胰岛β细胞胰岛素分泌过程中细胞外蛋白相互作用的共培养分析

摘要

跨细胞蛋白质相互作用是胰岛β细胞功能的重要决定因素。本文详细介绍了一种借鉴自突触生成共培养模型的方法，用于研究特定跨膜蛋白如何影响胰岛素分泌。该方法利用转染的HEK293细胞表达目标蛋白，而β细胞无需转染或以其他方式直接干预。

摘要

细胞表面蛋白之间的相互作用有助于协调相邻细胞的功能。胰岛β细胞在胰岛内聚集在一起，协同作用以维持血糖稳态。越来越多的证据表明，相邻β细胞表面跨膜蛋白之间的相互作用是决定β细胞功能的重要因素。

通过培养的β细胞中的基因敲低、基因敲除或过表达研究，阐明特定跨细胞相互作用的作用 体内 需要直接干扰mRNA和蛋白质的表达，这可能会以影响β细胞健康和/或功能的方式干扰对特定相互作用效应的分析。这些方法还会改变靶向蛋白质胞内结构域的水平，并可能阻碍区分同一细胞膜内蛋白质间相互作用效应与跨细胞相互作用效应。

本文介绍一种用于确定特定跨细胞相互作用对β细胞胰岛素分泌能力及反应性影响的方法。该方法适用于β细胞系（如INS-1细胞）以及分离的原代β细胞。本方法基于神经生物学家开发的共培养模型，他们发现，将培养的神经元暴露于表达在HEK293（或COS）细胞层上的特定神经元蛋白时，可鉴定出对突触形成具有重要作用的蛋白。鉴于神经元突触与β细胞分泌机制之间存在相似性，我们推测β细胞的功能成熟可能也受到类似的跨细胞相互作用驱动。我们建立了一个系统，使β细胞在表达特定目的蛋白的HEK293细胞层上进行培养。在此模型中，β细胞的细胞质不受干扰，而细胞外的蛋白质-蛋白质相互作用则可被调控。尽管本文主要聚焦于葡萄糖刺激的胰岛素分泌研究，但也可分析其他过程；例如，通过免疫印迹或qPCR检测基因表达的变化。

引言

我们在此描述一种方法，用于促进研究特定跨膜蛋白的胞外结构域如何影响胰岛素分泌。该方法可检测目标蛋白与胰腺β细胞表面蛋白（或其他可能分子）相互作用所产生的效应。该方法可用于研究β细胞自身或其他邻近细胞所表达的细胞表面蛋白如何调控胰岛素分泌过程例如 内皮细胞、神经元、胰腺α细胞）通过跨细胞相互作用影响β细胞功能即 通过与相邻β细胞表面的相互作用伙伴的相互作用。

细胞质膜包含一系列复杂的结构和功能蛋白，这些蛋白作为桥梁连接细胞与胞外环境。通过形成跨细胞连接或启动可塑性信号事件，细胞表面蛋白之间的相互作用有助于协调邻近细胞的功能。胰岛β细胞在胰岛内聚集，并协同作用以维持葡萄糖稳态¹。例如，胞外EphA-ephrinA和neuroligin-2相互作用在葡萄糖刺激的胰岛素分泌调控中的重要性已得到证实，这表明，深入了解相邻β细胞表面蛋白之间发生的胞外相互作用，对于全面理解胰岛素分泌、β细胞功能成熟以及葡萄糖稳态的维持具有重要意义^1-3。本文所述方法的目标是促进研究特定跨膜蛋白或其他细胞表面相关蛋白介导的跨细胞相互作用对β细胞功能的影响。通过将β细胞与转染了不同表达载体的HEK293细胞共培养，可高效检测不同细胞表面蛋白或其突变体对β细胞功能的影响，且无需直接转染β细胞本身。

