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方法文章

高效快速分离早期胚胎 拟南芥 种子

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DOI：

10.3791/50371

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2013年6月7日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Plant Biology and Zürich-Basel Plant Science Center, University of Zürich

本文内容

摘要

我们报道一种高效且简便的方法，用于分离发育早期阶段的胚胎 拟南芥 种子。根据下游应用的不同，可在1至4小时内分离出多达40个胚胎。该方法适用于转录组、DNA甲基化、报告基因表达、免疫染色和荧光检测。 原位 杂交分析

摘要

在开花植物中，胚胎发育于一种营养组织——胚乳内，并被母体的种皮（或称种被）所包裹。因此，由于早期阶段（从单细胞到球形胚阶段）的植物胚胎相对难以触及，其分离在技术上具有较大挑战性。早期胚胎体积微小，使得人工解剖操作的效率受到显著限制 拟南芥 种子及其胚与周围组织的黏附性。在此，我们描述了一种可高效分离幼嫩 拟南芥 胚胎，根据下游应用的不同，可在1至4小时内获得多达40个胚胎。将250至750粒种子置于Eppendorf管中，用塑料研杵轻轻碾压，使胚胎释放至分离缓冲液中。在倒置光学显微镜下，将液滴置于多孔载玻片上，使用连接标准实验室移液器（通过橡胶管）或液压控制显微注射仪的玻璃微毛细管吸取胚胎。该操作所需的技术技能简单且易于掌握，基本实验装置无需昂贵设备。所获得的胚胎适用于多种下游应用，如RT-PCR、RNA测序、DNA甲基化分析、荧光检测 原位 荧光原位杂交（FISH）、免疫染色和报告基因检测。

引言

开花植物的胚胎被胚乳所包围，胚乳是一种由第二次受精事件产生的营养组织。胚胎和胚乳均被种皮的数层细胞包裹。这些组织共同构成种子，种子在果实内发育。因此，对组织和细胞特异性的分析 拟南芥 由于难以接近，胚胎的获取受到严重限制。然而，晚球形期或更晚期的胚胎在体视显微镜下使用精细的钨针进行人工解剖，或通过镊子对种子施加轻微压力以取出胚胎，相对较为可行。这些技术已成功应用于转录组或表观基因组分析，如微阵列杂交、亚硫酸氢盐测序或RNA测序（例如 1-3）。相比之下，对从合子期到早期球形胚阶段的胚胎进行研究在技术上仍然具有挑战性。迄今为止，仅有少数研究通过激光显微切割技术（LCM）对固定种子切片中的胚胎组织进行分离，进而开展了幼嫩胚胎的转录组分析 4 或使用精细工具从种子内手动分离单个胚胎 5然而，激光显微切割（LCM）设备并不普及，且在早期阶段手动提取胚胎耗时较长，需要极佳的解剖技术，而这种技术难以推广和传授。除了全基因组分析外， 原位 基因表达分析在幼嫩的全胚样本上也难以进行 拟南芥在一定程度上，可通过轻轻按压种子将早期胚胎释放到显微镜载玻片上，并用于报告基因检测或通过免疫染色进行蛋白质检测（例如参见 6,7然而，该技术无法实现高通量胚胎分离，从而限制了定量分析的开展。

因此，我们开发了一种高效且快速的早期胚胎分离方案，用于从Arabidopsis种子中分离胚胎。该方法操作简便、易于转移，适用于多种下游应用。其基本原理是在Eppendorf管中使用塑料研磨棒，在适当的分离缓冲液中轻轻碾碎从幼嫩角果中解剖得到的种子。将种子提取物以液滴形式置于多孔载玻片上，利用倒置显微镜筛选处于目标发育阶段的游离胚胎。通过连接微注射仪或标准实验室移液器的玻璃毛细管收集胚胎。对于分子生物学应用，胚胎需在少量新鲜分离缓冲液的液滴中反复释放两次以完成洗涤，再转移至目的缓冲液中。对于细胞学应用（报告基因检测、免疫染色、FISH），可省略洗涤步骤。

