同源重组技术通过实现分子水平上精确突变的构建，极大地推动了黑腹果蝇（Drosophila）遗传学的发展。近年来，重组工程（recombineering）技术的应用使得研究人员能够操作大片段DNA并将其转化到黑腹果蝇（Drosophila）中6。本文所介绍的方法结合了这些技术，可快速构建大型同源重组载体。
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摘要
摘要
内源基因位点的快速、大规模操控技术的持续发展将拓宽其应用范围 黑腹果蝇 作为人类疾病相关研究的遗传模式生物。近年来，同源重组和重组工程等技术不断进步。然而，对于大多数基因而言，产生明确的无效突变或对内源性蛋白质进行标记仍然是一项艰巨的工作。本文中，我们介绍并演示了利用基于重组工程的克隆方法构建载体的技术，这些载体可用于靶向和操控内源性基因座 体内 具体而言，我们已建立了一种结合三种技术的方法：（1）BAC 转基因/重组工程，（2）末端外同源重组，以及（3）Gateway 技术，以提供一种稳健、高效且灵活的内源基因组位点操作方法。在本方案中，我们将逐步详细介绍如何（1）设计各个载体，（2）利用缺口修复将基因组 DNA 的大片段克隆至同源重组载体中，以及（3）通过第二轮重组工程在这些载体中替换或标记目标基因。最后，我们还将提供一种将这些表达盒转移的方案 体内 通过基因敲除或基因敲入实现基因敲除或标记基因的构建。这些方法可轻松并行应用于多个靶点，并提供了一种操控基因的手段 果蝇 以及时且高效的方式完成基因组测序。
引言
在内源性位点对单个基因进行分子定义明确的精确操作，为研究真核生物学中众多相关问题提供了宝贵的工具。 果蝇 直到戈利克及其同事引入了用于产生功能缺失等位基因的反向遗传学技术，该领域才得以取得进展 体内 利用同源重组进行基因靶向 果蝇 1-3他们证明了可以利用整合型转基因构建体中的线性DNA片段来靶向特定基因组位点。这种线性的“供体”DNA由以下方式产生 体内 通过FRT介导的重组（将DNA从染色体上以环状分子形式切除），随后用巨核酸酶I-SceI进行线性化。尽管该方法已成功用于产生多种明确的损伤，但由于每个单独的敲除构建体都需要独特且定制的设计，该技术难以扩展应用于平行操作大量基因。例如，在无缝操作大片段DNA方面存在困难（>5 kb 体外 使用传统的限制性内切酶/连接克隆或PCR方法，以及传统方法在片段大小上的限制 体内 转化载体常常会干扰同源重组靶向载体的快速构建。为克服这些局限性，我们将可实现长达100 kb DNA片段的亚克隆和转基因操作的重组工程/转基因P[acman]系统与ends-out基因靶向技术相结合，建立了一个高效且相对快速的平台，以促进 果蝇 基因靶向
基于重组的基因工程（recombineering）是一种强大的、以同源重组为基础的克隆技术4,5。与传统的限制性内切酶/连接酶克隆方法不同，recombineering 不受操作 DNA 序列或大小的限制。该技术利用一种特殊的E. coli菌株，该菌株携带由缺陷型λ前噬菌体提供的重组系统4。近年来，该技术已被应用于Drosophila6,7。在Drosophila中的recombineering依赖于一种经过改造的、条件性可扩增的细菌人工染色体（BAC）载体，称为P[acman]6,7。该载体包含两个复制起点：OriV，在化学诱导下可实现高拷贝数扩增，用于纯化大量DNA，以满足测序和胚胎显微注射的需求；以及OriS，在基础条件下维持低拷贝数。此外，P[acman]载体还携带一个细菌附着位点（attB）。attB位点可作为ΦC31整合酶介导转基因的底物，从而将大片段DNA整合至Drosophila基因组中的预定插入位点8,9。
我们构建了一种P[acman]载体（称为P[acman]-KO 1.0），可作为末端外同源重组的靶向载体使用 10,11为了将末端外基因靶向技术整合到该系统中，我们添加了两个FRT位点和两个I-SceI位点。我们还在这一改良载体中引入了一个Gateway盒，以简化将同源臂插入P[acman]-KO 1.0的过程。该设计提供了一种快速且简便的方法，可将几乎任何感兴趣的基因组区域引入靶向载体。在本方案中，我们将描述如何利用P[acman]-KO 1.0构建靶向载体，以及如何对该载体进行动员 体内 以靶向内源性位点。在本实验方案中，我们将使用RFP/Kan表达盒替换目标基因，但本方案也可适用于包含抗生素筛选标记的多种其他表达盒。我们已设计并成功应用了一系列用于基因替换和标签标记的表达盒 10,11.
