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方法文章

PRP 作为一种预防感染的新方法：制备与 体外 PRP的抗菌特性

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DOI：

10.3791/50351

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2013年4月9日

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1Department of Orthopaedics, School of Medicine, West Virginia University , 2Department of Orthopaedics, Stem Cell Research Center, University of Pittsburgh, 3WVNano Initiative, 4Mary Babb Randolph Cancer Center

本文内容

摘要

与植入物相关的感染是一种重要的临床并发症。本研究介绍了一种利用富血小板血浆（PRP）预防植入物相关感染的方法，提供了制备血小板浓度恒定的PRP的实验方案，并报道了PRP newly identified 的抗菌特性以及用于检测这些抗菌特性的相关实验方案 体外

摘要

由于抗生素耐药性日益增强、耐药菌在动物与人类之间的传播以及治疗感染的高昂成本，植入物相关感染正对全球医疗行业带来越来越大的挑战。

本研究中，我们提出一种新策略，该策略可能通过富血小板血浆（PRP）潜在的抗菌特性，有效预防植入物相关感染。由于PRP（一种生物制品）在促进组织修复方面已有充分研究，其临床应用日益广泛，包括骨科手术、牙周及口腔手术、颌面外科手术、整形外科手术、运动医学等。

PRP 可能是预防植入物相关感染的传统抗生素治疗的一种先进替代方案。与传统抗生素治疗相比，使用 PRP 可能具有优势，因为 PRP 诱导抗生素耐药性的可能性较低，且 PRP 的抗菌作用和促进愈合特性可能在预防感染方面产生协同效应。众所周知，病原体与人体细胞会竞争植入物表面，而 PRP 促进愈合的特性可能增强人体细胞的黏附，从而降低感染风险。此外，PRP 本身具有生物相容性，安全性高，且无传染性疾病传播风险。

在本研究中，我们选取了多种常引起骨科感染的临床细菌菌株，并检测了富血小板血浆（PRP）是否对其具有 体外 对这些细菌具有抗菌特性。我们采用两次离心法制备PRP，该方法可使所有样本获得相同的血小板浓度。我们获得了稳定的抗菌结果，发现PRP具有显著的抗菌作用 体外 对甲氧西林敏感和甲氧西林耐药细菌的抗菌特性 金黄色葡萄球菌， A组 链球菌，以及 Neisseria gonorrhoeae因此，PRP 的使用可能有助于预防感染，并减少对昂贵的植入物相关感染术后治疗的需求。

引言

植入物相关感染是一种重要的临床并发症。金黄色葡萄球菌（S. aureus）是植入物相关感染中分离到的最常见微生物之一。该菌能够形成覆盖在植入物表面的生物膜，可能导致抗生素耐药性感染1,2。治疗植入物相关感染通常需要长期住院，进行反复清创以及长期的肠外抗生素治疗。在抗生素耐药的情况下，可能需要移除植入物。细菌对抗生素耐药性的不断上升已被美国疾病控制与预防中心（CDC）称为“全球最紧迫的健康问题之一”。若不开发新的有效抗菌治疗方法，未来多重耐药病原体可能无法用常规抗生素治愈。因此，预防植入物相关感染至关重要，亟需新的预防性药物或策略来防止此类感染的发生。

富血小板血浆（PRP）是一种自体血液的浓缩物，含有超过30种生长因子，有助于骨组织及骨移植材料的愈合3-5。由于血小板释放的多种生长因子浓度较高，临床上关于应用PRP促进骨再生和软组织成熟的报道日益增多。

PRP 的若干特性表明，PRP 可能也具有抗菌特性6-9。PRP 含有大量血小板、高浓度的白细胞（可能对细菌和真菌具有宿主防御作用）以及多种抗菌肽7,8,10。在一项针对大量心脏外科患者的大样本研究中发现，术中在伤口闭合时使用 PRP 凝胶可显著降低浅表性和深部胸骨感染的发生率11。基于这些理由和观察结果，我们提出假设：PRP 除了已被广泛研究的促进愈合特性外，还具有抗菌特性。使用 PRP 预防感染的潜在优势可能包括：（i）与传统抗生素治疗相比，PRP 诱导耐药性的可能性更低。（ii）PRP 还具有促进愈合的特性，可能对预防感染产生协同作用；PRP 的促愈合特性可形成一种屏障，阻止细菌黏附，从而降低感染风险，因为病原体与人体细胞在植入物表面存在竞争性黏附12,13。（iii）PRP 本身具有生物相容性，安全且无传播性疾病的风险。

