分离具有降解农业用可生物降解塑料地膜潜力的天然土壤微生物

摘要

市面上有标称为“可生物降解”的塑料薄膜，可用于农业覆盖地膜。耕作是一种具有吸引力的处置方式，但此类薄膜在田间条件下的降解过程尚不明确。本研究的目的是建立从田间掩埋后的塑料地膜上分离定殖的本土土壤真菌和细菌的方法。

摘要

从农业土壤中分离出能够定殖市售可生物降解地膜（BDM）薄膜的本土真菌，并评估其降解塑料的潜力。通常情况下，当塑料的配方已知且原料来源可获得时，可将粉末状塑料悬浮于基于琼脂的培养基中，通过观察透明圈的形成来判断降解情况。然而，该方法难以真实模拟BDM在原位（in situ）条件下的降解过程。首先，BDM在土壤基质中并非以微小颗粒形式分散存在；其次，市售BDM并非纯聚合物，而是含有添加剂（例如 填料、增塑剂和染料）的薄膜，这些成分可能影响微生物的生长。本文所述方法用于从埋入土壤后的地膜薄膜中获得的微生物分离物。从挖出的BDM上获得的真菌分离物被单独测试，将其接种于新的、经消毒的BDM碎片上，这些碎片置于仅以琼脂为碳源的限定培养基表面，观察其生长情况。能够在BDM上生长的分离物进一步在液体培养基中进行测试，其中BDM为唯一添加的碳源。经过约十周后，通过扫描电子显微镜评估真菌的定殖情况及BDM的降解程度。分离物通过核糖体RNA基因序列分析进行鉴定。本报告描述了真菌分离的方法，但通过更换适用于细菌的培养基，同样可用于细菌的分离。本研究方法将有助于针对完整塑料薄膜或产品降解的研究，尤其适用于塑料原料未知或无法获得的情况。然而，本方法不能提供一种定量比较BDM降解速率的手段。

引言

传统上，降解一直被视为塑料聚合物的不良特性，因为其会缩短产品的使用寿命和耐久性。近年来，人们逐渐意识到塑料废弃物在自然环境中所造成的环境问题^1,2,3，这使得可生物降解塑料成为传统塑料材料的一种有吸引力的替代选择。降解（定义为结构变化、碎裂以及分子量、完整性和强度的降低^4,5）通过一系列事件发生，包括非生物过程（热应力、光氧化、水解、侵蚀和机械应力）以及生物降解过程⁶。虽然非生物过程可以改变塑料碎片的尺寸和特性，但其最终矿化为水和二氧化碳（在有氧条件下）和/或甲烷（在无氧条件下）则需要微生物的参与。

在农业领域，可生物降解塑料具有广阔的应用前景，其中塑料地膜被广泛用于抑制杂草生长、保持土壤水分以及提高土壤温度^7,8。仅在美国，就有数十万英亩的土地使用了塑料地膜⁹，其中包括由可生物降解塑料制成的地膜。在作物生长季结束后，可生物降解地膜（BDMs）的处理方式包括填埋处置、焚烧回收能源¹⁰、通过堆肥降解，或在耕作后于土壤中降解¹¹。在这些处理方式中，将BDMs翻耕入土是最省劳力的方法；然而，若在非种植季节（通常为冬季）无法实现高效降解和矿化，残留的塑料碎片可能在春季耕作和播种时干扰农业机械的正常作业，并在环境中长期存留，对野生动物、植物及微生物群落造成显著影响^1,2,3,10。

尽管许多塑料制品（包括农用覆盖膜）标有“可生物降解”或“可堆肥”的标签，但在实际应用中，其降解和矿化过程可能效率过低和/或不完全，导致在土壤中分解无法成为这些产品处置的可行替代方案。例如，氧化生物降解聚乙烯在经历一年户外老化后，再在58 °C的堆肥环境中放置三个月，仅实现了12.4%的矿化；当堆肥温度为25 °C时，矿化程度甚至不到前者的一半¹²。在冬季，大多数地区的土壤温度将低于上述两种温度，微生物活性可能进一步降低，从而导致矿化程度更低。除了降解速率缓慢外，“可生物降解”一词的误用也导致消费者（包括农业行业从业者）对这类产品产生不信任^13,14。生物降解是指天然存在的微生物⁴将聚合物转化为二氧化碳（和/或甲烷）和水的过程¹⁴。因此，生物降解必须通过化学方法进行测定；微生物与基质的物理结合并不意味着该材料发生了微生物降解。