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方案
1. 选择目标BAC及靶向区域
- 为了获得含有目的基因（GOI）的BAC（此处 CG32095 以……为例，搜索 CG32095 在 www.flybase.org在“库存与试剂”部分，查看名为“基因组克隆”的子栏目，寻找包含BAC的条目 CG32095确保BAC包含目的基因上游至少10 kb和下游至少5 kb的序列。或者，可选用P[acman]载体中的克隆7 也可以在以下位置找到 http://www.pacmanfly.org/libraries.html.
- BAC 克隆位于 DH10B 细胞中，P[acman] 克隆位于 EPI300 细胞中。基因组克隆需要转化至适用于重组工程的 SW102 细胞中。从含有 BAC 的细胞接种的 5 ml 过夜培养物开始，进行“粗提质粒”（即不使用柱子的 Qiagen 质粒小提，通过异丙醇沉淀 DNA）。将新制备的 DNA 沉淀重悬于 20 μdH 的升数2O，稀释1 μ升至100 μdH 的升数2O 并使用 1 μl 用于电穿孔电转感受态SW102。制备电转感受态SW102请使用以下方案：
-
- 将SW102细胞接种至4 ml LB培养基中。在32 ℃下培养菌液 °C O/N 摇床振荡，250 rpm。 重要提示： SW102细胞绝不可暴露于高于32℃的温度 °除非需要诱导重组机制，否则为 C。
- 将1 ml饱和的SW102菌液接种至44 ml LB培养基中，在32℃条件下培养 °C 摇床至 OD600 在0.2-0.3之间（通常约1-1.5小时）。 注意： 其他重组工程实验方案建议将菌液在较小体积中培养至OD600 0.6–0.7，但在较大体积中将细菌培养至较低密度可显著提高转化效率 12此外，这种改进缩短了等待时间。
- 将培养物置于冰水混合物中冷却5分钟。 重要提示： 在接下来的步骤中，细胞必须保持在低温条件下。这对于获得高质量的电转感受态细胞至关重要。
- 在 4℃ 离心培养物 °在 1,500 × g 离心 10 分钟。弃上清，用 25 ml 冷（4 °C）缓冲液重悬沉淀 °C) 10% 甘油 13首先，在冰水浴中轻敲并旋转离心管，使细胞在5 ml溶液中重悬。切勿反复吹打混匀）然后加入剩余的10%甘油（20 ml）。
- 在 4℃ 离心 °在 1,500 × g 条件下于 4°C 离心 10 分钟，弃上清，用 25 ml 冰冷的 10% 甘油重悬沉淀，再次洗涤。
- 在 4℃ 离心 °在 1,500 × g 条件下于 4°C 离心 10 分钟，弃上清，用 25 ml 冰冷的 10% 甘油重悬沉淀，进行第三次洗涤。
- 在 4℃ 离心 °在1500 × g下于4°C离心10分钟，弃上清液。此时细胞沉淀可能较为松散，弃上清时应格外小心。将沉淀重悬于1 ml预冷的10%甘油溶液中。转移细胞至1.5 ml离心管，在台式微量离心机中于4°C以12,000 × g离心30秒。 °C. 弃去大部分上清液，保留 ≈90 μ细胞与甘油混合液已准备好，可进行电穿孔。 注意： 此时细胞可在 -80 保存 °C 以备后续使用。然而，这可能会降低感受态。
- 使用1 mm比色皿，以1,800 V、25 ms的电穿孔参数将DNA转入细胞 μF，200 Ω电穿孔后，加入300 μ加入1 mL S.O.C.培养基，32℃下复苏细胞2小时 °C（无需振荡）。在含25的LB琼脂平板上接种细胞 μg/ml 氯霉素（或根据转化的BAC或PAC选择其他适当的抗生素）并在32℃培养 °C，24–30 小时。