我们的长期目标是将富血小板血浆（PRP）作为一种预防植入物相关感染的新方法。本研究的目的是采用两次离心法制备PRP，检测PRP的体外抗菌特性，并描述评估此类抗菌特性的实验方案。

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方案

1. PRP 的制备与激活

1.1 采血

  1. 通过吸入异氟烷（2% 溶于O₂）对兔子进行麻醉。2 用于诱导和维持（诱导用1%，维持用1%）。
  2. 吸取 2 ml 0.129 M 的三钠柠檬酸（抗凝溶液）至一支 20 ml 注射器中。该三钠柠檬酸溶液的制备方法为：将 1.897 g 三钠柠檬酸溶解于 50 ml 蒸馏水 H2O 并使用 0.22 μm 无菌滤器过滤。
  3. 使用70%乙醇对兔耳进行消毒。
  4. 采血（例如 通过连接至注射器的蝶形针（25 G）从兔耳静脉采集 5 ml 血液。
  5. 将血液与枸橼酸三钠溶液轻轻混匀，血液与枸橼酸三钠溶液的体积比为9:1。

1.2 PRP 的制备（图 1）

  1. 将抗凝血液转移至一个50 ml塑料离心管中。取10 μl血液样本，用于通过血细胞计数法测定基础血小板计数。
  2. 在配有摆动转子的离心机中，以300 × g离心10分钟，室温（RT）条件下进行。将加速度和刹车速度均设为低档（图1）。
  3. 离心后，血液分为三层。底层主要为红细胞，中间层（通常称为“白膜层”）富含血小板和白细胞，上层主要为血浆（血液的液体成分）以及部分血小板（图1）。小心将离心管转移至细胞培养罩内，避免扰动各层。使用1 ml塑料移液器，将全部血浆、白膜层以及约2–3 mm厚的红细胞层转移至一个15 ml塑料离心管中。
  4. 将上述转移的样本再次离心，3,000 × g离心15分钟，室温（RT）条件下进行。上层液体（上清液）为血小板贫乏血浆（PPP），将其转移至新的离心管中。
  5. 通过使用PPP调节剩余血液样本中的血小板浓度，获得PRP，使血小板浓度达到2.0 × 106 个/μl（通过血细胞计数法确定）。

1.3 PRP 激活

  1. 通过将 5,000 IU 牛凝血酶溶解于 5 ml 10% 氯化钙中，配制工作浓度为 1,000 IU/ml 的 PRP 激活液。
  2. 将激活液加入 PRP 和 PPP 中，并通过反复吹打混匀溶液，形成 PRP 凝胶和 PPP 凝胶。激活液与 PRP 或 PPP 的体积比为 1:4。

2. 体外 使用杀灭曲线法对PRP进行抗菌测试（图2)

