检测 体外 利用分离的小鼠胰岛研究β细胞功能是糖尿病病理生理学和治疗学研究的重要组成部分。尽管许多 下游应用可选，本方案特别描述了细胞内环磷酸腺苷（cAMP）的测定，作为决定β细胞功能的关键参数。
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摘要
摘要
血糖水平失控是糖尿病的典型特征，可导致神经病变、肾病和视网膜病变等并发症。随着免疫介导的1型糖尿病和与肥胖相关的2型糖尿病患病率不断上升，旨在阐明糖尿病病理生理机制及治疗作用机制的研究变得至关重要。胰岛β细胞负责在血糖浓度升高时适当分泌胰岛素。除了葡萄糖和其他营养物质外，β细胞还可受到特定激素——即肠促胰岛素（incretins）的刺激；这类激素在进食后由肠道分泌，并作用于β细胞表面的受体，从而增加细胞内环磷酸腺苷（cAMP）的生成。β细胞功能下降、细胞数量减少以及对肠促胰岛素反应性降低已被充分证实参与2型糖尿病的病理生理过程，且与1型糖尿病的关联也日益受到关注。本小鼠胰岛分离及cAMP测定方案可作为研究疾病进展机制和治疗干预手段的工具，尤其适用于探索通过调节细胞内cAMP生成而发挥作用的肠促胰岛素受体或相关受体介导的机制。尽管本文仅描述cAMP的测定方法，但所介绍的胰岛分离方案可获得高纯度的胰岛样本，亦可用于多种下游应用，包括葡萄糖刺激的胰岛素分泌、[3H]-胸腺嘧啶掺入、蛋白质丰度检测以及mRNA表达分析。
引言
严格维持正常血糖水平对于预防神经病变、肾病和视网膜病变等并发症至关重要，这些并发症均为1型和2型糖尿病病理过程的典型特征1。在1型和2型糖尿病中，β细胞功能下降及细胞数量减少均会扰乱血糖浓度2。1型糖尿病由免疫介导，其特征是胰岛素分泌β细胞遭到严重破坏；而2型糖尿病则表现为β细胞胰岛素分泌受损以及外周胰岛素信号传导障碍，二者共同导致高血糖、脂质代谢紊乱以及肝脏葡萄糖生成增加，最终引起β细胞总量减少以及单个β细胞胰岛素分泌能力下降3。深入理解1型和2型糖尿病进展过程中β细胞的内在机制，有望为开发预防和治疗这些疾病的新疗法提供依据。
体外 组织培养模型，例如永生化β细胞系INS-1和MIN6，可作为研究特定β细胞功能的有用工具。然而，胰岛内不同细胞类型之间的相互作用本身可能调控β细胞功能。例如，α细胞分泌的胰高血糖素可促进胰岛素分泌，而δ细胞分泌的生长抑素则抑制胰岛素分泌，这种旁分泌效应表明细胞间的空间邻近性在内分泌反应中的重要性。4此外，β细胞之间的间隙连接可增强胰岛素的释放5此外，尽管在构建能更准确地模拟分离胰岛对葡萄糖生理反应的胰岛素瘤细胞系方面已取得进展（例如，源自INS-1的832/13和832/3细胞系），它们对葡萄糖的响应性仍不同于正常大鼠胰岛6,7此外，这些克隆性胰岛素瘤细胞系对胰高血糖素样肽-1（....
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方案
所有动物实验均严格遵守相关指南、法规及监管机构的要求。本视频所展示的实验方案是在威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导与批准下进行的。
1. 溶液的配制
- 本方案中采用的安乐死方法是在阿佛丁麻醉下进行放血（有关替代方法的综述，请参见讨论部分）。配制阿佛丁时，将0.625 g（1.25%或44.2 mM）2,2,2-三溴乙醇加入1.25 ml 2-甲基-2-丁醇在15 ml中 锥形管，37℃加热 °在20-30分钟内升温至C。高速涡旋振荡溶液10-15秒 一次加入以充分溶解2,2,2-三溴乙醇。一旦 完全溶解后，将溶液加入48.75 ml 双蒸水2O，通过0.45 μm滤膜过滤 μm 过滤至一个新的50 ml 锥形管，包裹 50 ml 用铝箔包裹锥形管，4℃保存 °C下最多可保存一个月。给小鼠注射前，将试管恢复至室温。
- 配制汉克斯平衡盐溶液（HBSS）时，制备1 L 1x溶液 10 倍浓度的 HBSS Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA）的双蒸H2O，加入0.35 g（4.2 mM）NaCHO3，并在4℃保存 °C 保存不超过 1 月。每只小鼠，....