- 用于基因靶向的同源臂设计需选择目的基因（GOI）上游10 kb和下游5 kb的基因组DNA序列。从10 kb和5 kb同源臂的末端各选取500 bp用于扩增（见第2节）图1）。这些500 bp片段作为同源臂，用于将目的基因（GOI）周围的基因组区域重组到P[acman] KO 1.0中。这些片段分别称为左臂（LA），代表对应上游5'同源臂的区域，以及右臂（RA），代表对应下游3'同源臂的区域。 重要同源臂中不应含有BamHI限制性酶切位点，因为质粒的线性化（步骤3.2）是通过BamHI限制性酶切消化实现的。
2. 将同源臂插入P[acman]-KO 1.0
- 设置两个独立的PCR反应：一个用于扩增LA，另一个用于扩增RA。对于LA，使用引物attB1-I-SceI-LA-F和BamHI-LA-R；对于RA，使用引物BamHI-RA-F和attB2-I-SceI-RA-R进行扩增。表1）。使用1 μ来自步骤1.2的BAC DNA或0.5 l μ以含有目标BAC的过夜培养细菌煮沸裂解液作为模板。务必使用具有校对功能的DNA聚合酶。此要求适用于后续所有PCR步骤，但步骤2.8和3.13中的PCR检测除外。 注意： 校读型DNA聚合酶的延伸时间可能因生产商不同而与常规Taq DNA聚合酶有所差异。在这些步骤中可使用PfuUltra II Fusion HotStart，其聚合速率为15秒/千碱基。
LA/RA PCR
PCR反应条件1 μl 来自Bac第1.2步的含杂质质粒提取物中的DNA 0.25 μl 每个 20 μM引物 2.5 μl 10X PfuUltra II 缓冲液 0.75 μl 10 mM（每种）dNTP 0.5 μl PfuUltra II Fusion HotStart DNA聚合酶 19.75 μl 水 25 μl 总体积 步骤1 95 °C 2分钟以激活酶 步骤2 95 °C 20秒 变性 步骤3 60 °C 20秒退火 步骤4 72 °C 20秒延伸 第5步 转至步骤2，重复29个循环 第6步 4 °C 持有 - 在1%琼脂糖凝胶上电泳样品，并使用Zymoclean DNA回收试剂盒提取产物。用10 μL洗脱液从Zymoclean柱中洗脱DNA μ毫升无菌水
- 使用2.2步骤中纯化的每种扩增产物总DNA 10–30 ng，通过重叠延伸扩增（PCR SOE）对两个片段进行拼接图2。这通常约为1/20th 每种纯化后的PCR产物：
LA/RA PCR-Soe
PCR反应条件0.5 μ每升 LA 和 RA 纯化的 PCR 产物约 10–30 ng 0.25 μ每升 20 μM引物 2.5 μl 10X PfuUltra II 缓冲液 0.75 μl 10 mM（每种）dNTP 0.5 μl PfuUltra II Fusion HotStart DNA聚合酶 19.25 μl 水 25 μl 总体积 步骤1 95 °C 2分钟以激活酶 步骤2 95 °C 20秒 变性 步骤3 55 °C 20秒退火（较低温度，以允许引物退火） 步骤4 72 °C 20 秒延伸 步骤5 转至步骤2，重复1个循环 步骤6 95 °C 20秒 变性 步骤7 60 °C 20秒退火 步骤8 72 °C 20 秒延伸 第9步 转至步骤2，重复27个循环 步骤10 4 °C 持有 - 在琼脂糖凝胶上电泳PCR样品，并通过胶回收方法回收1.0 kb条带。该条带为attB1-LA-BamHI-RA-attB2载体片段。
- 使用Gateway BP Clonase II酶试剂盒，按照制造商提供的方案进行BP反应。步骤2.4中生成的表达盒作为供体DNA，P[acman]-KO 1.0作为目的载体。
- 稀释50 μ将30微升TransforMax EPI300电转感受态细胞 μ冷的10%甘油或冷的dH₂O2O. 转化 1 μ将BP反应液加入电转感受态细胞中，按照制造商提供的说明书进行操作。加入水可稀释BP反应液中较高的盐浓度，以防止电穿孔过程中发生电击放电（电弧现象）。使用1 mm比色皿，在1,800 V、25条件下将DNA电转化至细胞中 μF，200 Ω.
