ex vivo 法对啮齿类动物气道上皮纤毛运动进行高分辨率成像

摘要

本文介绍了一种利用小鼠气管可视化并定量纤毛运动及纤毛驱动流的简便且可靠的技术。该技术可经修改后用于确定多种因素对纤毛运动的影响，包括药理学试剂、遗传因素、环境暴露，以及黏液负荷等机械因素。

摘要

已建立一种用于成像小鼠气道上皮的离体（ex vivo）技术，可对运动纤毛功能进行定量分析，从而深入理解黏液纤毛清除功能。新鲜获取的小鼠气管沿气管肌纵向切开，并安装在玻璃底培养皿上的浅壁腔室中。将气管样本沿其长轴放置，利用气管肌的自然卷曲特性实现纵向弯曲，从而可在整个气管长度上以侧视角度成像纤毛运动。使用微分干涉差显微镜和高速数字相机以每秒200帧的速度采集视频，用于纤毛摆动频率和纤毛波形的定量分析。在成像过程中加入荧光微珠，还可测定纤毛驱动的液体流动。该实验方案总耗时约30分钟，其中腔室准备5分钟，样本安装5至10分钟，视频显微成像10至15分钟。

引言

分析呼吸道上皮中运动纤毛的功能对于阐明影响黏液纤毛清除能力及肺部健康的遗传和环境因素具有重要的实验意义¹。本研究建立的用于成像小鼠呼吸道上皮的简易方案，为在突变体和基因敲除小鼠模型中检测呼吸道纤毛运动提供了一种高效方法，仅需掌握基本的小鼠气管组织解剖技能，以及利用高分辨率视频显微镜对呼吸道纤毛运动进行离体（ex vivo）成像的技术。该方案是在一项大规模小鼠诱变筛选中建立并优化的，旨在快速评估与异向性相关先天性心脏病突变体中运动纤毛的功能（包括纤毛搏动频率、纤毛搏动形态以及纤毛产生的流体流动）^2-5。

目前用于研究气道纤毛运动的技术可分为急性离体（ex vivo）类型或长期的体外（in vitro）实验方法。急性实验包括对人鼻腔/气道刷取活检样本进行离体（ex vivo）观察^6,7，以及对简单的气道横切面进行分析⁸。体外（in vitro）方法则利用多种细胞培养技术，生成分化成熟的纤毛上皮细胞层，例如气液界面培养或气道悬浮培养^9-11。然而，这些气道上皮细胞重新长出纤毛的技术在获得可用于实验的纤毛上皮细胞之前，需要投入大量时间和培训（4–6周^9,10）。尽管急性离体（ex vivo）分析气道上皮刷取活检样本在人类临床研究中被广泛使用，但由于会加剧机械性组织损伤，该方法无法用于小鼠研究¹²。

本方案中所述的小鼠气管上皮分析技术不仅操作简便，且除常规视频显微成像设备外，无需特殊解剖技巧或专用仪器。该简易方案具有诸多优势。首先，由于小鼠气管组织的采集快速且易于实施，可实现对大量小鼠气道纤毛功能的快速评估。这包括对不同因素短期作用下的急性效应进行分析 体外 处理。其次，作为一种 离体 技术，纤毛气道上皮仍附着于其下方的支撑组织，从而保留了相关的细胞信号通路。因此，与之相比 体外 带纤毛的气道上皮，该制备方法更能代表天然状态 体内 组织微环境。第三，本方案能够获取多种不同的定量参数，从而对纤毛运动功能进行客观评估。最后，与其他现有的气道纤毛成像方法相比，本方案允许以垂直于纤毛摆动方向的角度进行观察，获得纤毛的侧视图像，从而更有利于对纤毛摆动及异时波生成进行高分辨率成像。

该方案可通过多种方式进行修改，以满足广泛的实验需求，例如研究药理学试剂、遗传因素、环境暴露和/或机械因素（如黏液负荷）对气道纤毛功能以及气道纤毛摆动和协调波传播的产生与维持所起的作用。

方案

1. 试剂准备

1.1 解剖与成像介质

在气管样本的收获和成像过程中，使用添加了胎牛血清（10%）以及青霉素-链霉素（100 单位/毫升青霉素 G 钠和 100 μg/毫升硫酸链霉素）的 Leibovitz's L-15 培养基（L15）。

