TruTip 是一种简单的核酸提取技术，其将多孔的单体结合基质插入移液器吸头中。因此，该样本制备格式与大多数液体处理仪器兼容，可用于多种中高通量的临床应用和样本类型。
方法文章
高通量、自动化从临床样本中提取 DNA 和 RNA 的方法——基于通用液体处理机器人上的 TruTip 技术 关键词：DNA 提取，RNA 提取，临床样本，高通量，自动化，TruTip 技术，液体处理机器人
本文内容
摘要
摘要
TruTip 是一种简单的核酸提取技术，其原理是将一种多孔的单体结合基质插入移液器吸头中。该单体的几何结构可适配体积范围从 1.0 到 5.0 ml 的特定移液吸头。单体具有高度孔隙率，可使黏稠或复杂的样本在极低流体反压的情况下顺利通过。双向流动设计可最大化样本与单体之间的接触时间，并支持在单个 TruTip 中处理大体积样本。无论样本体积或 TruTip 几何结构如何，其基本步骤均包括：细胞裂解、核酸结合至 TruTip 单体的内孔中、洗去未结合的样本组分和裂解缓冲液，以及将纯化并浓缩的核酸洗脱至适当的缓冲液中。TruTip 的特性与适应性已在三种自动化临床样本处理方案中得到验证，所使用的液体处理机器人包括 Eppendorf epMotion 5070、Hamilton STAR 和 STARplus，分别用于从鼻咽抽吸物中分离 RNA、从全血中提取基因组 DNA，以及从大量母体血浆中提取和富集胎儿 DNA。
引言
核酸纯化是大多数分子诊断、仅限研究用途以及生命科学应用所必需的步骤。自苯酚/氯仿提取法问世以来，已发展出多种方法，其中许多方法基于核酸在变性盐存在下与二氧化硅结合的基本原理1。通过采用基于微珠和膜的各种形式，提取过程已得到简化并实现自动化，其中离心滤器、磁珠及相关方法主导了生命科学行业（参见2-13中的示例）。尽管这些方法有效，但在处理具有挑战性的临床样本基质时，颗粒和膜存在已知的局限性。例如，膜和基于微珠的层析柱具有可变形性，孔径较小（因此反压较高），需要某种支撑结构才能通过离心机或真空系统进行处理。膜和微珠柱的物理特性导致显著的流体阻力，限制了可高效处理的样本类型，防止耗材堵塞，同时也限制了可通过流路单向处理的总（输入）样本体积。相反，磁性颗粒必须通过振荡分散在整个样本中。在溶液中均匀分布磁性颗粒的需求限制了大多数磁珠耗材可处理的总输入样本体积。临床样本的特性（如黏度或复杂性）可能导致磁性颗粒在试管或棒状物侧面无法有效富集。此外，在提取过程中，二氧化硅细小颗粒可能从微珠上脱落，失去磁性并污染最终样本。
TruTip 技术的开发旨在克服上述核酸样本处理中的一些限制与不足14。通过在移液枪头内嵌入多孔整体柱，降低了流体反压，从而可通过真空（即移液吸取）实现流动控制。该特性使得从难以处理的样本类型中纯化核酸所需的提取流程和仪器设备得以极大简化（图1）。整体柱的几何结构和孔隙率经过优化设计，以最大限度减少堵塞，而其厚度则提供了足够的核酸结合容量，适用于1.0至5.0 ml范围内的样本体积。在样本吸取和分配过程中实现双向流动，可延长样本提取物与结合整体柱之间的接触时间，从而实现高效的核酸回收与洗脱，并能够处理超过移液枪头自身体积容量的相对大体积样本。我们此前已报道了一种手动 TruTip 方法的开发与应用，该方法使用单通道或多通道 Rainin 移液器从鼻咽样本中纯化流感病毒RNA15。在每毫升鼻咽抽吸物含106拷贝流感病毒A基因的情况下，自动化的QIAcube方法与手动TruTip方法获得了相当的提取效率。本研究的目的是展示利用参考临床实验室中常见的液体处理机器人，实现中高通量自动化TruTip核酸纯化流程，适用于鼻咽抽吸物（NPA）及其他具有临床意义的样本类型。
方案
本文描述并演示了三种自动化的 TruTip 提取方案：1）使用 Eppendorf epMotion 5070 从鼻咽拭子样本中进行中等通量的 RNA 提取；2）使用 Hamilton STAR 从小体积全血中进行高通量基因组 DNA 提取；3）使用 Hamilton STARplus 从大量孕妇血浆中选择性分离和富集片段化的胎儿 DNA。自动化脚本由 Akonni 提供，本文仅提供高层次的程序描述。在处理临床样本之前，自动化脚本会自动将提取和洗脱试剂从大量试剂槽中分配至 96 孔板。
1. 从鼻咽抽吸物中自动提取RNA
先前描述的手动 TruTip 方法15现已改进，可在 Eppendorf epMotion 5070 液体处理机器人上运行，使用嵌入 1.0 ml Eppendorf 吸头中的大孔径 TruTip 基质、2 ml 深孔板（USA Scientific）、Akonni TruTip 提取试剂，并以 NPA 作为样本类型。epMotion 5070 液体处理机器人可同时容纳最多 8 个吸头，因此本文描述的基础自动化方案适用于 8 个平行提取。然而，在单个程序中，可在一块深孔 96 孔样本板上处理多达 24 个样本。若需处理 16 或 24 个样本，则需使用单独的 epMotion 程序。下述方案适用于 8 样本的自动化脚本。