- 加入300 μ加入 l 倍体积的 S.O.C. 培养基，37℃复苏 1 小时 °C（无需振荡）。在LB-琼脂 + 50 μg/ml Amp（P[acman]-KO 1.0 含有氨苄青霉素抗性基因）。在37℃下培养平板 °C，18-24 小时。
- PCR 检测单个菌落，采用常规菌落 PCR 方法，使用 T3 引物（T3 序列位于 P[acman]-KO 1.0 载体中 Gateway 连接盒的下游）图1）以及 attB1-I-SceI-LA-F 引物。阳性克隆将显示一条大小为 1.2 kb 的条带。
- 在含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中过夜培养阳性克隆 μg/ml 氨苄青霉素
- 在含有50的10 ml LB培养基中扩增包含LA和RA的P[acman]-KO 1.0载体 μg/ml 氨苄青霉素培养物，使用拷贝数控制溶液，按照制造商说明书（Epicentre）操作。
- 按照制造商的说明书进行Qiagen质粒小提。
3. 将目标基因组区域重组到P[acman]-KO 1.0中
第1天
- 将含有目标BAC的SW102细胞接种于4 ml LB培养基中，加入25 μg/ml氯霉素（Chl）或适当的筛选抗生素。在32 °C、250 rpm条件下振荡培养过夜。重要提示： 除步骤3.5中的诱导过程外，SW102细胞不应暴露于高于32 °C的温度，因为高温会激活这些细胞的重组机制。
第2天
- 消化 0.4 μP[acman]-KO-1.0 中包含在第1.0节生成的LA和RA臂的克隆 2 与 ≈20单位BamHI在25中 μl 反应。37℃孵育 °至少 3 小时保持在 C。 重要提示： 长时间消化对于确保所有DNA被充分消化至关重要，这将减少后续假阳性克隆的数量。
- 将1.0 ml饱和的SW102/BAC培养物接种至44 ml LB-Chl(25)培养基中 μg/ml）并在32 °C 摇床至 OD600 0.2–0.3 之间（通常约为 1–1.5 小时）。另设一个相同的样本作为非热激（non-HS）对照。该样本在除热激处理以外的所有方面均与实验组完全相同。此非热激培养物作为阴性对照。若在非热激对照平板（步骤 3.13）上出现大量菌落，通常表明转化的是未消化的 P[acman] KO 1.0 LA/RA 质粒。
- 在培养物生长的同时，将经BamHI酶切的P[acman]-KO样品进行琼脂糖凝胶电泳。随后从凝胶中回收目的DNA片段，并用10 μL洗脱液洗脱DNA。 μ55℃温水 °C. 注意： 切勿使用任何缓冲液洗脱DNA。缓冲液中的盐分可能在电穿孔过程中引起电击放电。
- 将培养物在42℃进行热激 °在水浴中精确加热 15 分钟。这将激活 SW102 细胞的重组机器。对照培养物不要进行热激处理。
- 热激后立即转移热激组和非热激对照组培养物至预冷的50 ml标准离心管中，并将培养物置于冰水混合物中冷却5分钟。 重要提示： 在接下来的步骤中，细胞必须保持在低温条件下。这是获得高质量电转感受态细胞的关键。
- 在 1,500 x g 条件下离心培养物 10 分钟。弃去上清液，用 25 ml 冷（4 °C）磷酸盐缓冲液重悬沉淀。 °C) 10% 甘油 13首先，将细胞在冰水浴中轻轻敲击并旋转离心管，以5 ml体积重悬细胞。切勿反复吹打混匀) 然后加入剩余的10%甘油（20 ml）。
- 4℃离心 °在 1,500 × g 条件下于 4°C 离心 10 分钟，弃上清，用 25 ml 冰冷的 10% 甘油重悬沉淀，再次洗涤。
- 4℃离心 °在 1,500 × g 条件下于 4°C 离心 10 分钟，弃上清，用 25 ml 冰冷的 10% 甘油再次洗涤沉淀，共洗涤第三次。
- 在 4℃ 离心 °在 1,500 × g 条件下 4°C 离心 10 分钟，弃上清液。此时细胞沉淀可能较为松散，弃上清时应小心操作。将沉淀重悬于 1 ml 预冷的 10% 甘油溶液中。转移细胞至 1.5 ml 离心管中，在台式微量离心机中于 4°C 以 12,000 × g 离心 30 秒。 °C. 弃去大部分上清液，留下 ≈90 μ升/细胞 注意： 此时，细胞可在 -80 保存 °C 以备后续使用。但此操作可能会降低感受态。
- 加入2 μ将 BamHI 消化的 P[acman]（约 50 ng）加入细胞中，用移液枪头轻轻混匀。将细胞转移至 1 mm 电穿孔杯中，在 1,800 V、25 μF，200 Ω.