该方法具有多项优势：（i）用于细胞学应用时，约45分钟内可获得25–40个胚胎，用于分子生物学应用（包括洗涤步骤）时，耗时3–4小时；（ii）可分离特定的胚胎发育阶段；（iii）由于操作简便，易于在不同人员和实验室之间转移应用；（iv）基础设备配置成本较低，且可灵活升级；（v）已成功应用于多种后续实验，包括RNA测序8、基因特异性DNA甲基化分析9、报告基因检测（10以及Raissig et al.，正在准备中）和FISH（J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux 未发表，见图5）。

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方案

该流程在图1所示的流程图中进行了总结。图2和图3展示了微毛细管和仪器装置，图4展示了胚胎分离的典型步骤。

1. 材料与缓冲液准备

1.1 玻璃微毛细管的硅涂层处理

  1. 将微毛细管放入一个15 ml的Falcon管中，加入约5 ml Sigmacote（Sigma），反复倒置数次。
  2. 去除溶液，将装有毛细管的Falcon管用铝箔包裹，于60 °C烘烤3小时。在室温下保存。

1.2 获取直径约 50–100 μm 的微毛细管尖端

  1. 使用本生灯手动或利用商用拉针仪（垂直丝拉针仪或微玻璃管拉针仪）将直径为1 mm的玻璃毛细管拉制成型。
  2. 使用金刚石笔尖或刀片切割拉制好的毛细管尖端，以获得所需的开口尺寸。在体视显微镜下挑选形态最佳的毛细管。开口直径应为50–100 μm（图2）。

1.3 载玻片制备

  1. 用 Sigmacote（约 1 ml/载片）覆盖所有孔，对洁净载片进行硅化处理，持续 5 分钟后去除。用铝箔包裹，于 3 小时内烘烤。室温保存。
  2. 将多孔玻璃显微载片在 10% SDS 中洗涤 10 分钟，再依次在无核酸酶水中（高压灭菌的 DEPC-ddH2O）洗涤 2 次，每次 2 分钟，70% 乙醇中 2 分钟，100% 乙醇中 2 分钟，然后空气干燥。所有步骤均在高压灭菌的 Coplin 染色缸中进行。只要每次使用后彻底清洁，载片可多次重复使用。
  3. 在胚胎分离前，用移液器将约 0.5 μl 的 10 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）溶液均匀涂布于每个孔的整个表面，然后空气干燥。

1.4 显微镜与毛细管装置

  1. 使用带有10倍和20倍物镜的倒置显微镜。优化光照对比度（胚胎较为透明）。
  2. 将显微操作仪放置在显微镜旁，用于固定玻璃毛细管。玻璃毛细管通过橡胶管连接至显微注射仪（图3A）或普通P-200移液器（图3B，详见讨论部分对该装置的详细描述）。
  3. 将毛细管以约70°角置于载玻片上方（图3），并调整位置，使毛细管开口处于视野范围内。
  4. 在胚胎分离前，吸取并释放约5–10 μl BSA（1 mg/ml）以润洗毛细管。

1.5 缓冲液

表1列出了根据下游应用选择的分离缓冲液和目的缓冲液。

  1. 每次使用前新鲜配制每份样品约 1 ml 的分离缓冲液，并将其置于冰上保存。
  2. 将目的缓冲液置于冰上的 0.5 ml Eppendorf 低吸附离心管中（用于分子学应用）或置于湿盒内的显微镜载玻片上（用于细胞学应用）。

2. 种子解剖与胚提取

2.1 种子发育的同步化

  1. 去雄花朵，并在生长室中保留2天，避免暴露的雌蕊与其他花朵接触，然后进行授粉（例如 11）。
  2. 在您的生长条件下，通过透明化种子的显微观察来检测其发育阶段。在我们的生长条件下（16小时光照，21 °C；8小时黑暗，18 °C，70%湿度），授粉后2.5天（DAP）采集的种子主要含有2-4细胞的胚胎，而授粉后3.5–4 DAP采集的种子则产生球形胚胎。