设置
- 在开始提取之前，将鼻咽样本恢复至室温。
- 向样本板第1列中加入100 μl鼻咽抽吸液和150 μl无核酸酶水（图2A）。
- 将样本板放置于epMotion工作台的B1位置（图2B）。
- 将移液吸头、TruTips和30 ml试剂槽分别放置于epMotion工作台的指定位置（图2B）。
- 打开Eppendorf epBlue软件，选择Akonni提供的适用于8个样本的运行文件，并点击“运行”选项卡中的RUN按钮以加载方法。
- 在液面传感器设置下，选择“液面和吸头”，然后点击RUN按钮。
- 在软件中输入样本体积，然后点击RUN。
- epMotion程序将提示用户将提取和洗脱试剂加入工作台B2位置的试剂储液槽中。请将推荐体积的每种试剂分别加入对应的槽中。对于8个样本，所需试剂最小体积如下：
| 试剂 | 体积 (ml) | 槽位位置 |
| 95% 乙醇 | 3.5 | 2 |
| 洗涤缓冲液 D | 9.0 | 3 |
| 洗涤缓冲液 E | 9.0 | 4 |
| 洗脱缓冲液 A2 | 1.3 | 5 |
| 裂解与结合缓冲液 D | 11.0 | 6 |
- 在上述第8步提示期间，将试剂体积输入epMotion软件显示的表格中。输入值应反映用户实际加入各个试剂储液槽的缓冲液体积，且必须大于或等于上述标注的最小体积。输入体积错误可能导致epMotion硬件向96孔板的各管或各孔中分配不正确的体积。
自动程序
- 选择“运行”以启动自动化程序。自动化脚本将自动执行以下步骤，无需用户干预：
样本裂解与试剂分配：- 向第1列中加入375 μl 裂解缓冲液D，并混合10个循环（吸取并排出为1个循环）。此步骤开始样本在裂解缓冲液D中的孵育过程，同时其余试剂被分配至相应位置。
- 向第2列中加入1.6 ml 洗涤缓冲液D。
- 向第3列中加入1.6 ml 洗涤缓冲液E。
- 向第4列中加入50 μl 洗脱缓冲液A。
- 暂停6分钟，以完成样本在裂解缓冲液D中总共10分钟的孵育。
- 向第1列的每个孔中加入375 μl 乙醇，并通过10次移液循环使每个样本与乙醇充分混合。
- 从工作台A2位置装载8个TruTip，开始执行图1中所示的提取流程。
- 从样本板第1列中吸取并排出样本/裂解缓冲液/乙醇混合液共7个循环，使核酸结合到TruTip整体柱上。尽管样本流经TruTip的速度可能有所不同（由于临床样本黏度差异），但这些样本的核酸得率不受流速变化的影响。改善样本流速的方法详见讨论部分。
- 将TruTip移至样本板第2列，使洗涤缓冲液D在整体柱上循环5次，以去除残留的裂解缓冲液和样本基质。
- 将TruTip移至样本板第3列，使洗涤缓冲液E在整体柱上循环5次，以去除结合的核酸上的蛋白质及其他污染物。
- 将TruTip移至工作台B2位置的空试剂储液槽1号位，并以快速流速循环80次，以干燥整体柱。彻底干燥TruTip至关重要，因为洗脱的核酸样品中残留的溶剂会对逆转录酶和Taq DNA聚合酶等酶产生不利影响。
- 将TruTip移至样本板第4列，在洗脱缓冲液A中循环5次。此时提取并纯化的核酸已存在于样本板第4列各孔的洗脱缓冲液中。
- 将TruTip弹出至epMotion的废料桶中。
- 程序结束后，手动将样本板从仪器中取出，并将纯化的核酸转移至新管中用于长期保存或后续使用。高级epMotion用户可根据需要，在运行文件中添加指令，将洗脱的样本转移至独立的储存管或PCR板中。
对于总共16个样本的程序，将使用样本板的第5至第8列重复执行步骤10.1至10.13。对于24个样本的程序，分别使用样本板的第5至第8列和第9至第12列，将步骤10.1至10.13重复执行2次。
2. 从全血中提取基因组DNA（96孔板法）
使用 Hamilton STAR 液体处理机器人演示从全血中同时自动化提取 96 个样本。与 epMotion 系统不同，Hamilton STAR 的工作台可选配加热/振荡模块，这对于全血等特定临床基质的酶解消化至关重要。由于该系统可配备 96 通道移液头，因此每个 TruTip 步骤和试剂均有专用的 96 孔板。
设置
- 打开 STAR 仪器和计算机。
- 启动 Hamilton Run Control 软件。
- 打开 Akonni 提供的用于 96 个样本的运行文件。
- 按照 图 3 所示，将实验耗材放置到 STAR 仪器的甲板上。
- 将试剂分配至相应的槽中（体积表示处理 96 个样本所需的最小量）：
| 试剂 | 体积（ml） | 槽位位置 |
| 裂解与结合缓冲液 F | 75 | 5 |
| 95% 乙醇 | 100 | 6 |
| 洗涤缓冲液 J | 175 | 7 |
| K洗涤缓冲液 | 175 | 8 |
| 洗脱缓冲液 A2 | 12 | 9 |