- 加入300 μ加入1毫升S.O.C.培养基，32℃下复苏细胞2小时 °C（无需振荡）。在LB琼脂（含50）上接种细胞 μg/ml 氨苄青霉素，32 ℃ 培养 °C，24–30 小时。
第3天
- 通过菌落PCR筛选正确的缺口修复。使用T3和RA检测引物检测RA，使用T7和LA检测引物检测LA（表1）。设计PCR-Check-RA和PCR-Check-LA引物，使其朝向目标区域方向延伸100-200 bp（表1）。使用PCR-Check-RA与T3或PCR-Check-LA与T7进行PCR反应时，阳性菌落将产生大小为800-1,000 bp的条带（图3）。注意：必须同时检测两个臂，因为有时会观察到仅整合一个臂而另一个未整合的情况。
- 将经PCR验证的阳性菌落在含有50 μg/ml氨苄青霉素的4 ml LB培养基中，于32 °C过夜培养。制备这些菌株的甘油冻存液以备后续使用。
4. 用靶向表达盒替换基因组区域
第4天
- 以 pENTR-RFP/KAN（经 AscI 和 NheI 酶切线性化）为模板，使用 5'HA-RFP/Kan-F 和 3'HA-RFP/Kan-R 引物（表 1）通过 PCR 扩增 RFP/KAN 敲除盒。RFP/KAN 盒可向参考文献 11 申请获取。
- 对 PCR 产物进行凝胶纯化，并用 20 μl 无菌水洗脱。包含同源臂的 RFP-KAN 盒大小应约为 3 kb。
- 将 1 ml 饱和的 SW102/P[acman]-KO 培养物（步骤 3.13）接种至 44 ml LB-Amp（50 μg/ml）培养基中，在 32 °C 摇床中培养至 OD600 达到 0.2–0.3。另设一份相同的样品作为非热激（non-HS）对照。该对照样品除不进行热激处理外，其余所有操作均与实验组完全相同。
- 当 SW102/P[acman]-KO 培养物达到目标密度后，继续执行步骤 3.5 至 3.10。
- 将约 100 ng 的靶向盒电转化至 90 μl 电转感受态 SW102/P[acman]-KO 细胞中。将细胞转移至 1 mm 电转化比色皿中，在 1,800 V、25 μF、200 Ω 条件下进行电击。加入 300 μl S.O.C. 培养基，于 32 °C 静置恢复 2 小时（无需摇动）。注意：强烈建议使用新鲜凝胶纯化的敲除盒。
- 将细胞涂布于 LB 琼脂 +Amp（50 μg/ml）+Kan（50 μg/ml）平板上，于 32 °C 培养 24–30 小时。
第5天
- 从5个不同的菌落中分别接种5 ml培养液，在32 °C下过夜培养。
第6天
- 进行“粗提质粒”操作，取获得的DNA样品一半在1%琼脂糖凝胶上电泳，检测是否存在低分子量质粒。不应出现小于12 kb的质粒条带。（图4）
- 将阳性克隆的DNA进行1:500稀释，取1 μl用于电转化50 μl TransforMax EPI300感受态细胞。重要提示：务必稀释DNA，以防止多个质粒共转化进入同一个细胞。将细胞涂布于LB琼脂平板（含Amp 50 μg/ml + Kan 50 μg/ml），37 °C培养18–24小时。
第7天
- 将单菌落接种于10 ml LB + 培养基中，过夜培养。
第8天
- 取100 ml LB培养基，接种第4.10步获得的饱和菌液，加入适当的抗生素以及100 μl 1,000倍浓缩的拷贝数控制溶液，在37 °C下培养5–6小时。
- 进行质粒大提（maxiprep），并通过测序验证盒式结构已正确插入目标位点。
- 除测序外，还需对不含任何低分子量质粒的克隆及其亲本DNA进行限制性内切酶消化实验。所选用的限制性内切酶因基因而异，但目的均为帮助研究者表征经重组工程改造的载体。例如，针对CG32095的靶向载体，依次使用PacI、AscI、BamHI和AatII进行连续消化。若观察到所有预期条带，且无异常条带出现，则表明该靶向载体已成功完成重组工程改造（图5）。
5. 注射果蝇并激活表达盒 在体