2. 浅壁培养室组装

用于放置气管组织的腔室如图1所示。腔室的底部为带有玻璃底的35 mm培养皿。腔室的顶部和侧面通过将一片厚度为0.3 mm的硅胶片覆盖在玻璃培养皿上构成。硅胶片的边缘被裁剪以适配圆形底部的培养皿，其中心部分进一步修剪，形成一个浅的中央腔室（见步骤2.1–2.3）。在此组件上方放置一个18 mm圆形玻璃盖玻片，以构成一个适合成像的封闭腔室。

1. 用一块0.3 mm厚的硅胶片完全覆盖一个18 mm圆形玻璃盖玻片。
2. 使用标准的锋利解剖剪刀，修剪掉盖玻片边缘周围的多余硅胶片（形成一个圆形的硅胶片层）。
3. 用锋利的手术刀在已覆盖的盖玻片中央切出并移除一块中央硅胶片（约10 mm见方），从而形成成像室的顶部和侧壁。

3. 气管的收获与制备

1. 根据当地机构动物护理和使用委员会和/或政府指南对小鼠实施安乐死，并将气管取出置于标准的35 mm塑料培养皿中，加入足量L15培养基以浸没组织（作者曾使用妊娠16.5天即出生前的小鼠，以及新生、新生儿期和成年动物²）。
2. 使用钝性解剖法去除附着在气管外壁的非气管相关组织。
3. 使用显微解剖剪在环状软骨下方稍作横向剪切，切除喉部（图2A，线1）。
4. 使用显微解剖剪在气管隆突上方稍作横向剪切，切除左右主支气管分支（图2A，线2）。
5. 用精细镊子轻轻夹住气管，使用P1000移液器和P1000吸头，以约1 ml的L15灌流液冲洗管腔2–3次，以清除黏液和血液。
6. 使用显微解剖剪横向剪切，截取包含3–4个软骨环的气管节段（图2B，线1）。
7. 使用显微解剖剪沿该短气管节段的气管肌中部进行纵向剪切（图2B，线2）。
8. 使用显微解剖剪沿气管软骨环中部进行纵向剪切（图2C，线），得到两个适合成像的气管组织部分（单个部分见图2D）。

4. 纤毛成像

1. 将气管组织片段管腔面朝下，转移至含有100–200 μl L-15培养基的35 mm玻璃底培养皿中央。
2. 为量化纤毛驱动的流体流动，向浸没气管组织样本的L-15培养基中加入少量荧光标记的0.20 μm微球（约1 × 10¹¹ 粒子/ml，或每毫升L-15培养基中加入20 μl的Fluoresbrite 2.5%水性微球悬浮液）。
3. 将先前制备的成像室（见上述步骤1–3）硅胶片一侧朝下放置于气管组织样本上，使气管样本位于硅胶片开窗所形成的浅壁腔室中央（图1）。
4. 轻轻按压盖玻片以固定其位置，并使用P1000移液器吸头和P1000移液枪从边缘去除多余的L-15培养基。
5. 将装有气管组织样本的35 mm玻璃底培养皿置于倒置显微镜上，使用100倍物镜和微分干涉差（DIC）光学系统进行观察。
6. 利用高速相机及视频采集软件，以每秒200帧以上的速度采集气管平滑肌卷曲边缘处纤毛上皮区域的纤毛运动视频（图2D 虚线框区域，E：录制视频的示例静态图像）（补充视频1）。
7. 采用FITC落射荧光成像结合低照度CCD相机（见上述设备清单），采集荧光微球在纤毛气管上皮表面移动的视频，以便后续定量分析纤毛驱动的流体流动（补充视频2）。

5. 纤毛运动的定量分析

1. 将微分干涉差（DIC）成像的视频载入 ImageJ 软件包，并按照 Iain Drummond¹³ 描述的技术，使用线条工具绘制一条穿过跳动纤毛的扫描线。对该线进行“重新切片”可生成类似显微测速图（kymograph）的图像，其中纤毛跨越该线的运动形成波状图案。测量每个波峰之间的像素数（一个像素 = 一个视频帧），据此可计算每分钟纤毛跳动次数（即 Hz）。
2. 为测量纤毛驱动的流体流动，将含荧光微珠的视频载入 ImageJ 软件包，并使用 MTrackJ 插件¹⁴ 手动追踪气管上皮表面荧光微珠的运动，由软件生成每个被追踪微珠的速度和运动方向性数据。