通过培养的β细胞中进行基因敲低、基因敲除或过表达研究，阐明特定跨细胞相互作用的作用 在体 需要直接干扰β细胞中mRNA和蛋白质的表达，这可能会以影响β细胞健康和/或功能的方式干扰对特定细胞外相互作用效应的分析。这些方法还会改变靶向蛋白的细胞内结构域水平，并且进一步无法区分同一细胞上或细胞内蛋白质间相互作用所产生的效应与跨细胞相互作用的效应。本文描述了一种用于确定特定跨细胞相互作用对β细胞胰岛素分泌能力和反应性影响的方法。该方法适用于可分泌胰岛素的β细胞系，例如INS-1细胞⁴，并应用于解离的原代啮齿类或人类β细胞。该方法基于神经生物学家开发的共培养模型，他们发现将培养的神经元与表达特定神经元蛋白的HEK293（或COS）细胞层共培养，可鉴定出驱动突触形成的蛋白质。^5,6鉴于神经元突触和β细胞的分泌机制具有相似性，我们推断β细胞的功能及其功能成熟可能也由类似的跨细胞相互作用所驱动^7-9为了探究这些相互作用，我们建立了本文所述的系统，其中胰岛β细胞与表达目标蛋白的HEK293细胞共培养于一层细胞上。¹⁰该系统可在操控细胞外蛋白质-蛋白质相互作用的同时，保持β细胞胞质不受干扰。

方案

1. 转染 HEK293 细胞层

1. 通过向含有500 ml DMEM（含4.5 g/L葡萄糖和酚红，不含谷氨酰胺）的瓶中添加以下成分来制备HEK293细胞培养基：50 ml胎牛血清（FBS）、5 ml 100倍青霉素/链霉素溶液、5 ml 100倍L-谷氨酰胺溶液以及500 μl两性霉素B。
2. 使用24孔板进行HEK293细胞接种，每孔加入0.5 ml HEK293培养基。确保细胞在孔底均匀分布。
3. 当HEK293细胞达到100%融合度时，根据Lipofectamine转染试剂说明书，使用0.8 μg编码目标蛋白的质粒（插入哺乳动物表达载体中）和2 μl Lipofectamine 2000进行转染。我们选择使用专为哺乳动物细胞表达设计的pcDNA 3.3骨架载体。
4. 可选：转染后6小时，按照Lipofectamine说明书，将转染培养基更换为正常的HEK293培养基。
5. 为评估转染蛋白的表达情况，可取部分转染后的细胞培养孔，采用免疫荧光法检测表达蛋白，或使用标准技术进行蛋白质表达的Western blot分析。

2. 转染蛋白表达HEK293细胞的可选固定步骤

转染的HEK293细胞可进行温和固定，以促进其在可能对活体HEK293细胞有害的培养基中进行共培养例如 步骤3.9）或为多个实验一次性高效地预先制备平板（另见讨论部分）。

1. 进行预实验以确定目标蛋白在 HEK293 细胞中的表达时间进程。
2. 转染 HEK293 细胞层后，在蛋白表达水平最高的时间点吸取细胞培养基。如果该时间点在转染后 24 小时内，则应在转染后 24 小时再进行吸取。
3. 用 D-PBS 轻柔洗涤 HEK293 细胞，然后加入 500 μl 4% 多聚甲醛（PFA），室温孵育 30 分钟。（4% PFA 溶液的配制方法：以 16% 的 PFA 储存液溶于 1×PBS 中，按 1:4 体积比用 1×PBS 稀释。）
4. 使用无菌 PBS 轻柔洗涤细胞 3 次，随后在 4 °C 条件下于 PBS 中过夜孵育（O/N）。
5. 用无菌 PBS 洗涤细胞 3 次，然后加入 PBS 并置于 4 °C 保存，待后续使用（最大保存时间可能因所表达蛋白的不同而异。我们曾将转染以表达神经连接蛋白异构体的 HEK293 细胞保存长达 2 周，未观察到对胰岛素分泌效应的显著变化）。