作为研究农业中生物降解地膜（BDM）可持续利用的一部分，本研究重点在于发现定殖于农业土壤并能够降解市售BDM的本土微生物。已有标准测试方法用于通过非生物和生物手段化学测定可生物降解塑料的分解过程^15,16,17。然而，这些方法并未涉及单一微生物物种对塑料的降解作用，也未提供相应的微生物分离方法。本文所述方法更接近于标准方法中在将真菌孢子接种至样品后评估塑料抗微生物分解能力的实验设计^18,19。

当塑料的配方已知且可获得原料来源时，可将塑料粉末悬浮于基于琼脂的培养基中，通过观察透明圈的形成来确定其降解情况¹³该方法此前已被用于鉴定可降解聚氨酯等聚合物的微生物²⁰，聚（丁二酸丁二醇酯-co-己二酸²¹和聚乳酸（poly(lactic acid)）²²一种类似的方法是将纯的塑料粉末悬浮于液体培养基中，其中塑料是唯一的碳源。^20,23尽管这些方法具有体系明确的优势，但其对实际情况的模拟效果较差 原位 BDMs的降解过程存在以下差异：首先，BDMs并非以细小颗粒形式分散于土壤基质中，而是以薄膜形式销售和使用，因此其表面积分布方式不同。其次，BDMs的化学组成不同于纯聚合物，通常含有填料、增塑剂和着色剂等添加剂，这些添加剂可能影响微生物的生长，从而影响矿化速率。因此，且由于本研究中某些商用薄膜的具体成分属于商业机密，实验中直接采用可投入田间使用的塑料薄膜成品进行真菌和细菌的分离。为简洁起见，下文仅以真菌分离方法为主进行描述，并在适当时注明细菌分离所需的相应修改。

在最近的一项研究中²⁴，三种市售的生物可降解地膜（BDM）和一种实验性薄膜在美国三个不同地区的农业试验点使用了一个生长季，随后被放入网袋（250 微米孔径）中，并在同一地点的土壤中掩埋过冬。250 微米的网孔允许真菌菌丝穿透，同时排除植物根系和大多数土壤动物，并尽量减少土壤侵入^25,26。尼龙材料可防止网袋在土壤中降解。挖掘后，从 BDM 样品上分离出真菌菌株，并在基本培养基上进行培养评估，培养基中除琼脂外不提供其他碳源，仅添加一块经表面消毒的、5 cm × 5 cm 的全新未使用 BDM 薄膜（预先消毒）。大多数用作薄膜的塑料在不破坏完整性的前提下无法进行高压灭菌，因此采用紫外线照射以杀灭塑料表面存在的微生物细胞。ISO 846¹⁹ 建议使用 70% 乙醇进行表面消毒并随后干燥，但若采用此方法，必须确保薄膜的任何组分或添加剂不会受到乙醇的不利影响。由于 BDMs 预期设计为可耐受阳光照射，因此选择紫外线作为去污方法。

选择在BDM碎片上生长优于仅含最低培养基的样品进行进一步研究。琼脂是一种由海洋藻类产生的多糖，常用于固化微生物培养基，因为它通常不会被农业和医学上重要的微生物作为代谢底物利用；然而，已有研究从海洋细菌中分离出能够水解琼脂的酶²⁷，也从土壤中分离出具有琼脂降解能力的细菌²⁸。BDM聚合物和琼脂预计都是土壤真菌分泌酶类的稀有底物，因为这些真菌并未进化于含有此类聚合物作为潜在营养来源的环境中，但本研究所述的平板生物测定法中同时存在这两种底物（步骤 7）。通过比较真菌在琼脂固化培养基上的生长情况——其中（i）未添加除琼脂外的碳源（阴性对照），（ii）含BDM薄膜（实验组）和（iii）含葡萄糖（阳性对照）——可区分以BDM为碳源而不利用琼脂的真菌与仅利用琼脂的真菌。所有分离株均预期能在添加葡萄糖的最低培养基上生长；若某些真菌无法在含葡萄糖的平板上生长，可能表明其不能在本实验所用的特定最低培养基上生长。潜在的BDM降解菌应在琼脂固化最低培养基+BDM薄膜上的生长优于仅含琼脂固化最低培养基的对照组。能在最低培养基平板上生长的真菌属于琼脂降解菌或寡营养菌，它们也预期能在生物测定平板中与BDM薄膜相关的琼脂上生长，但不能在薄膜本身上生长（除非偶然同时具备降解BDM聚合物的能力）。

