方法文章

一个 体外 研究人类巨噬细胞分化与极性异质性的模型

18.9K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/50332

⸱

2013年6月12日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, University of Heidelberg

本文内容

摘要

单核细胞来源的巨噬细胞是先天免疫系统的重要细胞。本文介绍了一种易于使用的 体外 通过密度梯度离心、阴性磁珠分选及特定的细胞培养条件，可获得单核细胞来源的巨噬细胞，用于表型与功能研究。

摘要

单核细胞来源的巨噬细胞是先天免疫系统中一种重要的细胞类型。在研究巨噬细胞生物学的小鼠模型中，由于小鼠与人源单核细胞来源的巨噬细胞在表型和功能上存在差异，因而受到限制。因此，本文描述了一种 体外 用于生成和研究人原代巨噬细胞的模型。简言之，从前臂静脉采集外周血后，通过密度梯度离心分离外周血单个核细胞，再利用阴性磁珠分离法从中获取单核细胞。随后，在特定条件下将这些单核细胞培养六天，以诱导不同类型的巨噬细胞分化或极化。该模型操作简便，避免了小鼠与人类之间因物种特异性差异所带来的问题。此外，该模型更接近于 体内 相比使用永生化细胞系，该模型具有更多生理相关条件。总之，本文所述模型适用于研究巨噬细胞生物学、鉴定疾病机制及新的治疗靶点。尽管尚不能完全替代动物实验或获取的人体组织研究 死后该模型可用于识别和验证与多种人类疾病密切相关的疾病机制和治疗靶点。

引言

单核细胞来源的巨噬细胞是先天免疫系统的重要细胞组分，在多种急性和慢性炎症过程中发挥重要作用1。巨噬细胞在动脉粥样硬化或癌症等多种炎症性疾病中具有关键作用2。巨噬细胞具有高度可塑性，能够根据局部微环境的不同而呈现不同的表型3。因此，研究巨噬细胞的分化与异质性，对于深入理解多种疾病的病理生理机制、发现新的治疗靶点以及开发新型疗法至关重要。

在许多情况下，小鼠模型被用于研究特定疾病的病理生理学。然而，使用小鼠模型研究巨噬细胞生物学存在若干局限性：（1）小鼠与人类外周血中白细胞亚群数量（即单核细胞和粒细胞）的比例存在显著差异，提示单核细胞在小鼠与人类病理生理过程中的作用不同。（2）小鼠与人类外周血单核细胞在基因表达方面存在显著差异，表明其在健康与疾病状态下的功能可能存在重大差别4。（3）用于鉴定小鼠单核细胞和巨噬细胞的多种标志物（F4/80、LyC、etc.）在人类髓系细胞中并不存在，使得小鼠模型的研究结果向人类情况的转化变得相当困难。

因此，为了加深对人类疾病中巨噬细胞分化与异质性的理解，我们需要利用能够作用于人类巨噬细胞的模型。为此，本文描述了一种易于使用的人类原代巨噬细胞生成模型，可用于研究由人单核细胞衍生的巨噬细胞 体外 在不同条件下导致不同类型的巨噬细胞极化。在多项研究中，我们使用了 体外 单核细胞来源的原代人巨噬细胞模型，用于分析巨噬细胞生物学及其在人类动脉粥样硬化中的潜在意义 5-7.

尽管尚未完全取代动物实验或获取的人体组织实验 死后该模型可用于识别和验证与多种人类疾病密切相关的疾病机制和治疗靶点。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 实验方案

