高效快速分离早期胚胎 拟南芥 种子

摘要

我们报道一种高效且简便的方法，用于分离发育早期阶段的胚胎 拟南芥 种子。根据下游应用的不同，可在1至4小时内分离出多达40个胚胎。该方法适用于转录组、DNA甲基化、报告基因表达、免疫染色和荧光检测。 原位 杂交分析

摘要

在开花植物中，胚胎发育于一种营养组织——胚乳内，并被母体的种皮（或称种被）所包裹。因此，由于早期阶段（从单细胞到球形胚阶段）的植物胚胎相对难以触及，其分离在技术上具有较大挑战性。早期胚胎体积微小，使得人工解剖操作的效率受到显著限制 拟南芥 种子及其胚与周围组织的黏附性。在此，我们描述了一种可高效分离幼嫩 拟南芥 胚胎，根据下游应用的不同，可在1至4小时内获得多达40个胚胎。将250至750粒种子置于Eppendorf管中，用塑料研杵轻轻碾压，使胚胎释放至分离缓冲液中。在倒置光学显微镜下，将液滴置于多孔载玻片上，使用连接标准实验室移液器（通过橡胶管）或液压控制显微注射仪的玻璃微毛细管吸取胚胎。该操作所需的技术技能简单且易于掌握，基本实验装置无需昂贵设备。所获得的胚胎适用于多种下游应用，如RT-PCR、RNA测序、DNA甲基化分析、荧光检测 原位 荧光原位杂交（FISH）、免疫染色和报告基因检测。

引言

开花植物的胚胎被胚乳所包围，胚乳是一种由第二次受精事件产生的营养组织。胚胎和胚乳均被种皮的数层细胞包裹。这些组织共同构成种子，种子在果实内发育。因此，对组织和细胞特异性的分析 拟南芥 由于难以接近，胚胎的获取受到严重限制。然而，晚球形期或更晚期的胚胎在体视显微镜下使用精细的钨针进行人工解剖，或通过镊子对种子施加轻微压力以取出胚胎，相对较为可行。这些技术已成功应用于转录组或表观基因组分析，如微阵列杂交、亚硫酸氢盐测序或RNA测序（例如 ^1-3）。相比之下，对从合子期到早期球形胚阶段的胚胎进行研究在技术上仍然具有挑战性。迄今为止，仅有少数研究通过激光显微切割技术（LCM）对固定种子切片中的胚胎组织进行分离，进而开展了幼嫩胚胎的转录组分析 ⁴ 或使用精细工具从种子内手动分离单个胚胎 ⁵然而，激光显微切割（LCM）设备并不普及，且在早期阶段手动提取胚胎耗时较长，需要极佳的解剖技术，而这种技术难以推广和传授。除了全基因组分析外， 原位 基因表达分析在幼嫩的全胚样本上也难以进行 拟南芥在一定程度上，可通过轻轻按压种子将早期胚胎释放到显微镜载玻片上，并用于报告基因检测或通过免疫染色进行蛋白质检测（例如参见 ^6,7然而，该技术无法实现高通量胚胎分离，从而限制了定量分析的开展。

因此，我们开发了一种高效且快速的早期胚胎分离方案，用于从<....

方案

该流程在图1所示的流程图中进行了总结。图2和图3展示了微毛细管和仪器装置，图4展示了胚胎分离的典型步骤。

1. 材料与缓冲液准备

1.1 玻璃微毛细管的硅涂层处理

1. 将微毛细管放入一个15 ml的Falcon管中，加入约5 ml Sigmacote（Sigma），反复倒置数次。
2. 去除溶液，将装有毛细管的Falcon管用铝箔包裹，于60 °C烘烤3小时。在室温下保存。

1.2 获取直径约 50–100 μm 的微毛细管尖端

1. 使用本生灯手动或利用商用拉针仪（垂直丝拉针仪或微玻璃管拉针仪）将直径为1 mm的玻璃毛细管拉制成型。
2. 使用金刚石笔尖或刀片切割拉制好的毛细管尖端，以获得所需的开口尺寸。在体视显微镜下挑选形态最佳的毛细管。开口直径应为50–100 μm（图2）。

1.3 载玻片制备

1. 用 Sigmacote（约 1 ml/载片）覆盖所有孔，对洁净载片进行硅化处理，持续 5 分钟后去除。用铝箔包裹，于 3 小时内烘烤。室温....