为了排除因利用琼脂而非BDMs导致微生物生长的可能性，我们在琼脂平板上进行BDM定植的初步实验后，接着在确定成分的液体培养基中开展了生物降解实验（步骤 9）。在生物降解实验管中，BDM碎片是唯一的已知碳源。

经过初步筛选，并在复苏分离株的甘油保存菌种后，部分菌株在不含任何已知碳源的液体限定培养基中形成了少量但可见的菌丝。这些结果表明，部分获得的分离株为寡营养微生物——即能够通过利用水环境中溶解的或空气中以挥发性形式存在的微量碳、氮及其他营养物质进行生长的生物体^29,30,31通过18S核糖体DNA分析进行物种鉴定支持了这一观点，因为许多分离株与先前报道具有寡营养特性的真菌属相匹配³²寡营养型生物通常为腐生生物，需要具备广泛的代谢能力，以在多种环境中利用不同的底物³⁰因此，我们从生物可降解材料（BDMs）上分离到的真菌（可能具有特殊的酶解能力）表现出寡营养生长能力，能够在微量污染物上生长，例如指纹中的皮肤油脂、灰尘或空气中的痕量挥发物，这一点并不令人意外。由于分离到了寡营养微生物，我们得出结论：仅凭微生物在BDM表面生长这一现象，不足以推断BDM发生了降解。本文所述方法反映了我们从农业土壤中筛选土著BDM定殖微生物的努力 真正有效的 BDM 分解。

方案

该实验程序需要至少数月时间在土壤中孵育BDM薄膜，并需要额外数月时间在琼脂平板以及无琼脂、化学成分明确的液体培养基中依次进行生物测定，以评估定殖和降解情况。各步骤方法按操作顺序列出。

1. BDM 薄膜在土壤中的孵育

在模拟生物降解地膜（BDM）实际降解条件的环境中，将其掺入土壤中。取400 g（干重当量）的原位土壤，将一块10 cm × 10 cm的BDM夹在土壤中，装入13 cm × 13 cm的尼龙网袋（孔径250微米）内，用尼龙线封口。培养时间由实验人员自行决定。监测和/或调节与微生物活性相关的参数例如 在培养期间，根据需要定期测量土壤温度、养分和水分等指标。

2. 培养基与试剂的制备

为避免将营养物质意外引入培养基和培养管中，应使用试剂级化学药品、新购买的培养管、I型超纯水（例如 NanoPure）以及严格清洗过的玻璃器皿来配制培养基。避免试剂间的交叉污染——最好为此专门配备一套专用的试剂和玻璃器皿。需注意，有可能分离到某些真菌，其生长会受到下述所列试剂中某种成分的抑制。若发生此类情况，则可能需要进行一定的优化。