| 蛋白酶K（20 mg/ml）-1) | 8 | 15 |
6. 让样品在室温下平衡。
7. 将样本管放入样本架中（位于 图3 中的4号甲板位置）。将样本1放置在最左侧架的后方位置，并依次逐个向前放置，直至样本96位于右前方位置。
自动程序
- 点击运行文件窗口左上角的“播放”按钮，并输入正在处理的样本数量。自动化脚本将无需用户干预，依次执行以下步骤：
样本裂解与试剂分配- 从每个样本管中转移 200 μl 至加热/振荡模块位置 14 的孵育板中（图 3）。
- 向孵育板的每个样本孔中加入 80 μl 蛋白酶 K。
- 向孵育板的每个孔中加入 600 μl 裂解缓冲液 F。
- 混合溶液 10 个循环，然后在 70 °C、500 rpm 条件下孵育 20 分钟。设定温度 70 °C 可使深孔板内样本温度达到约 60 °C，处于蛋白酶 K 活性范围内。在样本孵育的同时，液体处理系统将继续运行，向相应的板和孔中分配试剂：
- 向位置 13 的深孔板每个孔中加入 100 μl 洗脱缓冲液 A。
- 向位置 10 的深孔板每个孔中加入 800 μl 乙醇。
- 向位置 12 的深孔板每个孔中加入 1.6 ml 洗涤缓冲液 K。
- 向位置 11 的深孔板每个孔中加入 1.6 ml 洗涤缓冲液 J。
- 20 分钟孵育结束后，将样本混合物从孵育板转移至位置 10 的深孔板中，并通过 12 次移液循环进行混合。
- 将试剂吸头弹入废料桶。
提取
该 gDNA 血液提取流程的此部分与 epMotion 流感病毒检测方案非常相似，区别仅在于洗涤试剂的组成和循环次数。Hamilton TruTips 吸头为黑色，因此无法观察液体在 TruTip 内的流动情况。
- 从工作台位置 3 装载 96 个 TruTips。
- 在位置 10 对样本/裂解缓冲液/乙醇混合液进行 10 次吸液和排液循环，使核酸结合到 TruTip 整体柱上。
- 将 TruTips 移至位置 11，对洗涤缓冲液 J 进行 5 次循环，以去除残留的裂解缓冲液和样本基质。
- 将 TruTips 移至位置 12，对洗涤缓冲液 K 进行 5 次循环，以去除结合的核酸上的蛋白质及其他污染物。
- 以高速对 TruTip 进行 40 次循环，进行空气干燥。
- 将 TruTips 移至位置 13，在洗脱缓冲液 A2 中循环 5 次。此时，已提取并纯化的核酸已存在于深孔板的洗脱缓冲液中。
- 将 TruTips 弹入废料桶。
程序结束后，从仪器中取出洗脱板，并将提取的样本转移至适当的管中，用于储存或后续应用。
3. 大体积血浆样本的DNA提取
Hamilton STARplus 仪器用于演示从 5 ml 母体血浆中提取游离胎儿 DNA 的自动化方案。STARplus 系统可支持两个自动移液通道臂，一个配备 8 × 5 ml 通道，另一个配备 8 × 1 ml 通道。这两个臂可并行操作，以每批 8 个样本的方式进行交错处理。初始大体积提取使用 5 ml TruTip，而提取后的核酸的大小分离及进一步浓缩则使用 1 ml TruTip。
设置
- 打开 STARplus 仪器和计算机。
- 启动 Hamilton Run Control 软件。
- 打开 Akonni 提供的用于 8 个大体积血浆样本的运行文件。
- 按照 图 4 所示，将实验耗材放置到 STARplus 仪器平台上。
- 将试剂分别加入对应的储液槽中：
| 试剂 | 体积 (ml) | 槽位 |
| CN-W1 | 17 | 5A |
| CN-W2 | 17 | 5B |
| CN-W4 | 21 | 5C |
| 蛋白酶K (20 mg ml-1) | 5 | 6A |
| EBB | 17 | 6B |
| EBA2 | 5 | 6C |
| CN-W3 | 5 | 6D |
| CN-B2 | 5 | 6E |
| CN-B3 | 5 | 6F |
| CN-L1 | 52 | 7 |
| CN-B1 | 175 | 8 |
- 让样品平衡至室温。
- 将样品管放入样品载体架中（位于 图4 中的3号甲板位置）。样品1置于后侧，随后依次向前排列。
自动程序
由于输入样本体积较大，裂解和匀浆步骤必须在 Hamilton STARplus 仪器外的水浴中进行。自动化程序中需要用户干预的步骤会在句子开头用星号 (*) 标注，并以粗体显示。
样本裂解与试剂分配： 样本与蛋白酶K及裂解缓冲液孵育，以实现样本均质化并释放DNA。
- 在运行文件窗口的左上角选择“播放”按钮。输入正在处理的样本数量、移液枪吸头在工作台上的位置以及TruTips在工作台上的位置。
- 自动化程序将向每个50 ml离心管中加入615 μl蛋白酶K、5 ml血浆和6.2 ml裂解缓冲液CN-L1，然后程序将暂停。
- *从样本工作台上取下50 ml离心管，高速涡旋振荡30秒，并在水浴或加热块中离线孵育30分钟（60 °C）。在将离心管从Hamilton工作台上取下后，继续运行自动化程序，以向相应的板孔中继续添加试剂（图4B 和 4C）：