3. INS-1 胰岛β细胞与HEK293细胞的共培养

1. 配制 INS-1 培养基：向 500 ml RPMI 1640 培养基（含葡萄糖和酚红，不含谷氨酰胺）中加入 50 ml 胎牛血清（FBS）、5 ml 100 倍青霉素/链霉素溶液、5 ml 100 倍 L-谷氨酰胺溶液、5 ml 丙酮酸钠、500 μl 两性霉素 B 和 500 μl β-巯基乙醇（该配方与通常用于原代胰岛培养的培养基几乎相同，仅额外添加了 β-巯基乙醇）。
2. 使用细胞刮（或其它非酶细胞解离试剂），从 T75 培养瓶底部收获汇合度约为 70–80% 的 INS-1 细胞。每瓶细胞大约可满足 48 孔板的接种需求。
3. 将细胞在离心机中以 1,200 rpm 离心 3 分钟后，重悬于体积比为 50/50 的 INS-1 与 HEK 培养基混合液中。对于一皿 70–80% 汇合度的 INS-1 细胞，使用约 25 ml 混合培养基进行重悬。
4. 若使用经多聚甲醛固定的 HEK293 细胞而非活的 HEK293 细胞，则将 INS-1 细胞重悬于 100% INS-1 培养基中，而非混合培养基。
5. 使用 10 ml 移液管将细胞从沉淀中充分吹打，形成均一的细胞悬液。
6. 吸除 HEK293 细胞上的培养基。
7. 使用 p1000 移液器，沿孔壁轻柔地向每孔 HEK 细胞层加入 500 μl INS-1 细胞悬液。每处理 6 孔后，使用 10 ml 移液管再次吹打 INS-1 细胞悬液，以确保悬液均匀。共培养体系的整体设置方案见图 1。
8. 根据实验方案，将细胞孵育 24–48 小时。
9. 若共培养时间超过 48 小时，建议采用上述第 2 节中的可选步骤对 HEK293 细胞进行固定。
10. 若使用原代分离的啮齿类或人类胰岛细胞［例如，参见 JoVE 中先前发表的方案^11–15］，应使用适当的培养基替代 INS-1 培养基，如 RPMI 培养基中添加 5 ml 青霉素/链霉素、5 ml L-谷氨酰胺和 0.5 ml 两性霉素 B。尽管可在 24 孔板中使用分离的胰岛细胞，但实践中由于可能需要大量胰岛，建议考虑缩小至 48 孔板（从而减少每孔所需胰岛细胞数量）。在 48 孔板中，初始接种量建议每孔加入相当于约 100 个胰岛的分离细胞。具体所需胰岛数量取决于解离效率及所用方法，可能可进一步减少。

4. 葡萄糖刺激的胰岛素分泌

1. 将细胞在 250 μl 含 2.5 mM 葡萄糖的 KRB（Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液）中预孵育至少 1 小时。预孵育时，移除共培养培养基，并立即替换为 KRB。此更换操作应逐孔进行，以尽量减少 INS-1 细胞暴露于环境氧。一手进行吸除，另一手同时用移液器加入低浓度（2.5 mM）葡萄糖 KRB。
2. 逐孔将预孵育用 KRB 更换为 250 μl 含 2.5 mM 或 20 mM 葡萄糖的 KRB 缓冲液。
3. 若实验设计需要，可添加额外的促分泌剂（如 100 μM IBMX），以获得更强的刺激性胰岛素分泌反应。分离的原代胰岛 β 细胞单独对葡萄糖浓度升高反应较差，因此尤其建议在此类情况下添加 IBMX 或其他促分泌剂^16,17。
4. 孵育 1 小时后，将培养上清转移至微量离心管中，在 1,500 × g 条件下离心 5 分钟。
5. 吸取 200 μl 上清液，用于胰岛素放射免疫分析（RIA）或 ELISA 检测。
6. 为制备细胞裂解液，在移除培养基后立即向孔板中加入 100 μl RIPA 细胞裂解缓冲液（含 150 mM NaCl、1.0% IGEPAL CA-630 或 Nonidet P-40、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS、50 mM Tris，pH 8.0），并加入蛋白酶抑制剂，于 4 °C 孵育 20 分钟。
7. 将裂解液在 10,000 × g 条件下离心 15 分钟，取 50 μl 上清液用于胰岛素 RIA 或 ELISA 分析。