1. 在配制培养基之前，将所有必需的玻璃器皿用实验室洗涤剂清洗，然后进行酸洗（例如 在10% HCl中浸泡过夜。用蒸馏水至少冲洗十二次，再用超纯水冲洗两次。所有玻璃器皿均用洁净的铝箔覆盖，以防灰尘污染。佩戴手套，避免触碰容器内壁和边缘，以防指纹中的皮肤油脂污染。为避免肥皂残留及玻璃表面划痕（可能促进污染），真菌培养应使用新购置（未使用过）、经冲洗并高压灭菌的玻璃培养管及管盖。
2. 马铃薯葡萄糖琼脂 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）用于从土壤中真菌的初始分离，以及单菌落的建立和长期保存用接种物的制备。按照生产商说明配制培养基，高压灭菌后冷却至50 °C，加入氯霉素（以乙醇配制的10 mg/ml储备液），使其终浓度为30 μg/ml，以抑制细菌生长。此培养基现称为PDA chl。³⁰.
3. 真菌基本培养基 (FMM) 用作接种潜在真菌塑料降解菌的BDMs的固体基础培养基。除琼脂（如用于固化培养基）外，该培养基不含碳源。向约800 ml去离子H₂O，加入6.0 g NaNO₃，0.52 g KCl，0.52 g MgSO₄₄·7H₂O，1.52 g KH₂PO₄，以及1 ml 赫特纳微量元素贮存液（2.2 g ZnSO₄）₄·7H₂O，1.1 g H₃BO₃，0.5 g MnCl₂·4H₂O, 0.5 g FeSO₄₄·7H₂O，0.16 g CoCl₂·5H₂O，0.16 g CuSO₄₄·5H₂O，0.11 g (NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O 和 5.0 g Na₄ 100 ml 蒸馏水中的 EDTA₂O^33,34用 NaOH 调节 pH 至 6.5，并定容至 1 L。进行液体生物测定实验时，需对 FMM 进行过滤除菌，以避免盐类沉淀。若需制备固体培养基，加入 16 g 琼脂后进行高压灭菌。若需半固体琼脂培养基，则将琼脂量减少至 8 g/L。待培养基冷却至 50 °C 时，加入氯霉素，使其终浓度为 30 μg/ml。该培养基现称为 FMM chl。³⁰作为对照以确保真菌分离株在此培养基中正常生长，应按上述方法制备FMM，但每升含10克葡萄糖。此培养基称为葡萄糖最小培养基。³⁵ (GMM)
4. 磷酸盐缓冲液³⁶ （PBS）用于在对暴露于土壤的BDM进行初始系列稀释时悬浮土壤颗粒和微生物细胞。配制PBS时，加入8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄，以及 0.24 g KH₂PO₄ 加入800 ml蒸馏水，溶解盐类，并用HCl调节pH至7.4。用超纯水定容至1 L。将PBS分装至洁净的培养管中，每管分别加入9.5 ml和4.5 ml。高压灭菌。
5. 30% (v/v) 甘油 用于在 -80 °C 保存条件下悬浮冷冻保存的细菌和酵母细胞、孢子及真菌菌丝体。使用超纯水配制此溶液，经高压灭菌处理。
6. 0.01% (v/v) Triton X-100 用于悬浮真菌孢子；该洗涤剂可作为疏水性孢子的无毒润湿剂。将100 μl Triton X-100溶于1 L超纯水中，高压灭菌。
7. 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2） 用作扫描电镜固定过程中戊二醛的溶剂。将68.4 ml的1 M Na₂HPO₄ 和 31.6 ml 的 1 M NaH₂PO₄ 用超纯水定容至1 L³⁶.

3. 生物测定材料的制备：BDM薄膜的表面去污

1. 由于剪刀等切割工具上残留的纸张、胶带等污染物可能成为碳源，应使用新购买的剪刀或新的剃刀刀片，并在无机表面上进行切割。佩戴手套以避免皮肤油脂污染BDM膜。将BDM膜切成小方块（4.25 × 4.25 cm）。此尺寸可适配标准的100 × 15 mm培养皿。
2. 使用杀菌紫外灯（发射波长 = 253.7 nm）对BDM膜进行去污染处理。此类紫外灯通常安装在标准生物安全柜内。确保紫外灯运行时，外部空气不会流入生物安全柜，以免污染BDM膜。
3. 用70%乙醇润湿超净台内部表面，并开启风机运行15分钟以置换空气。随后关闭滑动门，用紫外灯照射超净台表面2小时以完成去污染。
4. 将BDM膜成排放置于已去污染的超净台内，用紫外灯照射2小时。
5. 使用洁净且已灭菌的镊子翻转BDM膜。从最前排开始操作，逐步向后排进行，以尽量减少手和手臂直接处于已去污染BDM膜上方的时间。翻转BDM膜时，应将刚消毒的一面朝下放置在经紫外照射过的洁净区域，且该区域此前未接触过膜的未消毒面。
6. 每面均经2小时紫外照射处理后，用无菌镊子将BDM膜从生物安全柜中取出，操作时仍从前排至后排进行，避免手和手臂跨越已去污染的膜。将BDM膜放入无菌、干燥、带盖的容器中（如铝箔覆盖的烧杯），于室温避光保存。