- 向第9位第1列的每隔一个孔中加入2 ml CN-W1。
- 向第9位第2列的每隔一个孔中加入2 ml CN-W2。
- 向第9位第3列的每隔一个孔中加入2 ml CN-W4。
- 向第9位第4列和第5列的每隔一个孔中加入250 μl EBA2。
- 向第10位第1列的每隔一个孔中加入495 μl CN-B2。
- 向第10位第2列的每隔一个孔中加入1 ml EBB。
- 向第10位第3列的每隔一个孔中加入500 μl CN-W3。
- 向第10位第4列的每隔一个孔中加入500 μl CN-W4。
- 向第10位第5列的每隔一个孔中加入50 μl EBA2。
由于5 ml通道过宽，无法在相邻孔中为每个样本加样，因此自动化程序将试剂加入9号甲板位置深孔板的每隔一个孔中。用于1 ml通道的机械臂在实验方案的排除和浓缩步骤中，同样需要在试剂板中使用每隔一个孔。
添加试剂后，程序将暂停。
- *30分钟60°C孵育后，将50 ml锥形管置于冰上5分钟。
- *将50 ml锥形管放回原来在4号位置甲板样品载体架中的位置，并继续运行自动程序。
- 向每个样品管中加入12 ml结合缓冲液CN-B1，并混匀10次。
大体积提取：使用 5 ml TruTips 从裂解的血浆样本中提取总 DNA。
- 从第2位点取5 ml TruTips，用于大体积核酸提取。
- 在50 ml锥形管中将样品混合物上下移液15次，起始位置为管底，每次移液循环后上移3 mm。此步骤使总核酸结合至TruTip整体柱上。
- 将TruTips转移至第6位点第1列的深孔板中，并在洗液CN-W1中循环1次。
- 将TruTips转移至第9位点第2列，并在洗液CN-W2中循环1次。
- 将TruTips转移至第9位点第3列，并在洗液CN-W4中循环2次。
- 将TruTips转移至第9位点第4列，并高速循环40次以干燥结合基质。
- 将TruTips转移至第9位点第5列，并循环10次以从5 ml TruTips中洗脱结合的核酸。此为大体积洗脱#1。
- 将TruTips转移至第6列，用第二份洗脱缓冲液重复该步骤。此为大体积洗脱#2。
- 将洗脱液#2转移至第9位点第5列，与洗脱液#1合并，弃去TruTips。
去除与浓缩：从提取的样品中去除高分子量 DNA，分离并浓缩剩余的 DNA。
- 将第22步的合并洗脱液加入第10排第1列柱中，并充分混合10次。
- 从第13位取1 ml TruTips，循环20次，使高分子量DNA结合到整体柱上。
- 将TruTips移至第10排第2列，循环5次以清洗尖端并去除高分子量DNA。保留TruTips，并放回第13位的吸头架中。
- 使用第12位的试剂吸头，向第10排第1列样本中加入575 μl 结合缓冲液CN-B3，并混合10次。
- 取第25步的TruTips，返回第10排第1列，循环20次，使样本中剩余的DNA结合到1 ml TruTip上。
- 将TruTips移至第10排第4列，于洗涤液CN-W3中循环1次，以去除任何残留的抑制物。
- 将TruTips移至第10排第5列，于洗涤液CN-W4中循环1次，以冲洗来自CN-W3的残余盐分。
- 将TruTips提起置于第10排第5列上方，通过尖端循环空气35次，以干燥整体柱。
- 将TruTips移至第10排第6列，于EBA2溶液中循环10次，以洗脱纯化后、经片段大小选择并浓缩的核酸。
- 弃置TruTips。
- 将第6列中洗脱的样本转移至第11位的1.5 ml离心管中。提取的样本即可用于储存或后续实验处理。
结果
实时荧光定量 PCR 检测鼻咽抽吸物中流感病毒 RNA 提取结果如图所示 图 5A核酸提取效率的估计值与采用该方案手动版本所获得的结果相似 15. 平均C的线性响应t 在10之间观察到数值4 和 106 基因拷贝数/毫升-1 改良流感R2 = 0.99 和 0.98（分别为甲型和乙型流感病毒），平均 C 的标准差t 小于1个循环。epMotion系统无交叉污染的情况在下文中得到证实。 图5B，其中12份含有10个阳性NPA样本6 基因拷贝数/毫升-1 NPA 中插入了 12 个缓冲液空白对照。平均 Ct 阳性对照的值为 30.16 ± 0.14，所有缓冲液空白对照均为阴性。处理 8、16 和 24 个样本的总样本处理时间分别为 16、28 和 40 分钟。由于典型的临床鼻咽抽吸液或拭子样本通常含有 107 基因拷贝数/毫升-1 （假设每 TCID 感染单位为 1,000 个病毒颗粒）50 16 和 > 104 TCID50 ml-1 流感 17), 自动化 epMotion 方案预期对大多数临床鼻咽拭子标本有效。
