检测 体外 利用分离的小鼠胰岛研究β细胞功能是糖尿病病理生理学和治疗学研究的重要组成部分。尽管许多 下游应用可选，本方案特别描述了细胞内环磷酸腺苷（cAMP）的测定，作为决定β细胞功能的关键参数。
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摘要
摘要
血糖水平失控是糖尿病的典型特征，可导致神经病变、肾病和视网膜病变等并发症。随着免疫介导的1型糖尿病和与肥胖相关的2型糖尿病患病率不断上升，旨在阐明糖尿病病理生理机制及治疗作用机制的研究变得至关重要。胰岛β细胞负责在血糖浓度升高时适当分泌胰岛素。除了葡萄糖和其他营养物质外，β细胞还可受到特定激素——即肠促胰岛素（incretins）的刺激；这类激素在进食后由肠道分泌，并作用于β细胞表面的受体，从而增加细胞内环磷酸腺苷（cAMP）的生成。β细胞功能下降、细胞数量减少以及对肠促胰岛素反应性降低已被充分证实参与2型糖尿病的病理生理过程，且与1型糖尿病的关联也日益受到关注。本小鼠胰岛分离及cAMP测定方案可作为研究疾病进展机制和治疗干预手段的工具，尤其适用于探索通过调节细胞内cAMP生成而发挥作用的肠促胰岛素受体或相关受体介导的机制。尽管本文仅描述cAMP的测定方法，但所介绍的胰岛分离方案可获得高纯度的胰岛样本，亦可用于多种下游应用，包括葡萄糖刺激的胰岛素分泌、[3H]-胸腺嘧啶掺入、蛋白质丰度检测以及mRNA表达分析。
引言
严格维持正常血糖水平对于预防神经病变、肾病和视网膜病变等并发症至关重要，这些并发症均为1型和2型糖尿病病理过程的典型特征1。在1型和2型糖尿病中，β细胞功能下降及细胞数量减少均会扰乱血糖浓度2。1型糖尿病由免疫介导，其特征是胰岛素分泌β细胞遭到严重破坏；而2型糖尿病则表现为β细胞胰岛素分泌受损以及外周胰岛素信号传导障碍，二者共同导致高血糖、脂质代谢紊乱以及肝脏葡萄糖生成增加，最终引起β细胞总量减少以及单个β细胞胰岛素分泌能力下降3。深入理解1型和2型糖尿病进展过程中β细胞的内在机制，有望为开发预防和治疗这些疾病的新疗法提供依据。
体外 组织培养模型，例如永生化β细胞系INS-1和MIN6，可作为研究特定β细胞功能的有用工具。然而，胰岛内不同细胞类型之间的相互作用本身可能调控β细胞功能。例如，α细胞分泌的胰高血糖素可促进胰岛素分泌，而δ细胞分泌的生长抑素则抑制胰岛素分泌，这种旁分泌效应表明细胞间的空间邻近性在内分泌反应中的重要性。4此外，β细胞之间的间隙连接可增强胰岛素的释放5此外，尽管在构建能更准确地模拟分离胰岛对葡萄糖生理反应的胰岛素瘤细胞系方面已取得进展（例如，源自INS-1的832/13和832/3细胞系），它们对葡萄糖的响应性仍不同于正常大鼠胰岛6,7此外，这些克隆性胰岛素瘤细胞系对胰高血糖素样肽-1（GLP-1）激动剂的反应彼此之间可能存在显著差异，且与正常胰岛的反应也大不相同。6因此，永生化细胞系可能并非用于检测影响cAMP生成物质的最佳模型。
与胰岛素瘤来源的细胞系不同，仅在整体动物模型中研究β细胞功能也存在一系列复杂问题。使用内分泌组织时最大的挑战之一是精确测量所释放激素的浓度。具体而言，肝脏在胰岛素代谢中起主要作用，而胰腺的血流直接进入肝脏。因此，血浆胰岛素水平的测量可能无法准确反映胰腺本身分泌的胰岛素量，或不同处理对胰岛素分泌速率的影响8。此外，胰高血糖素的肾脏代谢可能限制了胰岛α细胞胰高血糖素输出的可靠性9。因此，分离原代小鼠胰岛进行体外（in vitro）实验，可更精确地理解胰岛对特定刺激的反应，从而补充体内（in vivo）所获得的测量结果。
