从啮齿类动物胚胎中分离脑脊液并用于离体大脑皮层组织外植体研究

摘要

在胚胎早期脑发育过程中，脑室脑脊液（CSF）包绕神经上皮及大脑皮层前体细胞。本文介绍了从不同发育阶段的啮齿类胚胎中分离脑室脑脊液的方法，以研究其生物学功能。此外，我们还展示了大脑皮层组织外植体的分离与培养技术，该技术可在极少量培养基或脑脊液条件下实现外植体的生长。

摘要

脑脊液是一种复杂的液体，其蛋白质组在发育过程及成年期动态变化。在胚胎发育过程中，随着前神经管的闭合，新生的脑脊液开始区别于羊水。随后几天，随着衬于脑室壁的神经上皮前体细胞以及脉络丛生成脑脊液，其体积逐渐增加。胚胎期脑脊液接触发育中的脑和脊髓的神经干细胞的顶端即脑室面。脑脊液为发育中脑组织的扩张提供关键的流体压力，并以时间特异性的方式向神经前体细胞递送重要的促生长因子。为了研究脑脊液的功能，至关重要的是分离出未被血液或发育中的端脑组织污染的纯净胚胎脑脊液样本。本文介绍一种可分离相对纯净的脑室胚胎脑脊液样本的技术，该样本可用于多种实验分析，包括质谱分析、蛋白质电泳以及细胞和原代组织块培养。我们展示了如何将皮质组织块解剖并培养在多孔聚碳酸酯膜上，从而在减少培养基或脑脊液用量的情况下培养发育中的皮质组织。利用该方法，可使用不同发育阶段或不同条件下的脑脊液，研究脑脊液蛋白质组对靶细胞的生物学活性。

引言

脑脊液是一种复杂的液体，包裹着发育中的神经上皮^1-6，为发育中的大脑提供必要的压力⁷以及促进生长的信号^8-12。为了研究大脑发育过程中脑脊液的变化，我们建立了在不同发育阶段从发育中的大鼠或小鼠胚胎中分离脑室脑脊液的技术^6,9。以往的分离方法包括使用玻璃微针并通过微注射器采集脑脊液^1,2。我们的方法采用一种玻璃微毛细移液管，其尖端经拉制形成超细点，以增强组织穿透能力。该玻璃微毛细移液管连接至吸液装置，从而可通过轻微调节压力来控制脑室脑脊液的采集。为了研究脑脊液信号对干细胞的影响，我们分离大脑皮层外植体，将其置于聚碳酸酯膜上，并漂浮于添加了脑脊液样本的适当培养基中⁹。利用该技术，仅需较少体积的培养基即可维持组织培养，从而高效利用脑脊液⁹。

方案

1. 胚胎分离/制备

该技术可用于小鼠或大鼠。在本实验方案中，我们以小鼠胚胎脑组织为例，演示脑脊液采集技术和大脑皮层外植体分离操作。我们将对大鼠与小鼠在通用技术中存在的任何重要差异进行说明。关于胚胎发育时期的分期系统，大鼠以检测到阴栓的当天定义为E1，而小鼠则以检测到阴栓的当天定义为E0.5。

1. 准备一个带有Sylgard硅酮弹性体的显微解剖皿。Sylgard 184硅酮弹性体以两种液态组分提供，即A组分和B组分。A组分与B组分按重量或体积比10:1混合。混合液态组分后，将Sylgard弹性体倒入培养皿中，使其覆盖整个皿表面。混合过程中可能产生少量气泡，这些气泡将在固化过程中逐渐消散。盖上培养皿盖，使弹性体固化。该弹性体可在室温下固化24小时，或在较高温度下加速固化。例如 37 °C）以加快固化。待液体成分完全凝固后，解剖皿即可使用。只要按照步骤彻底清洗，该培养皿可重复用于多次实验。
2. 微毛细移液管（针头）的制备。使用Narishige PC-10型垂直微移液管拉制仪，按照以下参数制备微毛细移液管：单步拉制；加热器#2设定为58；拉制重量100 g。使用精细的#55镊子小心折断微移液管的尖端。所得针头的平均内径为85 μm。
3. 准备脑脊液抽吸用的吸液装置组件。将与微毛细移液管配套提供的微型推杆插入毛细针中。或者，将一次性塑料滤器连接至与微毛细移液管相连的吸液管组件末端。将针头穿过垫圈，插入吸液装置组件另一端的指定位置。
4. 将从同窝仔中分离的胚胎转移至已用Sylgard制备的显微解剖皿中。
5. 去除胚外膜和组织，使胚胎清晰暴露。可使用精细虹膜剪依次解剖各层组织——先子宫壁，后蜕膜。即 Fine Science Tools # 15000-02)。在每个植入部位，先沿子宫长轴方向切开子宫壁，然后切开蜕膜，再用精细镊子进一步撑开切口。在进行类似切口后，可移除蜕膜，暴露胎膜。操作时应小心，避免切开或刺破胎膜。
6. 用无菌的Hanks平衡盐溶液（HBSS）冲洗，并使用移液器以及剪成三角形的擦镜纸或滤纸吸去胚胎周围多余的液体。