鉴于在人类基因组DNA上进行的分子检测种类繁多，从全血中提取核酸的主要目标是获得无污染、高分子量的基因组DNA。该自动化方案可在1小时内完成96个样本的提取，相较于其他自动化系统有所改进，例如 Promega MagneSil = 90 分钟，Qiagen QIAamp DNA Blood BioRobot MDx 系统 = 2.5 小时。 图6A 显示了在Hamilton STAR方案中同时处理的45个阳性血样与45个试剂空白样本的紫外/可见光吸收谱图，其平均A260/280 1.96 的比率和平均 A260/230 1.93 的比率。A260/280 1.7-2.0 与 A 的比值260/230 比率 >1.7 通常表明 DNA 纯度很高，无残留盐类、蛋白质或溶剂，适用于大多数下游分子实验应用。1% 琼脂糖凝胶在 图6B 表明所获得的基因组DNA具有高分子量（> 24 kb），且剪切最少。45个阳性样本的总核酸平均得率为5.26 ± 0.46 μg 人DNA每 200 μl 全血，基于 Life Technologies Quantifiler Human DNA 定量试剂盒。交叉污染研究方法类似于图中所示 图5B 使用阴性对照缓冲液空白样本与阳性样本交替进行，并行提取；所有空白样本的PCR检测结果再次为阴性（未展示）。纯化的gDNA также适用于多种其他基于PCR的分析（未展示）。
使用大体积 TruTip 方法处理的混合母体血浆样本的八个重复样本的实时检测结果如图7所示。完整实验流程（包括离线蛋白酶K孵育）耗时约2.5小时，与Qiagen手动循环核酸提取试剂盒相当（目前尚无类似的自动化提取试剂盒）。所有重复样本中，胎儿男性（CHY）和总（CH1）DNA的平均Ct值分别为34.58 ± 0.66和29.76 ± 0.50，表明该自动化提取方法具有优异的重复性。基于与标准品拟合点分析比较，计算得出总DNA池中胎儿DNA的浓度（以基因组当量计），所有样本中胎儿DNA的平均百分比为2.8%。由于样本在提取前已被混合，该样本的实际胎儿DNA百分比未知。采用TruTip方法提取的未混合血浆样本中，胎儿DNA组成通常比使用Qiagen循环核酸提取试剂盒的结果高1.5倍（未展示）。
图1. TruTip提取过程及工作流程，不受液体处理系统的限制。 其他样本制备或液体处理步骤可根据特定液体处理仪器和软件的功能，整合到自动化程序中。
图2. (A) Eppendorf epMotion 5070 样本板布局。(B) 工作台面上试剂/耗材的排列方式。 样本板最多可配置24个样本（分别位于第1、5和9列），但epMotion每次最多仅处理8个样本。点击此处查看大图。
图3. Hamilton STAR 仪器甲板布局，用于从全血中纯化基因组DNA（未按比例绘制）。 甲板位置1 = Hamilton 1 ml带滤芯吸头；2 = Hamilton 1 ml无滤芯吸头；3 = Akonni/Hamilton 1 ml LPT 2 mm TruTips；4 = 输入血液样本载体（采血管或微量离心管）；5–9 = 分别用于裂解缓冲液F、乙醇、洗涤缓冲液J、洗涤缓冲液K和洗脱缓冲液A2的290 ml试剂槽；10 = 96深孔结合板；11 = 96深孔洗涤J板；12 = 96深孔洗涤K板；13 = 96深孔洗脱板；14 = 配备Nunc 96深孔孵育板的Hamilton HHS2加热/振荡模块；15 = 含蛋白酶K的50 ml试剂槽。 点击此处查看高清大图。
图 4. 用于从大体积血浆样本中纯化 DNA 的 Hamilton STARplus 仪器甲板布局（未按比例绘制）。 该系统配备有 8 个 5 ml 通道和 8 个 1 ml 通道（在甲板布局中未显示）。甲板位置 1 = Hamilton 4 ml 滤芯吸头；2 = Akonni/Hamilton 5 ml TruTips；3 = 源血浆样本；4 = 50 ml 圆底管；5 = 120 ml 试剂槽，内含 CN-W1、CN-W2 和 CN-W4 试剂；6 = 低体积试剂槽，内含蛋白酶 K、CN-B2、CN-B3、EBA2、EBB 和 CN-W3 试剂；7 = 290 ml 试剂槽，内含 CN-L1 试剂；8 = 290 ml 试剂槽，内含 CN-B1 试剂；9 = 用于步骤 1 的 96 孔深孔板；10 = 用于步骤 2 的 96 孔深孔板；11 = 纯化后最终产物的样本载体；12 = Hamilton 1 ml 非滤芯吸头；13 = Akonni/Hamilton 1 ml LPT 4 mm TruTips。 点击此处查看高清大图。
图5. （A）从加入鼻咽抽吸物（NPA）中的流感病毒经自动化TruTip提取后的实时PCR结果。输入NPA体积 = 100 μl，洗脱体积 = 50 μl。 结果为每个稀释水平和流感靶标在5种不同NPA背景中进行3次重复提取的平均值（n = 15）。qPCR在LightCycler 480系统上进行，检测条件如前所述15。（B） 当12个阳性NPA样本与无模板对照交替排列并接受自动化提取程序时，未检测到交叉污染。点击此处查看大图。