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结果
为了在分离过程中获得较高的胰岛产量，应严格遵循本方案中所述的手术技术。尽管此处介绍的技术需根据每个实验室的具体情况进行调整，但仍有一些关键步骤可确保分离成功。为了便于暴露胆总管，建议将小鼠的器官移至右侧（图1）。此外，这样做可减少限制胰腺膨胀的重量，从而使胰腺以较小的阻力充分膨胀。另一个提高胰岛产量的关键步骤是在靠近奥迪括约肌处结扎胆总管（图2A-C）。若结扎位置距离奥迪括约肌过远，可能导致胰腺主导管进入的胶原酶溶液量减少，从而造成胰腺部分膨胀。同时，应打紧结，以防止胶原酶溶液流入肠道。
在胆总管上做切口时，应距离肝脏分叉处足够远，但又要足够近，以实现胰腺的最大程度膨胀（图3）。若切口过于靠近分叉处，胶原酶溶液可能流入肝脏。当胶原酶溶液进入肝脏时，肝脏会失去深红色，开始变为灰白色。若出现此情况，应拔出针头，并尝试在距离肝脏更远处重新进行插管。此外，胆总管的切口应仅穿透管壁一半左右（约50%）。若将管壁完全剪断，将难以在针尖周围封闭胆管。恰当的切口可使胆管在针头周围完全闭合，从而产生.......
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讨论
随着糖尿病患病率预计将达到全球人口的7.7%，开发新型研究技术对于深入理解与有效治疗糖尿病至关重要18目前的胰岛分离是一种广泛应用且成熟的方案，用于 体外 实验已在此前略有修改的情况下进行过并已展示11,14,16尽管胰岛素分泌是分离胰岛的常见下游应用，但关注上游组分（如cAMP）可能有助于阐明增强胰岛素生成和分泌的机制。
安乐死方法的选择必须慎重考虑，以确保实验动物的人道待遇以及实验测量结果的完整性。对于胰岛分离，我们首选在麻醉状态下放血致死作为安乐死方法，因为该方法可在胰腺膨胀前使胰岛持续接受含氧血液灌注，时间最长。CO2 吸入法是一种较差的安乐死选择，因为按照人道操作规程进行时，会使胰岛暴露于缺氧血液中至少5-6分钟 在开始操作前。在没有麻醉的情况下进行颈椎脱位，若有科学依据支持，可能是一种可接受的方法，但操作者必须对该安乐死方法以及小鼠解剖和胰腺灌注技术具有丰富经验，以确保人道处死并维持胰岛功能。本方案中选择在麻醉下进行放血处死，首选麻醉剂为 Avertin。选择 Avertin .......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Renee L. Pasker和Harpreet K. Brar在本研究所述实验方案中提供的专业技术支持。此外，我们感谢杜克大学Christopher B. Newgard和威斯康星大学麦迪逊分校Alan D. Attie的指导，以及他们实验室成员的支持，这些支持为我们优化所述实验方案提供了必要的时间与资源。特别感谢Newgard实验室的Hans Hohmeier、Danhong Lu和Helena Winfield，以及Attie实验室的Mary Rabaglia，他们在讨论中提供了富有成效的建议与指导。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金DK080845和青少年糖尿病研究基金会594的资助。
研究基金会资助 17-2011-608（授予 M.E.K.）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶原酶来自 Clostridium histolyticum 适用于分离活性胰岛 | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Hanks平衡盐溶液 10X | 英杰（吉比科） | 14065-056 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| RPMI 1640（粉末） | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| 3/0 丝线缝合线 | Fine Science Tools | 18020-30 | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 0.8 mm 镊子 | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| 弯头剪刀 | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Vannas-Tü宾根弹簧剪 - 直头/锐利/8.5 cm/5 mm 刃口 | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| 解剖剪 | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| 5 ml BD Luer-Lok 注射器 | BD | 309646 | |
| 1 ml BD 注射器 | BD | 309628 | |
| 30 G BD 针头 1/2" 长度 | BD | 305106 | |
| 27 G BD 针头 1/2" 长度 | BD | 305109 | |
| 磨刀石 | Fine Science Tools | 29008-01 | |
| 2-2-2-三溴乙醇 | Sigma-Aldrich | T48402-25G | |
| 2-甲基-2-丁醇 | Sigma-Aldrich | 240486-100mL | |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| 碳酸氢钠（NaHCO₃）3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO₄4·7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| 青霉素-链霉素 | 英杰（吉伯科） | 15140-122 | |
| 热灭活胎牛血清（H.I. FBS） | Fisher Scientific | SH30088.03HI | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX） | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
参考文献
- Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z.
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