  1. 缓冲液的配制方法如下：
    1. 制备PBMC分离用缓冲液：“洗涤缓冲液” = 含0.02% EDTA的PBS（使用0.5 M EDTA）。
    2. 准备单核细胞分离缓冲液：“MACS 洗涤缓冲液” = 0.5% BSA（250 mg）+ 2 mM EDTA（200 μl）+ PBS（50 ml）。对缓冲液进行脱气处理。
    3. 准备用于FACS染色及细胞保存的缓冲液：“FACS缓冲液”为含10% FCS的PBS，“固定缓冲液”为含1% PFA的PBS。
  2. 从前臂静脉抽取30 ml全血，使用EDTA作为抗凝剂。
  3. 按以下步骤分离PBMC（histopaque）：
    1. 准备两个无菌的50 ml离心管（不可使用聚苯乙烯材质）。
    2. 将步骤2中的血液用PBS按1:1比例稀释。
    3. 每管中加入 25 ml Histopaque 和 25 ml 全血/PBS。确保 Histopaque 与血液不要混合。
    4. 在室温下以 400 × g 离心 30 分钟，不使用刹车。
    5. 吸弃血浆。
    6. 吸除不透明界面层，并用移液器转移至洁净的50 ml离心管中。
    7. 加入 20 ml 含 0.02% EDTA 的 PBS。
    8. 在 4 °C 条件下以 250 x g 离心 5 分钟。
    9. 弃去上清液。
    10. 加入10 ml含0.02% EDTA的PBS溶液。
  4. 细胞计数方法如下：
    1. 涡旋振荡10秒，充分混匀。
    2. 取200 μl细胞悬液 + 300 μl含0.02% EDTA的PBS + 500 μl台盼蓝染液（每10个方格200-500个细胞，否则调整稀释倍数）。
  5. 按如下步骤进行单核细胞的阴性分离：
    1. 将步骤 3.10 获得的细胞在 120 × g 条件下离心 10 分钟，弃去上清液。
    2. 将细胞沉淀用 10 ml PBS + 0.02% EDTA 洗涤 2 次，每次 120 × g 离心 10 分钟。
    3. 加入9 ml无菌水，持续3秒，再加入1 ml 10×PBS。
    4. 用含0.02% EDTA的PBS再洗涤一次，120 × g离心10分钟。
    5. 离心过程中计数。
    6. 在 EasySep 缓冲液中稀释至 5 x 107/ml
    7. 加入50 μl/ml单核细胞富集混合液。
    8. 4 °C 下孵育 10 分钟。
    9. 涡旋振荡珠子30秒。
    10. 加入 50 μl/ml 珠子。
    11. 4 °C 下孵育 5 分钟。
    12. 用EasySep缓冲液补足至终体积2.5 ml。此时溶液呈棕褐色。
    13. 放入磁铁中。
    14. 室温下静置2.5分钟。在此期间，与磁珠结合的非单核细胞将移向管壁并附着于其上。
    15. 将含有非结合单核细胞的缓冲液倒入新的无菌管中。该溶液呈乳白色。
    16. 用含 0.02% EDTA 的 PBS 洗涤一次，120 × g 离心 10 分钟。
  6. 将细胞以 0.5 x 10⁵ 的密度接种于塑料培养皿或多孔板中6/cm2. 加入1 ml培养基/1 × 106 细胞
  7. 在感兴趣的条件下培养细胞6-14天。
  8. 3天后换液，更换50%的培养基为新鲜培养基（参见 表1 详情请参见）。
  9. 六天后收获细胞，用于mRNA提取、流式细胞术和蛋白质印迹分析 等等.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

采用上述方案，我们通常可从 100 ml 血液中获得 25.1 x 106 ± 2.2 x 106 个单核细胞（26 次独立实验的平均值 ± 标准误，图 1A）。通过 CD14 流式细胞染色测定的单核细胞纯度通常高于 95%（97.1 ± 0.4%，3 次独立实验的平均值 ± 标准误，图 1B）。经台盼蓝染色测定的新鲜分离单核细胞活力通常大于 95%（数据未显示）。细胞最初呈圆形并悬浮生长，通常在数小时内开始贴壁。贴壁过程伴随细胞形态改变，呈现“煎蛋样”或纺锤样形态（图 2）。在含 M-CSF（100 ng/ml）的培养基中培养 6 天后，无论是否在最后 24 小时添加氧化型 LDL（100 μg/ml），未暴露于 oxLDL 的细胞中约有 80% 存活，而经 oxLDL 处理的细胞存活率约为 70%（图 3）。经 M-CSF 培养 6 天后的流式细胞分析显示，细胞仍表达白细胞标志物 CD45RO，但单核细胞标志物 CD14 的表达下调（图 4...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

单核细胞来源的巨噬细胞是先天免疫系统中的关键细胞类型。它们在包括动脉粥样硬化或癌症在内的多种炎症性疾病中发挥重要作用2。因此，研究巨噬细胞生物学对于加深我们对多种疾病发病机制的理解以及开发新型治疗方法至关重要。

许多研究采用过表达或缺失特定目的基因的小鼠模型。然而，在研究与人类疾病相关的单核细胞来源巨噬细胞过程时，这种方法似乎并非最佳选择，因为小鼠与人类的单核细胞及其衍生细胞之间存在显著差异4。因此，使用原代人类细胞的可靠模型似乎是研究巨噬细胞分化相关疾病机制的良好替代方案。

该方法的一个明显优势是 体外 此处介绍的模型的优势在于不依赖于THP-1或其他永生化细胞系 14-15尽管细胞系易于获取且无需频繁采血，但其在表型和功能上与原代细胞并不完全相同。因此，Cho 等 比较了原代人巨噬细胞的基因表达特征，并将其与先前发表的THP-1细胞数据进行了对比 12,14他们发现这两种细胞类型之间存在显著但中等程度...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无需披露任何利益冲突。

致谢

感谢Nadine Wambsganss提供的出色技术协助。本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目编号GL599/1-1）资助，部分由海德堡大学创新基金FRONTIER资助，资助对象为C.A.G.。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
50 ml 离心管（无菌）Fisher055398
D-PBS（1X），液体（不含钙或镁）Invitrogen14190-250
EDTASigmaT9285
BSASigmaA-8806
FCSInvitrogen
EasySep 人单核细胞富集试剂盒StemCell Technologies19059
EasySep 磁力架StemCell Technologies18000
FACS 管Fisher352008
Macrophage-SFM（1X）Invitrogen12065-074
青霉素-链霉素SigmaP-4458
Nutridoma-SPRoche11011375001
人 M-CSF 10 μgPeprotech300-25
细胞培养板，6 孔Fisher07-200-80

参考文献

  1. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  2. Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
  3. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
  4. Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
  5. Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
  6. Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
  7. Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
  8. Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
  9. Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
  10. Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656(2012).
  11. Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
  12. Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
  13. Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
  14. Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
  15. Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
  16. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668(2010).
  17. Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  18. Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
  19. Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

PCR M1 M2

相关文章