- 使用 ΦC31 整合酶将表达盒注入预先选定的基因组着陆位点。可借助外部供应商（如 Rainbow Transgenics（http://www.rainbowgene.com））提供显微注射服务。重要提示： DNA 必须在注射前新鲜制备。若 DNA 在实验室内制备并当天注射，转化效率更高。
- 为将表达盒从着陆位点移出，使用布卢明顿果蝇中心（Bloomington）品系编号 25680 或 25679。这些品系在第二号和第三号染色体上分别携带受热激启动子调控的 Flippase 和 I-SceI 基因。此外，它们在平衡染色体和 Y 染色体上均含有 hs-hid 转基因。选取该品系的雄蝇，与携带 KO 表达盒（位于着陆位点）的 virgin 雌蝇杂交。设置约 30 个杂交管，让雌蝇产卵 2–3 天。注意： 建议选择与目标位点所在染色体不同的品系。
- 将亲本转移至一组新的 30 个培养管中，在连续三天内每天两次对幼虫进行 37 °C、1 小时的热激处理。热激可激活 Flippase 和 I-SceI 酶的表达，同时激活细胞死亡基因 hid，从而清除雄蝇及携带平衡染色体的果蝇。让亲本在新转移的培养管中继续产卵 2–3 天，随后再次将亲本转移至新的培养管，并对原有培养管中的后代重复热激处理。重复此“转移-产卵-热激”流程多次，直至亲本不再产卵为止。
- 从热激处理后获得的 F1 代子代中收集 virgin 雌蝇，与 y-w- 雄蝇杂交。目标设置 150–200 个杂交组合，每个组合包含 3 只 virgin 雌蝇和 3 只雄蝇。
- 在荧光显微镜下筛选 F2 代子代，检测眼睛中是否表达 RFP。筛选同时对 white 和 yellow 基因呈突变表型（即 y-w-）且眼睛 RFP 阳性的个体。该筛选策略可正向富集含有 RFP 表达盒的个体，同时排除携带 P[acman] 载体（含 mini-white）及着陆位点（由野生型 yellow 基因标记）的个体。注意： 直接筛选眼睛中的 RFP 表达比先筛选 yw 表型更节省时间。由于热激过程中移位事件效率很高，眼睛表达 RFP 的果蝇数量远少于 y-w- 果蝇。
- 对每只 y-w-RFP+ 果蝇进行单对交配，因为每次移位事件可能发生在不同位置。将 RFP 标记定位至正确的染色体。通常情况下，正确染色体靶向率可达 >95%。
- 建立稳定品系，并采用 Southern 印迹分析等标准技术验证靶向是否正确。设计一个位于靶基因上游（左臂）和下游（右臂）各 2 kb 的探针，以及一个跨越被删除 ORF 区域的 2 kb（必要时可更短）探针。前两个探针在纯合和杂合敲除个体中会产生野生型所没有的特异性条带，而 ORF 探针在纯合敲除个体中则无条带出现。也可通过快速 PCR 检测 ORF 区域，但该方法依赖于目标条带的缺失来判断结果。
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结果
扩增LA和RA同源臂应产生500 bp的产物，PCR-SOE反应应得到1.0 kb的产物（第2.1–2.4节；图2）。第2.5节中进行的BP反应通常效率很高，将产物转化至细菌后平均可获得5–100个菌落。几乎所有经PCR检测的菌落均显示出预期的PCR产物。
在第一轮重组工程（第3节）中，将含有左同源臂（LA）和右同源臂（RA）的经酶切处理的P[acman]-KO-1.0质粒转化至SW102细胞后，预期可获得20–40个菌落。其中40–60%的克隆将携带目标重组产物。与热激处理的细胞相比，非热激对照组应几乎没有或仅有极少量菌落。若样品组与对照组平板上的菌落数量相近，通常表明存在未切割的质粒或其他污染物。在此情况下，应弃去实验并重新进行，此次需严格按照步骤3.2所述条件，确保携带左、右同源臂的P[acman]-KO-1.0质粒完全酶切。在约获得60个菌落的情况下，对目标基因组区域是否成功回收至P[acman]-KO 1.0进行PCR验证的示例如图3所示。在该示例中，经检测的菌落中有60%携带目标重组产物。必须注意观察到...