图6. 从全血中提取人基因组DNA的结果。 A) 使用NanoDrop 1000（ThermoFisher）对10个随机选取的重复样本测得的紫外-可见吸收光谱。 B) TruTip纯化的基因组DNA在1%琼脂糖凝胶上的电泳结果。M = Fisher 24 kb Max DNA Ladder；泳道1–4 = 四个随机选取的重复样本中各约100 ng的纯化基因组DNA。 点击此处查看大图。
图7. 对血浆中游离循环DNA进行八次重复TruTip提取的实时PCR结果。 以星号（* 或 **）标记的样本在不同日期提取。CHY用于定量男性胎儿DNA，CH1用于定量存在的总DNA（包括胎儿和母体DNA）。qPCR在LightCycler 480系统（Roche）上进行，采用先前发表的针对CHY和CH1的检测方法18。
讨论
TruTip 技术原理和工作流程（图 1）简单明了，可轻松适用于多种临床样本基质、输入样本体积和液体处理系统，易于实现自动化，且高效、有效。然而应当认识到，每种临床样本均具有独特性，在黏度、颗粒物、黏液、表面污染物、微生物和/或人类遗传背景等方面可能存在差异。鉴于临床样本成分的预期差异以及自动化 TruTip 样本制备方案的预期用途不同，因此可能需要对 TruTip 操作中的某些步骤进行调整，以获得特定样本类型的理想结果。然而，无论样本类型如何，通常对核酸纯度和/或回收率影响最为显著的 TruTip 参数包括：
- 使用裂解缓冲液（和酒精）进行样品混合与均质化。 尽管 TruTips 具有相对较大的孔径，样品的均质化和液化对于高效细胞裂解以及后续核酸与 TruTip 整体柱的结合步骤仍至关重要。当裂解液均匀且充分液化后，样品可通过 TruTip 以更高的流速流动，从而缩短整体样品处理时间。大体积血浆方案展示了用户在面对大体积输入样品时，仍可对难处理样品进行彻底均质化和液化的潜力（可在线或离线操作）。
- 流速。 在核酸结合或洗脱过程中，较慢的流速通常可获得更高的核酸得率，但会延长总处理时间。较慢的流速也可能减少 DNA 剪切程度。
- 循环次数。 吸液与排液循环的最佳次数取决于样品类型、总体积和流速。在 图1 的步骤1中，循环次数（和流速）通常需要根据经验进行一定优化，例如鼻咽抽吸物（图5）这类样品，由于不同患者的鼻咽抽吸物黏度差异较大，属于较难优化的裂解液类型之一。
- 干燥。 必须彻底干燥 TruTip 整体柱，以防止残留的有机溶剂随纯化的核酸样品一同洗脱，进而抑制下游反应或检测。由于 TruTip 不通过离心或真空过滤进行干燥，因此在干燥步骤中应尽可能提高流速和循环次数。有时在完成干燥循环后，TruTip 末端仍会残留一滴洗涤液。Hamilton 机器人具备“触碰排液”功能，可通过将吸头轻触孔壁释放液滴，从而确保洗脱液中无溶剂残留。epMotion 系统不具备此功能，但可通过编程在洗脱缓冲液中对 TruTip 末端进行预冲洗，以达到相同效果。
由于每种仪器制造商的几何结构、移液器吸头材料以及与机器人通道臂的连接方式各不相同，因此每种液体处理系统都需要使用不同的TruTip结构。TruTip整体材料的尺寸（直径、厚度和孔径）与核酸结合能力（以及洗脱效率）相关，这与任何固相萃取技术的预期结果一致。尽管较厚的> 4 mm）基质可嵌入1 ml TruTip中，以提高大体积样本的核酸结合容量，或平衡不同TruTip规格之间的结合能力。然而，在初始结合步骤（存在粗裂解液的情况下）中，TruTip的厚度与流速之间存在权衡。因此，在自动化流程的初始步骤中，将更大直径的整体柱嵌入更大体积的移液吸头中有时更具优势，（例如 5 ml Hamilton/Akonni TruTips（用于大体积提取）。然而，由于不同厂家的液体处理机器人对TruTip的配置有特定要求，因此不同厂家的液体处理平台之间，或不同规格的TruTip之间，核酸提取产量未必完全相同。
临床样本（按定义）将含有大量人类基因组DNA，除非这些样本取自通常无菌的部位例如 脑脊液）。有时需要获取人类基因组DNA（例如在 图6），而在其他应用中，人类DNA则代表了一种不需要的基因组背景（例如用于 图5）。只要样品中核酸的总量不超过整体柱的结合容量，背景DNA的存在通常不会造成问题；并且当目标核酸含量极低时，背景DNA还可作为载体发挥作用。高容量血浆提取方案的目的（图7目的是在母体DNA过量10至20倍的条件下分离（片段化的）胎儿DNA，这与传染病检测中的样本制备目标相似，但胎儿与母体DNA序列高度同源，只能通过高特异性的分子检测和/或基于片段大小的区分方法加以鉴别。在此方案中，首先使用5 ml TruTip提取总循环DNA，随后通过改变结合缓冲液条件，利用1 ml TruTip对高分子量和低分子量的胎儿DNA进行分步结合与洗脱，从而实现两者的分离。基于核酸在二氧化硅整体柱上的结合与洗脱特性，实现目标核酸的选择性大小分离与富集，其作用机制显著不同于膜基材料或尺寸排阻型离心柱。未来可通过定制TruTip的结合与洗脱缓冲液，实现微生物DNA与人类基因组DNA的大小分离与富集。