4. 平板生物测定设置

所有步骤均须在无菌转移罩内使用无菌技术进行。

1. 将经过紫外线消毒的BDM片材平铺在琼脂平板表面。先放下一个角，然后轻轻让其余部分自然展开并与琼脂接触，避免产生褶皱。某些薄膜在储存过程中可能已形成褶皱，此现象不可避免。特别薄的薄膜可能需要使用两把镊子辅助，以确保其平整贴合。
2. 在塑料膜表面滴加半固体FMM chl³⁰琼脂液滴，为疏水性塑料的初始定殖提供水分和营养来源。对于透水性薄膜，则无需添加琼脂液滴。将琼脂在微波炉中重新熔化后，使用微量移液器将4滴各10 μl的熔融琼脂转移至覆盖膜上（每角1滴）。操作时勿让移液器吸头直接接触覆盖膜，以免刺破。每滴体积不得超过10 μl，因为过重的液滴在平板倒置时可能导致塑料膜从琼脂表面脱离。
3. 将平板盖上皿盖，正置过夜，使琼脂完全凝固，随后将密封袋中的平板倒置（琼脂面向上），于4 °C避光保存。当准备进行生物测定（步骤7）时，使用i) 一块FMM chl³⁰平板（阴性对照），ii) 一块含有四滴各10 μl半固体FMM chl³⁰琼脂的生物测定平板（带塑料膜），以及iii) 一块GMM平板（阳性对照）。通过此方式，每块培养基平板可同时检测每个菌株的四个重复。

5. 液体生物测定实验设置

1. 按照步骤3.1中的说明进行BDM切割。在为液体生物测定切割塑料薄膜之前，选择适合放入培养管的尺寸。为使多种塑料类型之间达到均匀的质量，所需面积将取决于薄膜的厚度。我们发现，相当于0.0175 g的样品可很好地适配15 x 150 mm的培养管。
2. 如上文步骤3所述，使用紫外光对薄膜进行表面去污染处理。
3. 针对每个微生物分离株的每个重复，准备三支用于接种的试管：i) 含有预定尺寸BDM碎片的5 ml FMM（实验组），ii) 不含碳源的5 ml FMM（阴性对照），以及iii) 5 ml GMM（阳性对照）。此外，还需准备含有待测每种BDM的FMM重复试管，但不进行接种。这些对照试管将揭示由污染引起的任何微生物生长情况。

6. 真菌的分离

在土壤培养和取样后，从附着在BDM薄膜上的土壤中分离真菌。如有需要，可使用适合分离土壤细菌的培养基，采用相同方法同时分离细菌，例如添加50 μg/ml放线菌酮以抑制真菌生长的1/10X稀释胰蛋白胨大豆酵母琼脂培养基³⁷。在步骤5和步骤7中若需使用定义培养基进行细菌分离，M9³⁸（添加放线菌酮）是合适的选择。

