循环器赛默飞世尔科技
奥林巴斯 BX61W 显微镜奥林巴斯
TH4-100 电源奥林巴斯
Lambda DG-4萨特仪器
MPC-200 多通道操纵器萨特仪器
R–-200 载物台控制器萨特仪器
C9300 高速相机滨松光子
图像增强器视频光学国际公司
消融激光器光子仪器公司
SlideBook 5.0智能成像创新公司

参考文献

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