本文展示的自动化方案强调了TruTip整体柱本身在处理多种临床样本方面的实用性，以及如何针对大体积样本和特定液体处理机器人进行适配。与其它自动化系统相比，这些简化的方法通常能够实现更快的提取流程。然而，TruTip技术的简便性还为有意采购新型自动化核酸纯化系统的用户带来一定的成本优势，因为实现TruTip流程自动化所需的主要硬件仅为移液通道臂本身，而无需磁棒、真空系统或内置离心机。使用预填充试剂板还可减少占用空间和所需耗材，并使每次运行的通量提高一倍。采用TruTip方案减少工作站台面占用空间，还可使高级用户将上游或下游的自动化流程与TruTip整合。例如，Hamilton的easyBlood全血分馏解决方案可与自动化TruTip提取方法结合，从而显著简化生物样本库的建库流程。在较大的液体处理平台上，提取后的流程（如核酸定量、归一化、PCR体系构建或DNA测序）也可轻松与TruTip整合。
披露
作者是 Akonni Biosystems, Inc. 的员工，该公司生产本文所用的部分材料。
本文的免费访问和制作由Akonni Biosystems, Inc.赞助。
致谢
本工作的部分研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）R44 AI072784 项目资助。我们感谢纽约州卫生部沃兹沃思中心病毒病实验室的 Kirsten St. George 博士、Sara B. Griesemer、Daryl Lamson 和 Amy Dean 提供定量的流感病毒颗粒以及临床验证的流感实时 PCR 检测方法的使用权限。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂/材料 | |||
| TruTip 流感病毒提取试剂盒（EPM TruTips） |  Akonni Biosystems, Inc. | 300-11120 | |
| 95% 乙醇 | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
| 99% 丙酮 | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
| DEPC 处理水 | Life Technologies | AM9906 | |
| 30 ml 试剂储液槽 | Eppendorf | 960050100 | |
| 深孔板 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
| epT.I.P.S. 运动过滤吸头，1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
| 设备 | |||
| epMotion 5070 系统 | Eppendorf | 5070 000.000 | |
| TM1000-8 分液工具 | 960001061 | ||
| 储液槽架 | 960002148 | ||
| 表 1. 从鼻咽拭子样本中自动化提取 RNA 所需的试剂与设备。 | |||
| 试剂/材料 | |||
| TruTip 基因组 DNA 血液提取试剂盒（Hamilton TruTips） | Akonni Biosystems, Inc. | 300-20341 | |
| 95% 乙醇 | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
| 蛋白酶 K | AMRESCO LLC | E195 | |
| 1 ml Hamilton 过滤式 CO-RE 96 吸头架 | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
| 1 ml Hamilton 非过滤式 CO-RE 96 吸头架 | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
| 50 ml 试剂槽 | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
| 2 ml 深孔板 | USA Scientific | 1896-2800 | |
| Nunc 96 深孔板-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
| 试剂槽 | Fisher | 14-222-412 | |
| 设备 | |||
| Hamilton STAR 系统 | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