2. 脑室脑脊液采集

1. 在解剖显微镜下观察胚胎：对于小鼠，应使胚胎侧卧，从而获得胚胎发育过程的矢状面视图。对于大鼠胚胎E16或更晚阶段，将胚胎沿其最长平面方向背侧脊柱朝下放置，即如同胚胎仰卧，从头侧向尾侧方向定位。以此方式，可从左右两侧脑室同时收集脑脊液（CSF）。
2. 将微毛细移液管稳定地插入侧脑室、中脑室或小脑延髓池，插入后应尽量避免接触神经上皮细胞。对于E14.5或更晚阶段的小鼠胚胎，可先从右侧脑室吸出脑脊液，然后拔出针头并插入左侧脑室。由于E14.5之前胚胎的脑室及神经管通畅，通常可通过单次针头插入侧脑室即可吸出全部脑脊液。然而，由于发育时间及连通脑室通畅性可能存在轻微差异，因此也可将微毛细移液管插入小脑延髓池，以收集最大体积的脑脊液。
3. 当微毛细移液管插入侧脑室、中脑室或小脑延髓池后，小心而轻柔地开始将脑脊液吸入移液管，可通过微推杆产生负压吸取脑脊液，或通过口吸产生轻柔负压，使脑脊液缓慢、可控地流入微毛细移液管。我们建议操作者查阅所在机构关于上述操作方法的相关政策规定。
4. 持续施加负压，将脑脊液收集至微毛细移液管中。在E16.5/E17或更早期的小鼠和大鼠胚胎中，可通过观察头部插入移液管一侧出现凹陷，从而判断脑室轻微塌陷。在更晚期的胚胎中，由于脑体积较大，可能无法观察到头部塌陷现象。
5. 停止施加负压，轻柔地将微毛细移液管从侧脑室中取出。
6. 将收集的脑脊液样本轻轻排入预先置于冰上预冷的Eppendorf管中。
7. 继续收集整窝动物的脑脊液，并将所有样本汇集至同一管中。
8. 在4 °C条件下以10,000 × g离心10分钟，以去除可能存在的污染细胞。
9. 分析样本是否存在神经上皮细胞或红细胞污染。污染通常表现为液体浑浊或呈红色/粉红色，或离心后出现带血色的沉淀物。离心后可通过显微镜检查脑脊液中是否存在细胞或细胞碎片。如发现污染迹象，应弃去该样本。作为额外对照，也可对沉淀物进行细胞染色检测。纯净的脑脊液可用于细胞培养、皮层培养、质谱分析、Western blot、ELISA及其他检测。澄清的脑脊液应转移至新的无菌Eppendorf管中。样本现可用于分析，或与其他样本混合，或用液氮速冻后于-80 °C保存。反复冻融小体积液体可能导致体积减少及蛋白浓度变化，可通过冻干样本避免此类问题。

3. 大脑皮层组织块分离

1. 将从胎仔中分离出的E14.5胚胎转移至预先用Sylgard包被的显微解剖培养皿中。
2. 按照步骤1.5所述方法，去除胚胎周围的胚外膜和组织。
3. 用无菌的Hanks平衡盐溶液（HBSS）洗涤，并用移液器吸除胚胎周围的多余液体。
4. 在颈部区域进行解剖，将头部与胚胎其余部分分离（图1A）。
5. 使用精细解剖刀（眼科手术刀）沿头皮中线纵向切开。用精细镊子夹住切口两侧，剥离皮肤。接着使用虹膜剪沿发育中颅骨的中线全长剪开，随后再做两个附加切口，分别位于发育中颅骨前后端约1/3处。用精细镊子夹住解剖产生的颅骨“瓣片”，去除发育中的颅骨组织，暴露大脑皮层（图1B）。
6. 使用解剖刀沿中线在正中矢状面将大脑一分为二，分离左右大脑皮层半球（图1B, C）。软脑膜和蛛网膜保留在皮层上，硬脑膜则随发育中的颅骨一并去除。
7. 分别处理每个大脑皮层半球。将半球内侧面朝上放置，以便观察神经节隆起和正在发育的皮层（图1C, D）。
8. 使用解剖刀在嗅球发育部位后方的皮层神经上皮进行冠状切口。该切口应起始于内外侧神经节隆起的前缘边界，并延伸至发育中皮层原基的前扣带区域（图1E）。
9. 在侧脑神经节隆起后缘边界稍后方再做一冠状切口（图1F）。该切口也应从神经节隆起的外侧边界延伸至发育中皮层原基的内侧壁。
10. 使用解剖刀或通过200 μl移液器轻柔地喷出HBSS液流，将步骤3.7和3.8所形成的皮层“瓣片”轻轻推开，以避免对皮层造成机械损伤。随后，沿侧脑神经节隆起与发育中皮层之间的边界做一横向切口（图1G, H）。接着，在新皮层顶端、侧皮层表面与半球间壁交汇处，解剖去除发育中的海马和内侧端脑的皮层半球结构。
11. 沿侧脑神经节隆起与发育中皮层之间的边界再做一横向切口（图1H）。
12. 从Sylgard板上移除皮层外植体周围所有多余的解剖组织。可使用新鲜HBSS缓冲液轻柔吹打，以去除残留组织。此时解剖完成的皮层应为脑膜面朝下（图1I）。