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讨论
遗传模式生物在生物医学研究中的强大作用在很大程度上依赖于可用于遗传操作的工具。尤其是小型模式生物 C. elegans 和 Drosophila，能够以较低成本快速开展针对参与多细胞发育或功能的完整通路及基因家族的分子遗传学分析。近年来，在 Drosophila 基因操作工具的开发方面取得了显著进展14,15。例如，原本广泛应用于小鼠遗传学中以操作Bac DNA构建体的重组工程（recombineering）技术，最近已通过P[acman]载体和ΦC31介导的转基因技术被成功应用于Drosophila6。利用具有重组能力的细菌，结合不同的筛选盒，可在构建体内的任意位置插入或删除特定序列4,13。我们对原始的P[acman]载体进行了改造，使其可用于构建靶向Drosophila内源位点的体内同源重组载体。该新型载体能够生成比传统“剪切-粘贴”克隆方法更易构建的、具有更长同源臂的靶向盒。此外，该载体还整合了Gateway克隆盒，可快速高效地将新的基因组DNA引入系统中。...
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披露
作者对本文所述技术不存在任何利益冲突。
致谢
我们感谢Hugo Bellen和Bloomington品系中心提供的试剂。我们还感谢Koen Venken、Hugo Bellen以及Buszczak实验室和Hiesinger实验室所有成员的有益讨论。本研究得到了美国国立卫生研究院向ACR（T32GM083831）、PRH（RO1EY018884）和MB（RO1GM086647）提供的资助，以及得克萨斯州癌症预防研究所向MB和PRH（RP100516）提供的资助，还有Welch基金会（I-1657）向PRH提供的资助。MB是UT西南医学中心生物医学研究领域的E.E.和Greer Garson Fogelson学者，PRH是该中心生物医学研究领域的Eugene McDermott学者。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SW102 重组活性细菌 | NCI-Frederick | 重组细菌（SW102、SW105 和 SW106） | http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx |
| TransforMax EPI300 电转感受态 E. coli | Epicentre | EC300110 | 包含 CopyControl 诱导溶液 |
| PfuUltra II Fusion HS DNA 聚合酶 | Aligent Technology Inc. | 600670 | |
| BamHI-HF | 新英格兰生物实验室（New England Biolabs） | R3136S | |
| Zymoclean 凝胶 DNA 回收试剂盒 | Zymo Research | D4001 | |
| Gateway BP Clonase II 酶试剂盒 | Invitrogen | 11789-020 | |
| P[acman]KO1.010 | Buszczak 和 Hiesinger 实验室 | 按需提供 | |
| pENTR RFP-Kan11 | Buszczak 和 Hiesinger 实验室 | 按需提供 | |
| 果蝇品系 | Bloomington 品系中心 | 品系编号：25680、25679 | y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1 |
| 电穿孔仪 | Biorad GenePulser Xcell 配 PC 模块 | 165-2662 | |
| 电转杯 | Fisher Brand | #FB101 |
参考文献
- Rong, Y. S., Golic, K. G. A targeted gene knockout in Drosophila. Genetics. 157, 1307-1312 (2001).
- Rong, Y. S., Golic, K. G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 288, 2013-2018 (2000).
- Gong, W. J., Golic, K. G. Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36(2005).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).
- Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314, 1747-1751 (2006).
- Venken, K. J., et al. Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster. Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).
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- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).
- Chan, C. C., et al. Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila. Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).
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- Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells. Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).
- Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering. Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).
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