| 1 ml 独立移液通道 / 模块化机械臂 | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
| 1 ml 96 通道移液头 | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
| 吸头架 | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
| 样本架/插入件 | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
| 板架 | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
| 多功能载体 | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
| HHS2 加热振荡单元 | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
| 架载体 | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
| 表 2. 从全血中进行 96 孔板基因组 DNA 提取所需的试剂与设备。 | |||
| 试剂/材料 | |||
| TruTip R+D 循环 DNA 提取试剂盒（Hamilton TruTips） | Akonni Biosystems, Inc. | 来电咨询 | |
| 100% 乙醇 | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
| 异丙醇 | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
| 蛋白酶 K | AMRESCO LLC | E195 | |
| 4 ml 过滤吸头 | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
| 1 ml 非过滤吸头 | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
| 96 孔深孔板 | USA Scientific | 1896-2800 | |
| 50 ml 圆锥形离心管 | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
| 50 ml 试剂槽 | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
| 120 ml 试剂槽 | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
| 大容量 96 位试剂槽 | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
| 设备 | |||
| STARplus 自动装载工作站主机 / 甲板模块 | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
| 1 ml 独立移液通道 / 机械臂 | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
| 5 ml 独立通道 / 模块化机械臂 | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
| 板架 | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
| 多功能载体 | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
| 50 ml 试剂槽架载体 | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
| 120 ml 试剂槽载体 | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
| 吸头架 | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
| 50 ml 管架 | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
| 24 位样本架 | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
| 32 位样本架 | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
| 表 3. 从血浆中进行大体积 DNA 提取所需的试剂与设备。 |
参考文献
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