目前用于分离小鼠胰岛的方案是一种已被多个研究团队广泛采用的成熟方法（可通过一些细微改进进一步提高成功率）10,11。此外，通过检测cAMP的生成水平，可直接评估β细胞对肠促胰岛素的反应性。结合cAMP测定，还可从同一批cAMP样品中定量分析蛋白质含量和胰岛素分泌水平，有助于判断β细胞功能缺陷位于cAMP通路的上游还是下游10。本方案中最终的cAMP含量测定与胰岛素分泌检测应用，是研究药物成分、膳食成分等因素对cAMP及胰岛素分泌影响的有力工具。除仅由葡萄糖刺激外，还可使用其他化合物来检测cAMP和胰岛素分泌的变化10,11。
最后，尽管胰岛素是我们从分离的胰岛中检测的主要激素，但也可通过瞬时刺激实验或定量培养基中的含量，检测其他激素（如胰高血糖素和生长抑素）以及细胞因子、二十碳衍生物和环磷酸腺苷等物质12。此外，尽管超出本文范围，采用所述的胶原酶分离法进行胰岛分离可有效保存胰岛，从而支持多种下游应用，包括胰岛移植、RNA提取用于定量实时PCR或微阵列分析、蛋白质提取用于Western blot检测、胰岛包埋与免疫荧光成像，以及通过[3H]-胸腺嘧啶掺入法评估胰岛细胞增殖，其中部分方法已在先前的JoVE文章中有所描述13-16。总体而言，遵循本方案中所述的胰岛分离流程，可为研究人员提供重要且有价值的信息，助力开发治疗手段并推动以增强β细胞功能为目标的药物发现。
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方案
所有动物实验均严格遵守相关指南、法规及监管机构的要求。本视频所展示的实验方案是在威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导与批准下进行的。
1. 溶液的配制
- 本方案中采用的安乐死方法是在阿佛丁麻醉下进行放血（有关替代方法的综述，请参见讨论部分）。配制阿佛丁时，将0.625 g（1.25%或44.2 mM）2,2,2-三溴乙醇加入1.25 ml 2-甲基-2-丁醇在15 ml中 锥形管，37℃加热 °在20-30分钟内升温至C。高速涡旋振荡溶液10-15秒 一次加入以充分溶解2,2,2-三溴乙醇。一旦 完全溶解后，将溶液加入48.75 ml 双蒸水2O，通过0.45 μm滤膜过滤 μm 过滤至一个新的50 ml 锥形管，包裹 50 ml 用铝箔包裹锥形管，4℃保存 °C下最多可保存一个月。给小鼠注射前，将试管恢复至室温。
- 配制汉克斯平衡盐溶液（HBSS）时，制备1 L 1x溶液 10 倍浓度的 HBSS Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA）的双蒸H2O，加入0.35 g（4.2 mM）NaCHO3，并在4℃保存 °C 保存不超过 1 月。每只小鼠，105 μl 该溶液（另加 5–10 ml） 额外的胰岛用于弥补移液误差。
- 胰岛对缺氧损伤极为敏感；因此，HBSS需用95% O₂2/ 5% CO₂2 以模拟 O 的浓度2 在血液中。可购买特殊的气体混合物，并使用连接有柔韧管的巴斯德移液管建立鼓泡装置。用95% O₂2/ 5% CO₂2 孵育15分钟，按体积加入0.02% RIA级BSA（牛血清白蛋白），并在后续胰岛分离过程中将样品置于冰上保存。