结果

利用本文所述方法，我们测试了神经连接蛋白（neuroligin）不同变异体对胰岛素分泌的影响。这补充了我们已发表的研究中关于神经连接蛋白-2对β细胞功能影响的工作¹⁰。图2展示的是将INS-1 β细胞与转染表达一种称为NL-X的neuroligin异构体的HEK293细胞共培养所获得的结果。该实验旨在验证NL-X可通过细胞间相互作用促进胰岛素分泌的假设。从图2A可以看出，NL-X的表达提高了共培养的INS-1细胞的基础和刺激性胰岛素分泌水平。通过转染HEK293细胞使其表达NL-X，我们可以明确是NL-X的胞外结构域——即暴露在HEK293细胞表面、因而能够与共培养的INS-1细胞接触的区域——导致了胰岛素分泌的增加。NL-X的胞外结构域必须与INS-1细胞表面的另一种蛋白质（或可能是其他分子）相互作用，才能促使INS-1细胞分泌更多的胰岛素。如有需要，分泌的胰岛素也可表示为细胞内胰岛素含量的百分比，后者可在细胞裂解后测定。

在图2B和2C

讨论

本文所述的共培养方法为确定特定β细胞表面跨膜蛋白（尤其是其胞外结构域）的生理重要性提供了一种有效途径。通过将β细胞或胰岛素瘤细胞（例如本文所用的INS-1细胞）与在细胞表面表达目标蛋白的HEK293细胞进行接触共培养，可设计实验以研究胞外蛋白-蛋白相互作用的影响，同时不直接干扰细胞的胞内环境。由于目标蛋白由HEK293细胞表达，因此转染蛋白的胞内结构域可能介导的对β细胞功能的影响将不存在，从而避免了对胞外相互作用效应分析的干扰。

通过比较与表达目的蛋白的HEK293细胞共培养的β细胞的胰岛素分泌情况，和与对照HEK293细胞直接接触共培养的β细胞的胰岛素分泌情况，可便捷地确定对胰岛素分泌的影响。对照HEK293细胞可为空白转染细胞，或转染了实验性质粒构建体突变体的细胞，该突变体编码的目的蛋白无功能。据我们实验结果显示，这两种类型的对照均得到相同的结果。由于HEK293细胞表面本身含有多种多样的蛋白质，因此无论采用哪一种对照，均可将接触了包括目的蛋白在内的多种不同细胞表面分子的β细胞功能，与接触了相同细胞表面分子组合但不含目的蛋白（或含有目的蛋白突变体）的β细胞功能进行比较。

...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pcDNA 3.3 载体/骨架	Invitrogen	K830001
Lipofectamine 2000	Invitrogen	18324012
DMEM	Mediatech	45001-312
青霉素-链霉素溶液	Mediatech	45001-652-1
两性霉素 B	Mediatech	45001-808-1/30
RPMI-1640	Mediatech	45001-404
D-PBS	Mediatech	45001-434
丙酮酸钠	Mediatech	45001-710-1
2-巯基–乙醇	Invitrogen	21985023
细胞刮	Mediatech	45000-668
T75 培养瓶	BD	1368065
16% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	50980487
10x PBS	Mediatech	45001-130
胎牛血清	Mediatech	MT35010CV
IBMX	Sigma	I5879-100MG
RIPA 裂解缓冲液	Sigma	R0278