1. 样品处理前，配制 PBS 和 PDA chl³⁰. 让PDA chl继续培养³⁰ 将平板在室温下敞开放置约24小时，以干燥并消除盖子和琼脂表面的冷凝水。预先标记PDA chl³⁰ 平板
2. 从选定的掩埋地点挖掘出含有BDM样品的网袋 步骤 1从土壤中提取后，在4 °C下运输和保存，时间不超过48小时。
3. 使用无菌刮铲和镊子，轻轻去除土壤直至塑料暴露，但不要刷去附着在BDM膜表面的土壤。将BDM膜切成1 cm² 将样品分割，直至获得四组重复样品，每组0.5 g。将0.5 g生物降解地膜（BDM）薄膜及其附着的土壤转移至含有9.5 ml PBS的25 ml培养管中。若地膜已完全降解，或处理的是仅含土壤的对照样品，则向PBS中加入0.5 g土壤；若可能，应选择仍带有残留地膜导致变色的土壤颗粒。
4. 将含有9.5 ml PBS和0.5 g覆盖物的培养管在高速下涡旋振荡30秒，随后在超声水浴中超声处理10分钟，再涡旋振荡30秒。该振荡过程旨在破坏生物膜，将嵌入或附着在覆盖物颗粒上的细胞物理性剥离，并形成均匀的悬浮液。
5. 准备对PBS/土壤溶液进行连续稀释，以便通过涂布获得单个菌落形成单位。每个样品在超净工作台中放置一支含有4.5 ml无菌PBS的培养管。每个样品向深孔96孔板的三个孔中各加入450 μl PBS。
6. 原始塑料/土壤悬液（0.5 g 覆盖物加 9.5 ml PBS 溶液）代表 5.0 x 10^-2 稀释附着在塑料表面的微生物材料。从原始试管中取0.5 ml悬液加入含有4.5 ml无菌PBS的培养管中，以获得5.0 × 10^-3 稀释。高速涡旋振荡30秒。取50 μl加入96孔板中含450 μl PBS的孔内。对所有样品/重复孔重复此操作。使用多通道移液器进行样品稀释。 大规模用移液器将每种新的稀释液上下吹打10次混匀。每次稀释之间更换吸头。稀释至5.0 × 10^-6.
7. （可选） 细菌分离物在本文所述样品中比真菌分离物更丰富；因此，若需同时分离细菌，则进行梯度稀释至5 x 10^-8 在 步骤 6.6 以上。
8. 将每个 5.0 x 10⁶ 细胞悬液中的 100 μl 均匀涂布于平板上^-3 通过 5.0 × 10^-6 在含氯霉素的PDA琼脂表面进行稀释³⁰ 使用经火焰灭菌的弯头玻璃棒涂布平板。将平板直立放置30分钟，使液体充分吸收，然后用Parafilm封口，以防止未知分离株的孢子逸出。将平板倒置，于20 °C黑暗条件下培养5天，以使生长较快和较慢的真菌均能形成菌落。

7. 塑料降解真菌的初步筛选

重要提示：从此时起，所有培养物仅可在生物安全柜中打开（不可在层流罩中操作），以避免未知身份的孢子污染环境。某些土壤真菌和细菌可能为人畜共患的病原体。

1. 检查稀释平板，选择分离良好的单个菌落。选取一个不与其他菌落接触的菌落。
2. 使用一根无菌牙签，轻轻接触所选菌落，然后依次接触FMM培养基（按步骤2.3制备）、FMM + 塑料膜（按步骤4制备）和GMM培养基（按步骤2.3制备）的平板表面。若需在塑料膜上的琼脂微滴表面接种，应先将牙签在琼脂点表面轻轻摩擦，再在塑料膜上划过。重复此接种过程，使用同一菌落来源，直至每个平板上形成四条重复划线。
3. 重复步骤7.1至7.2，直至从每个BDM样品中挑选出所有形态上不同的菌落类型，并获得多个重复样本。
4. 用Parafilm密封平板，倒置后于20 °C黑暗条件下培养5天。
5. 鉴定在BDM上生长优于在FMM上生长的分离菌株。若生长情况不明显，可在解剖显微镜下观察样本，确认是否存在定植（或无定植）（图1）。保持平板盖闭合；若盖子内有冷凝水，应在生物安全柜内更换新盖。
6. 一旦筛选出潜在的BDM降解菌株，使用无菌牙签从定植于塑料膜表面的真菌上刮取接种物，并在PDA chl³⁰平板上划线，以分离单个菌落形成单位。
7. 用Parafilm密封平板，并将接种了塑料降解菌株的PDA chl³⁰平板置于20 °C黑暗条件下培养5天。
8. 在获得纯化的单菌落后，需验证其是否确实能够定植于待测塑料膜。使用无菌牙签从单个菌落形成单位中获取接种物（孢子、酵母细胞或菌丝）。重复步骤7.2至7.5。在20 °C培养5天后，观察生物测定平板上的真菌生长情况。若该分离菌株在第一次（7.5）和第二次（7.8）试验中，均在BDM膜上的生长优于在FMM上的生长，则按下方步骤8所述方法保存该菌株。