- 对于Ficoll制备，称取32.5 g Ficoll置于400 ml容器中 烧杯，加入 80 ml HBSS，于500-700 rpm下搅拌 30分钟。溶解后，将Ficoll溶液倒入250 ml 量筒，并加入 HBSS 至 130 ml 在量筒上标记，配制25%的Ficoll溶液。用两层Parafilm封住量筒顶部® M（Pechiney Plastic Packaging Company，芝加哥，IL）并剧烈振荡数次。
- 对于23%、20.5%和11%的Ficoll溶液，分别加入27.6 ml、24.6 ml和13.2 ml 分别为25% Ficoll加至50 ml 锥形管。然后将每种溶液补至总体积30 ml 用HBSS重悬并充分混匀。所有四种Ficoll溶液均应于4℃保存 °C 和可使用长达 2 周。
- 适用于分离活性胰岛的胶原酶溶液由来源于胶原酶的胶原酶制备而成 Clostridium histolyticum （材料表）。每批酶都需要检测其酶活性。通常，胶原酶的使用浓度为每毫升0.3–0.5 mg HBSS。利用该范围内的酶浓度（通常为3种不同浓度），测定同龄小鼠或同窝小鼠分离胰岛的质量和数量，以确定工作用酶浓度。
- 确定正确浓度后，每只小鼠需要 35 ml 在HBSS中配制胶原酶溶液，用于整个分离流程。轻轻摇动使胶原酶在HBSS中充分溶解。手术开始前立即预装一支5 ml 用胶原酶溶液填充注射器，安装套管，去除气泡，并置于冰上备用。
- 用于过夜培养的胰岛培养基为添加补充物的RPMI 1640培养基。配制储存液时，将一包RPMI 1640粉末（Gibco，纽约）溶解于1 L双蒸水中2O 并加入 1.19 g HEPES（5 mM）和 2 g NaCHO3 （24 mM）。调节pH至7.4，过滤除菌，4℃保存 °暗处的 C。
- 对于添加补充物的培养基，加入 10% FBS 和 100 IU/100 μg/ml 青霉素/链霉素，分别加入至基础RPMI 1640培养基中。若需不同浓度的葡萄糖，可使用无葡萄糖RPMI 1640培养基，并添加特定浓度的葡萄糖。
- 配制Krebs Ringer Bicarbonate缓冲液（Krebs液）储备液时，将以下成分加入双蒸水中，使其终浓度分别为：NaCl（118.41 mM）、KCl（4.69 mM）、MgSO₄4 (1.18 mM)，KH2PO4 (1.18 mM)，NaCHO3 （25 mM）、HEPES（5 mM）和 CaCl2 （2.52 mM，pH 7.4）。CaCl2 应最后加入，该溶液可在4℃保存 °C，最长可达2 周
- 配制克雷布斯液工作液时，首先用95% O₂2/182 5% CO₂2 10-15 分钟 使用巴斯德吸管在37 °C，随后按体积加入0.5% RIA级BSA。接着，将葡萄糖添加至体外实验所需的浓度。
2. 工具的准备
- 将30号和27号针头的尖端略微钝化 使用磨石将针尖磨钝，使其尖端变圆。在距离针尖约处弯成45度角 ¼ 用钳子从针尖起约一英寸处夹住，注意不要用力过猛，以免压闭针头的内径。
- 将3/0丝线缝合线剪成每段约4英寸的长度，每只小鼠使用一段。
- 用塑料薄膜覆盖解剖显微镜底座，并用胶带固定。
- 裁剪若干张吸水性实验台纸，大小约为 3 x 5 英寸，至少准备 2 张 每只小鼠
3. 小鼠的准备
- 用1 ml 注射器吸取1 ml Avertin。
- 按约40 μl/克体重的剂量将Avertin溶液进行腹腔注射。
- 当小鼠对尾部或后肢足部夹捏不再有反应时，小心将其转移至解剖显微镜操作台。
- 将小鼠仰卧放置，头部朝向远端，用70%水合乙醇喷洒小鼠。务必使用足量的70%乙醇，以减少暴露的胸腔内的毛发。
4. 打开胸腔
- 用手指捏住小鼠两后肢之间的皮肤和皮下组织，切开表皮、真皮及下方的膜结构，形成初始切口。