结果

我们的胚胎分离流程（图1）若进行洗涤操作，可在4小时内分离出多达40个胚胎， 例如 用于分子实验应用，或在省略洗涤步骤的情况下不到一小时内完成 例如 用于细胞学应用。 图2 展示高质量与低质量的玻璃微毛细管尖端 图3 展示了胚胎分离装置的设置。 图4 在倒置显微镜下展示胚胎分离的过程。

我们已成功将该方法应用于近期发表的多项研究中。该方法最初是为了分析双亲对早期胚胎转录组的贡献而开发的。通过两个不同亲本之间的杂交所获得的杂合胚胎 拟南芥 品系（Landsberg）erecta （Ler）和哥伦比亚（Col-0））在2-4细胞阶段被分离。提取总RNA，通过线性扩增构建cDNA文库，并在SOLiD平台上进行测序。基于SNP分析生成等位基因特异性转录组 ⁸为在测序前对胚胎cDNA文库进行质控，我们扩增了胚胎特异性转录本， WUSCHEL.......

讨论

我们开发了一种胚胎分离方案，该方案快速、高效，且易于在其他实验室间转移应用。

此处所述设备包括倒置显微镜、显微操作仪、玻璃微毛细管、垂直丝状拉制仪和显微注射仪（图3A）。该装置与先前用于转录组学分析中单个动物细胞分离的装置类似¹⁷。我们还成功使用了一种更基础的装置，其中玻璃微毛细管通过火焰手工拉伸（并用金刚石刀片切割），并通过标准实验室移液器（Pipetman P-200）代替显微注射仪进行操作（图3B）。在此情况下，微毛细管通过橡胶管连接至移液器。使用10 μl滤芯吸头制作连接部位，并用Parafilm膜包裹以确保密封性。毛细管由移液器吸头夹持，并利用聚苯乙烯块和胶带固定在显微操作仪的机械臂上（图3B）。这种基础装置已被证明高效且可靠⁸。然而，主要难点之一在于维持微毛细管与移液器之间连接的气密性，尤其是在更换毛细管时。使用该基础装置时，验证和调节毛细管内的压力——以确保在最小体积下精确收集胚胎——可能较为耗时。采用液压控制的显微操作仪和.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
Sigmacote	SIGMA	SL2-100 ml
RNAse OUT	Invitrogen (life technologies)	10777-019
第一链缓冲液（First-strand buffer）	Invitrogen (life technologies)	18064-022	包含于 Superscript II 试剂盒中
DTT	Invitrogen (life technologies)	18064-022	包含于 Superscript II 试剂盒中
牛血清白蛋白（BSA）100倍稀释液 = 10 mg/ml	New England Biolabs Inc.		不同供应商的产品也可使用
薄壁毛细管 1.0 mm	World Precision Instruments	TW100F-4
DNA LoBind 管 0.5 ml	Vaudaux-Eppendorf	0030108.035
CellTricsΔ 30 μm	PARTEC	04-0042-2316
5孔载玻片，直径10 mm	Electron Microscopy Sciences	63421-10
甲醛溶液（Formaldehyde Solution）	Sigma-Aldrich	F1635
Superfrost Plus 载玻片	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Gläser
Tris	Amaresco	0497
EDTA	Applichem	A2937
甘氨酸（Glycin）	Fluka	50050
SDS 球状颗粒（SDS pellets）	Roth	CN30.3
微型研磨杵（Micro Pestle）	VWR	431-0094
微量胰岛素注射器（Microfine insulin syringes）	BD	U-100
DEPC	Sigma-Aldrich	D5758
乙醇（Ethanol）	Schaurlau	ET00102500
镊子 N5	Dumont	0108-5
Bioanalyzer Pico 芯片	Agilent Technologies	5067-1513
设备
倒置显微镜	Nikon TMS (日本)
显微操作器	Leitz		Leica
显微操作器支架 LH1 探针	Leica microsystems	39430101	其他品牌亦可使用
垂直玻璃丝拉制仪	Sutter instrument	P-20 型号	其他型号也可适用
Cell Tram vario	Vaudaux-Eppendorf	5176.000.033
Bioanalyzer	Agilent Technologies	2100
Qubit 荧光计	Invitrogen (life technologies)