8. 塑料降解菌的长期保存

总体而言，塑料降解菌株将在平板生物测定中进行测试（7.5），随后重新纯化为单个菌落形成单位（7.6），再次进行平板生物测定（7.8），最后进行液体生物测定（9.1 - 9.5）。在测试过程中，菌株应每月转移至新鲜培养基，并在可见足够生长后立即将工作储备平板储存在 4 °C。菌株还应以甘油冻存液形式保存于 -80 °C，和/或以无菌滤纸片上的干燥孢子形式保存于 4 °C。两种保存方法均在下文描述。

1. 对于在第一轮（7.5）和第二轮（7.8）平板生物测定中，于BDM薄膜上的生长情况均优于FMM培养基的每个分离菌株，准备两个PDA chl³⁰平板，每个平板表面放置两至三个直径约1 cm的无菌滤纸片。从上述步骤7.8中选定的同一单菌落接种这两个平板。通过将接种物均匀涂布于琼脂表面形成菌苔，以促进最大程度的生长。用Parafilm密封平板，在20 °C下培养5天。为提高效率，此步骤可与步骤7.8同时开始。
2. 琼脂表面的滤纸片应被菌丝体/孢子完全覆盖。使用无菌镊子将滤纸片从琼脂表面取出，并放入无菌Eppendorf管中。将Eppendorf管（管盖打开）置于生物安全柜或其他干燥、无菌且空气流动最小的环境中，使滤纸片在管内过夜风干，以避免交叉污染。随后用Parafilm密封，并在4 °C下保存。
3. 使用无菌棉签或牙签从菌苔平板上收集孢子和菌丝体。将孢子和菌丝悬浮于含30%甘油的冻存管中，液氮速冻后于-80 °C保存。

9. 通过液体生物测定严格确认塑料的利用

1. 制备新鲜孢子或细胞用于接种液体培养物：接种含氯霉素的PDA培养基³⁰ 用潜在塑料降解菌株的孢子接种平板。用帕拉菲姆膜（Parafilm）密封平板，并在20 °C下培养至真菌孢子可见。
2. 在生物安全柜中，使用 0.01% Triton X-100 溶液冲洗培养皿（每块 15 × 100 mm 的培养皿使用 5 ml 效果良好），并用无菌弯头玻璃棒轻轻刮取表面的孢子（或酵母细胞）。吸取孢子（或细胞）悬液，转移至无菌容器中。
3. 使用血细胞计数板对孢子或细胞进行计数，并确定加入5 ml FMM培养基中所需的适当体积，使终浓度为1 × 10⁶ 孢子/管。体积应小于10 μl。必要时可用0.01% Triton X-100稀释浓缩的孢子悬浮液。
4. 在无菌转移罩中，接种已准备好的培养管 步骤 5 1 × 10⁶ 孢子（或酵母细胞）。用Parafilm封严管盖，以防止孢子逸出，特别是对于未鉴定的分离物。于20 °C避光培养，并每周观察样品的生长情况。
5. 真菌在塑料薄膜上的菌丝生长可能在接种后第一周内可见，尤其是在塑料薄膜的边缘处。对于浮游酵母（表现为培养基浑浊），可通过在600 nm处测定光密度来监测其生长。由于真菌可能直接附着于塑料薄膜上，其生长可通过肉眼观察评估，并可通过光学显微镜和/或扫描电子显微镜（SEM）加以确认。
6. 在仅含FMM的对照组中，注意观察微小的白色絮状物，这些絮状物通常过小，无法通过分光光度法检测到光密度的变化。可使用巴斯德移液管吸取絮状物，并通过微分干涉差（DIC）显微镜进行观察。这些絮状物通常为无法辨识的沉淀物，但在某些情况下，可能是已萌发但未显著生长的原始接种物聚集体。
7. 利用肉眼观察和显微镜观察，比较实验样本与对照样本的定植情况，并对每份BDM薄膜上的生长程度进行评级。由于许多BDM材料颜色较深，除边缘区域外难以通过显微镜观察，且薄膜厚度限制了油镜下的观察，因此扫描电镜（SEM）有助于估算 i) 微生物生长的存在， 例如 通过所述的评分系统 表1，以及 ii) BDM降解程度