- 继续保持捏紧皮肤和下方的膜，在小鼠身体两侧分别向前肢方向剪开，注意避免损伤任何内脏器官。
- 将皮肤和膜瓣翻折覆盖至肋骨区域，切除剑突以更方便地暴露胰腺，便于后续灌注操作。
- 调整小鼠方向，使头部朝向近端，并将内脏器官移向工作台右侧，以暴露降主动脉。
- 若无需采集血液组织，可切断降主动脉以完成安乐死。用实验台纸或Kimwipe吸除多余血液，以便更清晰地暴露胆总管。
5. 胰腺的灌注膨胀
- 在解剖显微镜下，重新调整小肠位置，使小鼠的胆总管与小鼠头部呈垂直线。
- 用镊子夹住小肠，找到胆总管末端的乏特氏括约肌（壶腹括约肌），该结构从胆总管延伸至小肠，在粉红色的小肠表面形成一个白色三角形。确定乏特氏括约肌位置后，取一把#5杜蒙特镊子，将镊尖尽可能贴近小肠处滑入胆总管下方，注意不要刺破胆管。
- 穿过小肠和结缔组织后，用杜蒙特镊子的尖端夹住缝线，并将其从胆总管下方拉出。尽可能靠近乏特氏括约肌处结扎胆总管，确保打结紧实，以防泄漏。
- 握住缝线两端并向尾部方向轻拉，使胆总管保持张力。用另一只手使用显微剪在胆总管上靠近其进入肝脏前最后一次分叉的上方做一小切口。注意：切口不宜过于靠近乏特氏括约肌，否则可能导致胰腺部分膨胀；同时避免完全切断胆总管，否则也会导致膨胀不良。
- 在保持缝线两端拉紧、胆总管处于张紧状态的同时，从冰桶中取出预先装有5 ml 胶原酶溶液的注射器/插管，将注射器放置一旁，将钝化的30 G针头插入胆总管切口处，注意不要刺穿胆管壁。如果30 G针头过细无法与胆管形成密封，应将其移除并更换为钝化的27 G针头。
- 固定针头位置的同时，松开缝线并拿起5 ml 注射器。缓慢推动注射器活塞。注意：若针头已成功插入胆总管，则胆管会随之扩张。
- 继续以脉冲式缓慢推动活塞，直至胰腺前端开始膨胀，随后施加轻柔而持续的压力，直到胰腺不再继续膨胀为止。注意：大多数胰腺在开始泄漏前可容纳3–5 ml 液体。成功的膨胀表现为外分泌组织分布均匀，且位于胃上方的胰腺部分充分膨胀。
- 将针头从胆总管中取出，并放置于一旁。
6. 胰腺切除
- 一只手持镊子，另一只手持弯剪 另一只手用镊子夹住壶腹（Sphincter of Oddi）处的小肠。剪刀闭合，用其尖端将部分胰腺与小肠分离。
- 将剪刀张开，以扩大小肠与胰腺之间的间隙。
- 将剪刀的“V”形部位置于刚形成的空隙右侧小肠与胰腺相连处。用镊子轻轻将小肠拉过剪刀，以去除胰腺。
- 继续沿小肠向下操作，直至粉红色的结缔组织处。此时，夹住靠近小肠与胃连接处的位置，将胰腺从小肠其余部分剪离。注意：操作时需小心，避免剪破胰腺，否则可能导致其开始塌陷。
- 用镊子轻轻夹住与胃相连的胰腺部分（平头镊效果最佳）。在轻轻提起胰腺的同时，使用弯头剪刀剪断胰腺与胃之间的连接组织。
- 用镊子在胰腺上方夹住脾脏。使用弯剪剪断脾脏与胰腺之间的连接组织。
- 找到胰腺与大肠相连的位置。用镊子夹起大肠，用剪刀尖刺穿组织。像之前一样将剪刀分开，以在大肠与胰腺之间形成一个间隙。
- 用镊子夹起大肠：这将导致胰腺脱离，从而暴露其与大肠的精确连接部位。剪断剩余的连接组织。
- 找到附着在胰腺和小肠上的粉红色结缔组织，尽可能靠近胰腺处剪断。注意：若担心刺破胰腺，建议更靠近小肠侧剪断，因为结缔组织将在后续步骤中被过滤去除。
- 尽可能多地抓取胰腺并轻轻提起。使用弯剪剪断胰腺与胸腔之间的剩余连接，以完全摘除胰腺。注意：若摘除正确，胰腺应仍处于膨胀状态。
- 将取出的胰腺保存在约 2.5 ml 50 ml 胶原酶溶液 将锥形管置于冰上，直至实验所需的所有其他胰腺均完成灌注并取出。