使用荧光微珠定量流体流动时需格外注意，因为微珠与摆动纤毛之间的距离会显著影响测得的流速大小。补充视频2中的微珠运动情况很好地说明了这一点。在该示例中，微珠在摆动纤毛表面处运动较快，而在远离纤毛的灌注液中则速度明显下降。为控制这一变量，所有样本中均应在纤毛上皮上方固定距离处采集微珠轨迹，以便进行准确比较。最后，为获得具有代表性的流体流动数据，应尽可能延长微珠的追踪时间；我们倾向于使用跨越10个以上纤毛细胞的微珠轨迹来计算流体流速。

结果

正常气道纤毛应清晰可见，并呈现协调的摆动模式（补充视频1；视频播放速度减慢至实际速度的15%），且可观察到沿纤毛摆动方向的明显液体流动（补充视频2；视频播放速度为实际速度的100%）。纤毛运动视频的定量分析结果应与图3所示结果相似。采集高速微分干涉差（DIC）视频可实现对纤毛摆动频率的定量分析（图3C），并提供可用于定性评估纤毛摆动形态的高质量图像；而荧光微珠的运动轨迹追踪则可用于测量纤毛驱动的流体流速（图3D）和方向性（图3E）。

我们利用方向性来表征线性流动的指数。方向性通过将荧光微珠的总位移除以即 通过荧光微球在整个轨迹中移动的距离，除以轨迹起点与终点之间的最短距离，来计算方向性。因此，沿直线运动的荧光微球其方向性为1，而偏离直线路径、呈显著蜿蜒运动的荧光微球其方向性则远小于1。

我们对样本进行了长达一...

讨论

利用高倍显微镜物镜和快速图像采集硬件测量纤毛摆动频率（CBF）相对简便^13,15，这解释了为何CBF测量构成了大多数关于健康与疾病状态下黏膜纤毛清除功能研究的基础。然而，尽管CBF测量对于理解黏膜纤毛清除至关重要，仅测量CBF却忽略了纤毛驱动流和纤毛摆动波形这两个关键因素，而后者测量难度较大，常被忽视，且可能与CBF无相关性。CBF升高并不一定对应纤毛驱动流增强的一个实例可见于某些携带DNAH11突变的患者。DNAH11是一种轴丝动力蛋白重链蛋白，其突变已被报道可导致纤毛摆动过快（即高动力性）以及异常的纤毛摆动波形，预计会引发黏膜纤毛清除障碍¹⁶。本实验方案的显著优势在于，它能够方便地以垂直于纤毛摆动方向的角度观察纤毛，从而获得纤毛的侧视图像，有利于对纤毛摆动形态及纤毛表面产生的液体流动进行高分辨率成像，因此可在同一样本中直接比较CBF与纤毛摆动波形和/或纤毛驱动流。

该技术的另一个优势在于， freshly harvested 气管中的纤毛能够在整个呼吸上皮表面保持协调一致的摆动能力，从而便于纤毛摆动频率（CBF）与纤毛产生流体流动之间...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Leibovitz’s L-15 培养基	Invitrogen	21083-027	不含酚红
胎牛血清	Hyclone	SH30088.03
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140-122
2 把精细镊子	Roboz	RS-4976
解剖剪刀	Roboz	RS-5676
显微解剖剪刀	Roboz	RS-5620
手术刀	Roboz	RS-9801-15
P1000 移液器	Gilson, Inc	F123602
P1000 吸头	Molecular BioProducts	2079E
18 mm 圆形玻璃盖玻片	赛默飞世尔科技（Fisher Scientific）	430588
塑料 35 mm 培养皿	Corning	430588
玻璃底 35 mm 培养皿	Warner Instruments	W3 64-0758
厚度为 0.012"（0.3 mm）的硅胶片	AAA Acme Rubber Co	CASS-.012X36-63908
直径 0.20 μm 的 Fluoresbrite YG 羧基微球	Polysciences	09834-10
倒置显微镜，配备 100 倍油镜和微分干涉（DIC）滤光片	Lecia	DMIRE2	品牌无特殊要求。
100 瓦汞灯，配备荧光素（FITC）激发/发射滤光片	Lecia		品牌无特殊要求。
显微镜载物台培养箱	Lecia	11521749	若在室温下观察纤毛，则无需此设备
高速明场相机	Vision Research	Phantom v4.2	品牌无特殊要求。帧率必须高于 125 fps
高速荧光相机	Hamamatsu	C9100-12	品牌无特殊要求。帧率必须高于 10 fps
视频分析软件	美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）	ImageJ 配合 MtrackJ 插件