2.2 种子解剖与破除

  1. 在体视显微镜下，使用镊子和胰岛素针从10-15个角果（约2.5天授粉后）中去除种子。
  2. 将种子浸入置于冰上的2 ml圆底Eppendorf管中的20 μl裂解缓冲液中。
  3. 用塑料研杵（预先用10% SDS清洗，DEPC-ddH2O冲洗，并用70%乙醇洗涤）轻轻研磨种子，释放胚胎，直至种子提取物变浑浊。施加的力度需由每位操作者在实践中自行确定。
  4. 用300 μl裂解缓冲液冲洗研杵，以清洗研杵并稀释样品。
  5. 在5,000 x g离心5秒，使提取物沉淀。通过移液器轻柔地上下吹打2-3次，重新悬浮沉淀物。
  6. 使用30 μm尼龙滤网（安装在管适配器上，e.g. PartecCelltricks产品）过滤提取物。再用额外的200 μl裂解缓冲液冲洗滤网。

3. 胚胎分离

3.1 载玻片制备

  1. 将洁净的、经BSA包被和硅化处理的多孔载玻片置于倒置显微镜载物台上，轻轻吹吸混匀过滤后的种子提取液，随后吸取40–50 μl种子提取液1至2滴，加入1至2个孔中。每次仅检测1至2滴可防止样品蒸发。
  2. 加入50 μl新鲜的分离缓冲液（1st 在另一块预先准备好的载玻片的孔中加入洗涤液滴。将此载玻片置于加盖的湿盒中，以防止蒸发。

3.2 筛选、清洗、收集

  1. 使用10倍物镜筛选种子提取液中的胚胎，确定其处于目标发育阶段。如有必要，可使用20倍物镜进一步确认发育阶段。胚胎通常会沉降至载玻片底部。
  2. 使用钨针、胰岛素针或类似工具手动清除胚胎周围的碎屑。
  3. 使用显微操作器将玻璃毛细管移至胚胎附近，尽可能少地吸取溶液以拾取胚胎。
  4. 收集多个胚胎（例如 全部一个液滴）并在1中释放它们st 洗涤液滴（分子学应用）或目的缓冲液（细胞学应用）。每次收集过程应控制在5-10分钟内，且胚胎应收集于最小体积中（所有收集轮次的总体积应为 <5 μl
  5. 重复筛选和收集过程，直至在1中收集到所需数量的胚胎st 洗涤液滴（尽可能置于中央，以方便回收）。
  6. 一次性从清洗液滴中回收所有胚胎（若携带杂质，需先用针去除，再进行回收）。
  7. 将胚胎释放到一个2nd 用50 μl洗涤液洗涤。重复步骤3.2.6。
  8. 将胚胎释放到目标缓冲液中。转移时仅需毛细管尖端与缓冲液接触，不得将其浸入。
  9. 更换下一个样本的微毛细管。

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结果

我们的胚胎分离流程（图1）若进行洗涤操作，可在4小时内分离出多达40个胚胎， 例如 用于分子实验应用，或在省略洗涤步骤的情况下不到一小时内完成 例如 用于细胞学应用。 图2 展示高质量与低质量的玻璃微毛细管尖端 图3 展示了胚胎分离装置的设置。 图4 在倒置显微镜下展示胚胎分离的过程。

我们已成功将该方法应用于近期发表的多项研究中。该方法最初是为了分析双亲对早期胚胎转录组的贡献而开发的。通过两个不同亲本之间的杂交所获得的杂合胚胎 拟南芥 品系（Landsberg）erecta （Ler）和哥伦比亚（Col-0））在2-4细胞阶段被分离。提取总RNA，通过线性扩增构建cDNA文库，并在SOLiD平台上进行测序。基于SNP分析生成等位基因特异性转录组 8为在测序前对胚胎cDNA文库进行质控，我们扩增了胚胎特异性转录本， WUSCHEL...