  1. 使用无菌接种环，从S. aureus的过夜平板培养物中挑取数个菌落，接种于含有5 ml Mueller Hinton肉汤（MHB）的塑料管中。短暂涡旋混匀后，于37 °C孵育2小时。随后，使用分光光度计测定细菌培养液的光密度，并根据预先建立的标准曲线，调整至光密度相当于约1 × 108 CFU/ml。
  2. 用PBS进行100倍稀释，获得1 × 106 CFU/ml的菌悬液，并将接种物置于冰上保存。
  3. 准备并标记无菌的一次性5 ml圆底聚苯乙烯试管，按照表1所示设置以下各实验组，每管终体积为2 ml。
  4. 先向聚苯乙烯试管中加入PRP、PPP或PBS，随后加入凝血酶溶液以启动凝胶形成。接着加入MHB，最后加入S. aureus接种物（1 × 106 CFU/ml），使终浓度达到1 × 105 CFU/ml。
  5. 将试管置于37 °C，以150 rpm的转速进行振荡孵育。
  6. 在预设的时间点（例如 0、1和2小时），通过反复吹吸混匀各管中的溶液（此步骤至关重要，因为细菌可能被包裹在PRP凝胶内）。取10 μl样品，用无菌0.9%生理盐水进行系列稀释，然后取每种稀释液100 μl涂布于胰蛋白酶大豆琼脂平板（TSA，含5%羊血）上，用于CFU计数。
  7. 将琼脂平板于37 °C过夜培养，随后计数并记录平板上的菌落数。以时间为横坐标（小时），CFU/ml为纵坐标，在对数坐标系中绘制数据曲线。

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结果

PRP 通过两次离心法可重复地制备（图1发现PRP具有显著作用（菌落形成单位减少高达100倍） 体外 对耐甲氧西林的抗菌特性 S. aureus （耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）（图3），在全球范围内的医院中普遍存在 14同样，PRP 对甲氧西林敏感菌具有强效的抗菌特性 S. aureus （MSSA），A组 链球菌，以及 Neisseria gonorrhoeae.

两次离心法可获得相同血小板浓度的富血小板血浆（PRP）即 2.0 × 106 血小板μl）但在血液中浓度较高（约为基线水平的10倍； 图4）并使我们能够获得一致的抗菌结果；不同个体动物的PRP在CFU结果上无显著差异（即 已观察到兔子。

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讨论

由于富含血小板血浆（PRP）具有促进愈合的特性，其在临床应用中日益广泛15-17。在本研究中，PRP被提出作为一种预防感染的新方法。研究发现，PRP对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌（MSSA）、A族链球菌以及淋病奈瑟菌具有显著的抗菌作用。与传统抗生素治疗相比，PRP在预防感染方面具有以下主要优势：（1）目前的抗生素治疗正面临挑战，包括日益增多的抗生素耐药性报道14,18-20。PRP可能成为一种先进的替代方案，因为(i) PRP中的血小板杀菌蛋白可能具有趋化性，可吸引中性粒细胞、单核细胞和T细胞等免疫细胞，这些细胞在抵御病原体入侵中发挥重要作用21；且(ii) 与传统抗生素相比，由于细菌难以改变其细胞膜结构，血小板杀菌蛋白更不易诱导细菌产生耐药性22。（2）PRP不仅能减少感染，还能促进伤口愈合；而感染和伤口愈合均在创伤、时间和经济成本方面代价高昂。

富血小板血浆（PRP）近年来受到越来...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢 Therwa Hamza、John E. Tidwell、Nina Clovis 和 Suzanne Smith 提供实验协助，并感谢 Suzanne Smith 进行校对。作者还感谢 John Thomas 博士提供细菌临床分离株，以及 John B. Barnett 博士的支持，以及允许使用西弗吉尼亚大学微生物学、免疫学与细胞生物学系的生物安全实验室。作者感谢骨科内固定与创伤护理基金会和美国国家科学基金会（#1003907）提供的经费支持。显微镜实验和图像分析还在西弗吉尼亚大学影像设施中完成，该设施部分由 Mary Babb Randolph 癌症中心和美国国立卫生研究院资助项目 P20 RR016440 支持。

动物采血使用已获得西弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准。所有实验均按照所有相关指南、法规和监管机构的要求执行。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牛凝血酶King Pharmaceuticals, Inc60793-215-05凝血酶（牛源）
氯化钙King Pharmaceuticals, Inc60793-215-0510% 氯化钙
乙醇Sigma-AldrichE7023
异氟烷巴克斯特1001936060
Mueller Hinton 肉汤Becton, Dickinson and Company275710
磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichD8662
三水合柠檬酸钠Sigma-AldrichW302600
胰蛋白胨大豆琼脂Fisher ScientificR01202
离心Kendro Laboratory Products750043077
注射器滤器默克密理博SLGP033RS

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