10. 扫描电镜样品制备

1. 使用洁净的无菌剪刀从重复样品中剪取小块脱细胞真皮基质（BDM）。将BDM浸入含2.5%戊二醛的0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.2）中固定24–48小时。
2. 在固定过程中，通过向纯100%乙醇中加入5–10%体积的3 Å分子筛（在175–260 °C干燥烘箱中活化后置于干燥器中冷却），对乙醇进行脱水处理，并于室温下静置过夜，以确保完全脱水。
3. 将BDM浸入0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7.2）中，每次15分钟，共洗涤四次。
4. 将BDM浸入超纯水中，每次5分钟，共洗涤三次。
5. 将BDM样品依次浸入乙醇梯度溶液中进行脱水处理，每种浓度浸泡20分钟：50%、70%、80%、90%、95%和100%。随后再用100%乙醇漂洗两次，每次20分钟。
6. 对样品进行临界点干燥和喷金镀膜处理。

结果

在最近的一项研究中²⁴，2010年春季，在华盛顿州芒特弗农、田纳西州诺克斯维尔和德克萨斯州拉伯克三个地点，将三种市售标称为“可生物降解”的生物降解地膜（BDM）各设四个重复，另加一种试验性薄膜和一种传统塑料对照，覆盖于土壤表面用于番茄种植。2010年秋季，从四个重复小区中采集经户外老化后的BDM薄膜方块，并从薄膜取样区域正下方挖取原位土壤。每个老化的BDM方块按步骤1所述方法夹入尼龙网袋内的土壤中。同时设置仅含土壤的对照。将网袋埋入先前覆盖地膜的同一小区和行下7.5 cm深的土壤中，静置至次年春季（2011年春季耕作时），历时七个月。随后用铲子将网袋从小区中取出，装入自封袋塑料袋中，并置于冰袋上运输，确保次日送达实验室。

本文报告了我们研究中的代表性结果。在全部三个地点，从每种生物降解膜（BDM）中均分离出本土土壤真菌，共获得54个菌株。我们描述了在其中一个地点（Mount Vernon）使用的两种商业产品的菌株分离情况。其中一种产品为名为BioAgri的可生物降解塑料。这种黑色薄膜标注为“基于淀粉”（BioAgri，Palm...

讨论

本文所述方法是一种从土壤中分离潜在生物降解材料（BDM）降解菌的初步技术，已成功用于分离在土壤中掩埋七个月后的BDM材料上的真菌。当将这些真菌重新接种到相同类型的新型BDM材料上时，真菌能够生长，表明所分离的真菌确实是能够在BDM上定植的菌种，且这些薄膜对真菌生长无抑制作用。分离出的可降解塑料的真菌和细菌未来有可能被单独或组合用于土壤或堆肥改良，以促进塑料的降解。

在自然土壤环境中，微生物物种并非孤立存在。降解塑料的微生物，甚至是以其他碳源和能源生长的寡营养生物，若能在生物降解材料（BDMs）上定殖，可能在这些难降解营养物质的利用过程中发挥关键物种的作用。为了评估BDM的降解情况 体外 但为了更真实地模拟土壤微生物群落，本文所述方法可进行调整，用于测试真菌和细菌接种物的混合物，而非纯分离物。

值得注意的是，菌株 TT、XX、Vv 和 YY 对 BDMs 的降解程度极低，但在平板和液体生物测定中均显示出明显的 BDM 定植现象。因此，可见的定植并不一定意味着 BDM 聚合物的降解。菌株 TT、XX、Vv 和 Y...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
马铃薯葡萄糖琼脂	Becton Dickinson	8X05491
琼脂	Fisher	BP 1423-2
氯霉素	Acros Organics	200-287-4
戊二醛	Electron Microscopy Sciences	16216-10	有毒
分子筛	Fisher	M-8892
乙醇	Pharmco-Aaper	E200
Contrex	Decon Labs, Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging	S37440
缓冲液和培养基用矿物盐	Fisher	Various	多家供应商提供这些试剂