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讨论

我们开发了一种胚胎分离方案，该方案快速、高效，且易于在其他实验室间转移应用。

此处所述设备包括倒置显微镜、显微操作仪、玻璃微毛细管、垂直丝状拉制仪和显微注射仪（图3A）。该装置与先前用于转录组学分析中单个动物细胞分离的装置类似17。我们还成功使用了一种更基础的装置，其中玻璃微毛细管通过火焰手工拉伸（并用金刚石刀片切割），并通过标准实验室移液器（Pipetman P-200）代替显微注射仪进行操作（图3B）。在此情况下，微毛细管通过橡胶管连接至移液器。使用10 μl滤芯吸头制作连接部位，并用Parafilm膜包裹以确保密封性。毛细管由移液器吸头夹持，并利用聚苯乙烯块和胶带固定在显微操作仪的机械臂上（图3B）。这种基础装置已被证明高效且可靠8。然而，主要难点之一在于维持微毛细管与移液器之间连接的气密性，尤其是在更换毛细管时。使用该基础装置时，验证和调节毛细管内的压力——以确保在最小体积下精确收集胚胎——可能较为耗时。采用液压控制的显微操作仪和...

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披露

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

致谢

我们感谢Tal Nawy和Martin Bayer在胚胎分离方面的建议。MTR、VG、UG和CB设计了胚胎分离装置。MTR、VG和CB开发了胚胎分离方案。MTR、VG和CB建立了该方案，完成了胚胎分离并制备了胚胎cDNA，VG进行了PCR实验，MTR进行了GUS染色，JJ完成了FISH实验。MTR、VG、CG和UG撰写了论文。本研究由苏黎世大学、罗氏研究基金会博士后奖学金（资助MTR）以及瑞士国家科学基金会资助项目（资助UG和CB）提供经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
SigmacoteSIGMASL2-100 ml
RNAse OUTInvitrogen (life technologies)10777-019
第一链缓冲液（First-strand buffer）Invitrogen (life technologies)18064-022包含于 Superscript II 试剂盒中
DTTInvitrogen (life technologies)18064-022包含于 Superscript II 试剂盒中
牛血清白蛋白（BSA）100倍稀释液 = 10 mg/mlNew England Biolabs Inc.不同供应商的产品也可使用
薄壁毛细管 1.0 mmWorld Precision InstrumentsTW100F-4
DNA LoBind 管 0.5 mlVaudaux-Eppendorf0030108.035
CellTricsΔ 30 μmPARTEC04-0042-2316
5孔载玻片，直径10 mmElectron Microscopy Sciences63421-10
甲醛溶液（Formaldehyde Solution）Sigma-AldrichF1635
Superfrost Plus 载玻片Thermo FisherJ1800AMNZMenzel-Gläser
TrisAmaresco0497
EDTAApplichemA2937
甘氨酸（Glycin）Fluka50050
SDS 球状颗粒（SDS pellets）RothCN30.3
微型研磨杵（Micro Pestle）VWR431-0094
微量胰岛素注射器（Microfine insulin syringes）BDU-100
DEPCSigma-AldrichD5758
乙醇（Ethanol）SchaurlauET00102500
镊子 N5Dumont0108-5
Bioanalyzer Pico 芯片Agilent Technologies5067-1513
设备
倒置显微镜Nikon TMS (日本)
显微操作器LeitzLeica
显微操作器支架 LH1 探针Leica microsystems39430101其他品牌亦可使用
垂直玻璃丝拉制仪Sutter instrumentP-20 型号其他型号也可适用
Cell Tram varioVaudaux-Eppendorf5176.000.033
BioanalyzerAgilent Technologies2100
Qubit 荧光计Invitrogen (life technologies)

参考文献

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