利用重组核心组蛋白和核小体定位DNA组装核小体阵列

摘要

本文介绍了一种利用重组核心组蛋白和串联重复的核小体定位DNA重建模型核小体阵列的方法。我们还描述了如何通过分析型超速离心机中的沉降速度实验以及原子力显微镜（AFM）来监测重建后核小体阵列的饱和程度。

摘要

沿DNA分子重复排列的核小体核心组蛋白八聚体称为核小体阵列。核小体阵列可通过两种方式获得：从体内来源纯化，或在体外由重组核心组蛋白和串联重复的核小体定位DNA重新构建。体外重建方法的优势在于能够组装出组成更均一、定位更精确的核小体阵列。分析型超速离心机中的沉降速度实验通过分析大分子在离心力作用下在溶液中迁移的速率，提供有关其大小和形状的信息。该技术结合原子力显微镜，可用于质量控制，确保重建后的大多数DNA模板均被核小体饱和。本文描述了重建毫克量级、长度和组成明确的核小体阵列所需的实验方案，适用于染色质结构与功能的生物化学和生物物理研究。

引言

真核生物的基因组并非以裸露的DNA形式存在，而是通过结合蛋白质进行压缩和组织。这种DNA与蛋白质的复合物被称为染色质。染色质的基本重复单位是核小体。一个核小体由组蛋白八聚体以及缠绕在该八聚体上约1.6圈的146个碱基对的DNA组成¹。组蛋白八聚体由两份核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4组成。沿DNA分子重复排列的核心组蛋白八聚体称为核小体阵列。核小体阵列的伸展结构被称为10 nm纤维或“串珠”结构，在低盐条件下体外存在²。10 nm纤维可通过阵列内压缩和/或阵列间寡聚化进一步凝聚成更高级的结构²。这些高级结构可在盐的存在下被诱导形成，也可通过染色质结构蛋白与核小体阵列的结合而受到影响^3,4。染色质压缩程度与体内转录速率呈负相关^5,6。近期研究强调了基因组结构组织在细胞分化、癌症发生等过程中的重要性^7,8。利用核小体阵列研究染色质结构与功能的方法已得到广泛应用。本文描述了一种利用重组核心组蛋白和核小体定位DNA组装核小体阵列的方法。

使用含有核小体定位序列串联重复的重组DNA，可重建具有规则排列核小体的阵列。其中两种较为常用的定位序列是5S rRNA基因序列和“601”序列^9,10。601序列来源于SELEX实验，其核小体定位能力比5S序列更强¹¹。因此，601阵列的....

方案

1. 重组核心组蛋白的八聚体组装

原理：核小体阵列重建的第一步是从冻干的重组核心组蛋白中制备天然的核心组蛋白八聚体。将核心组蛋白以等摩尔量混合，并通过透析使样品从变性缓冲液转入复性缓冲液，从而组装成组蛋白八聚体。

1. 纯化并冻干重组核心组蛋白（H2A、H2B、H3、H4），步骤如下所述¹³.
2. 将每种冻干的核心组蛋白约 5 mg 溶解于 3 ml 变性缓冲液（6 M 盐酸胍，20 mM Tris pH 7.5，5 mM DTT）中。每份样品溶解时间至少为一小时，确保容器壁上无残留蛋白质。
3. 使用去折叠缓冲液作为参比，在276 nm处测定每种组蛋白的吸光度。
4. 使用各组蛋白的消光系数计算其摩尔浓度（参见 表1 用于 非洲爪蟾 组蛋白消光系数）。将根据吸光度测定的组蛋白浓度与冻干重量进行比较，并评估大部分蛋白质是否已溶解。
5. 确定哪种组蛋白的摩尔数最少，因为这将决定所有组蛋白的摩尔数上限。
6. 等摩尔量混合组蛋白，并用变性缓冲液稀释至终浓度为1 mg/ml。
7. 将样品放入截留分子量为6-8 kDa的透析管中。密封透析管并置于2 L冷变性缓冲液（2 M NaCl，10 mM Tris pH 7.5，1 mM EDTA，5 mM β-巯基乙醇）中。
8. 在 4 °C 下搅....

结果

为了说明该实验方案，我们使用重组的Xenopus核心组蛋白和含有12个串联重复的207 bp 601定位序列（601²⁰⁷ × 12）的DNA重建了核小体阵列。我们首先将冻干的核心组蛋白组装成天然八聚体，然后使用S200柱通过FPLC纯化八聚体（图1A）。较大的复合物会更早从S200柱中洗脱出来。组蛋白通常按以下顺序洗脱：非特异性组蛋白聚集体、组蛋白八聚体、H3/H4四聚体以及H2A/H2B二聚体（图1A）。S200柱洗脱峰通过SDS-PAGE进行分析。纯化的八聚体组分的凝胶应显示四种组蛋白蛋白的等摩尔比例（图1B）。需要注意的是，Xenopus H2A和H2B的分子量仅相差约200 Da，因此在SDS凝胶上表现为单一蛋白条带。H3/H4四聚体和H2A/H2B二聚体会在组蛋白八聚体峰之后洗脱，但非常接近该峰。在选择保留的组分时，应谨慎丢弃色谱图中八聚体峰末尾部分的组分，因为这些组分可能含有较多非八聚体形式的组蛋白复合物。本实验中，收集并保存了第64至67号组分用于核小体阵列的重建.......

讨论

模型核小体阵列是一种非常有用的工具，用于 体外 染色质结构与功能的研究。例如，它们已被广泛用于研究染色质纤维在溶液中的凝聚机制 ^30-34，并使得获得四核小体的X射线结构成为可能 ³⁵近年来，它们已被证明在解析特定核心组蛋白变体、突变体及翻译后修饰的结构效应方面具有重要作用。^14-16,36本文介绍了一种利用核小体定位DNA和重组核心组蛋白组装模式化核小体阵列的通用方法。

从纯化的八聚体和601序列重建核小体阵列²⁰⁷ x 12 DNA 的制备过程较为直接，包括若干透析步骤，逐步将 NaCl 浓度从 2 M 降至 2.5 mM。该方案中最困难的部分是选择合适的 r 值，以达到所需的模板饱和度。合适的 r 值首先通过小规模实验经验性确定，然后在更大规模上重复操作，以制备用于实验的核小体阵列。在本例中，我们试图获得 601²⁰⁷ x 12 DNA 模板，每条 DNA 上大多结合 12 个核小体。完全饱和的 601 的沉降系数²⁰⁷ 含有1.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷	Sigma-Aldrich	A3648-100ML
6-8 kDa 截留分子量透析管	Fisher	21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 层析柱	GE	17-1069-01
Vivaspin 50 kDa 截留分子量离心浓缩管	Sartorius	VS2031
12-14 kDa 截留分子量透析管	Fisher	08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine	GE	17-0476-01
XL-A/I 分析型超速离心机	Beckman-Coulter