4. 皮层外植体的转移

1. 准备一个连接至玻璃移液管的铂金丝环。将插入玻璃移液管末端的折叠铂金丝用火焰加热。通过扭转铂金丝环的末端，可调节环的大小，并将其塑形以适配所需组织块的尺寸。（此步骤可预先准备并重复使用。）
2. 加热铂金丝末端，以灭菌丝环。
3. 分离出解剖后的皮层组织块，通过轻柔移液去除多余的HBSS培养基，保留少量液体以便与铂金丝环配合使用。
4. 将一个直径为1 cm的聚碳酸酯膜置于直径为4 cm的成像培养皿中。
5. 使用铂金丝环的侧面，轻柔翻转皮层组织，使软脑膜面朝上。
6. 将组织块置于丝环中央，利用固有的静水力学力，在水平平面上将皮层组织块从解剖皿中轻轻提起。
7. 将组织块轻柔放置于聚碳酸酯膜上，随后移开铂金丝环，确保组织块保持水平，且脑室面与膜充分接触。
8. 轻柔提起膜，并在膜下方加入50 μl的脑脊液（CSF）或其他培养基。
9. 盖上成像培养皿，放入湿润的次级容器中，于37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时，以支持细胞持续增殖和组织块生长。图2展示了最终皮层组织块培养皿制备的示意图。

结果

脑脊液采集应获得清澈透明的液体。穿刺液及离心管中的样本不应有血液污染的迹象，例如液体呈红色或黄色。穿刺液及离心管中也不应含有组织碎片。当脑脊液经过离心后，还可通过显微镜检查脑脊液，以确认无污染。若发现污染迹象，应弃用该脑脊液样本。从一窝 E14.5 小鼠中，通常可采集到 10–15 μl 脑脊液。表 1 列出了从不同胚胎发育阶段的小鼠和大鼠中，基于平均窝仔数所采集脑脊液的平均体积。在成功获取纯净的脑脊液样本后，可采用多种不同技术对脑脊液进行分析。图 3 展示了使用 2 μg 小鼠 E14.5 脑脊液进行银染后的代表性凝胶图像。

脑皮质外植体可在必要时添加不同体积的脑脊液（CSF）与基础培养基共同培养，以使总体积达到 50 μl. 图 4 显示具有代表性的外植体培养结果 50 μl 在100%胚胎脑脊液中培养24小时。研究表明，外植体在100%脑脊液中能够存活并增殖，其组织学特征与同胎龄啮齿类胚胎相似。 ⁹ 如通过磷酸化组蛋白H3（PH3，细胞分裂的标志物）在...

讨论

所述的脑室脑脊液采集方法已获得相对纯净的胚胎期脑脊液样本，其蛋白质组成稳定，并在多种细胞实验中表现出一致的活性⁹。若操作技术良好，且取十只E14.5小鼠的同窝胚胎，可采集到10–15 μl脑脊液；而取E16大鼠的一窝胚胎，则可采集约50–90 μl脑脊液。该采集技术通过仔细观察、离心处理，并弃去含有细胞碎片或血性痕迹的样本，最大程度地减少了血液和组织的污染。我们已在显微镜下分析离心后的脑脊液，以评估其中是否存在细胞碎片或细胞，发现离心后无沉淀物的样本均无细胞污染。与发育中脑组织的蛋白质组或受污染脑脊液样本（数据未显示）相比，采用此脑脊液提取方法所获得的脑脊液蛋白质组在质谱分析中未检测到任何线粒体蛋白⁶。

根据脑室脑脊液在端脑泡和神经管内的物理位置，唯一的分离方法是穿刺发育中的皮肤、颅骨和端脑。因此，穿刺针穿过这些组织可能成为污染的来源。穿刺针的尖端应尽可能细，以便能够顺利穿过组织并进入脑室。在将微毛细移液管插入脑室的过程中，针头内腔可能会收集到组织。根据胚胎的发育阶段，若脑室内已形成脉络丛，则需注意避免将脉络丛内容物吸入移液管中。然而，必...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Wiretrop II 毛细玻璃针	Drummond Scientific	#5-000-2020
Sylgard	Ellsworth Adhesives	#184 SIL ELAST kit
吸管管路组件	Sigma	#A5177-5EA
一次性滤器	Venturi 或本地药店	不可获得	标准香烟滤嘴
圆柄眼科刀（15度穿刺刀）	World Precision Instruments, Inc.	#500250
35 mm 玻底培养皿	MatTek Corp.	#P35G-1.5-14-C
铂铱合金丝	Tritech Research	#PT-9010-010-3FT
Nuclepore 径迹蚀刻膜	Whatman	#09-300-57
Hanks 平衡盐溶液	Fisher Scientific	#SH30031.FS
虹膜切除剪刀	Fine Science Tools	#15000-02