7. 清洗
- 将所有分离的胰腺分别转移至50 ml 每个含25 ml的锥形管 新鲜胶原酶溶液
- 将50 ml 锥形管直立于37 °C 摇床水浴 能够在振荡器关闭的情况下以220-250 rpm振荡。
- 气体各50 ml 含95% O₂的锥形管2/5% CO₂2 5 分钟 用巴斯德吸管。
- 将每个管子盖紧，水平放置于水浴摇床中，确保位于水面以下。以220-250 rpm振荡。 20秒，每隔1分钟一次，直至16分钟 从第 min 开始 6. （在6、8、10、12、14和16分钟时振荡）
- 立即将试管转移至室温离心机中进行短暂离心。将离心机加速至1,500 rpm （400-500 克）并立即关闭。
- 使用真空抽滤装置，吸取约 22.5 ml 胶原酶溶液，避免扰动沉淀物。用10 ml洗涤 HBSS重悬并轻轻涡旋以充分分散沉淀。
- 在室温下以最高1,500 rpm的速度再次进行短暂离心 (400-500 g)
- 吸出约 10 ml 溶液，再次注意不要扰动沉淀。
- 用另外10 ml清洗 用预冷的HBSS重悬，轻轻涡旋以再次打散沉淀。重复快速离心，并吸除10 ml 溶液的
- 轻轻涡旋残留的2.5 ml液体中的沉淀物 HBSS 溶液。将溶液通过一个 1,000 μm 网格转入新的 50 ml 锥形管。这将去除未被胶原酶消化的大块组织碎片。
- 冲洗旧的50 ml 2.5 ml 锥形管 冰冷的HBSS。在转移2.5 ml前，使用巴斯德吸管彻底冲洗管壁。 通过滤网将HBSS转移至新的50 ml离心管中 锥形管
- 在室温下以1,500 rpm再次进行短暂离心 (400-500 g) 离心以沉淀组织。
- 倾斜试管朝向真空泵，吸除所有HBSS。注意：切勿扰动沉淀，否则将导致胰岛丢失。若沉淀松散或开始向真空泵方向移动，应立即停止吸液，重新离心沉淀组织，然后继续吸除剩余液体。
- 一旦完全移除所有HBSS，加入4.8 ml 加入25% Ficoll溶液并涡旋振荡以打散沉淀。
- 小心地铺加 2.4 ml 将23%的Ficoll溶液沿50 ml离心管管壁缓慢加至25% Ficoll溶液上方 锥形管。为确保均匀分层，旋转50 ml 加入Ficoll溶液时使用锥形管。
- 重复进行分层操作，依次使用20.5%和11%的Ficoll 溶液。注意：如果未出现4个 distinct 层，则加入 HBSS 至 50 ml 标记并倒置离心管4-6次，或直至Ficoll梯度完全消失。重新离心收集组织，并重复步骤7.14–7.16。
- 离心50 ml 室温下以1,820 rpm转速离心锥形管 (800 g) 离心 15 分钟。
- 将所有Ficoll倒入一个新的50 ml离心管中 锥形管，注意留下外分泌组织沉淀。加入预冷的HBSS至50 ml刻度 标记并倒置试管4-6次，以充分混匀Ficoll与HBSS。
- 离心50 ml 室温下以1,820 rpm（800 g）离心5 min。
- 使用真空抽滤装置小心吸除大部分 HBSS/Ficoll 混合液。注意不要扰动沉淀，因为沉淀较为松散，容易被吸出。
- 取一支巴斯德吸管，将沉淀转移至一次性培养管中。
8. 胰岛挑选
- 加入 5 ml 培养基的选择即补充的 RPMI 1640 或 Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液）加入一次性培养管中。注意：挑选用培养基应根据下游应用的不同而有所调整。
- 让胰岛在培养管底部静置5分钟。使用巴斯德吸管将胰岛转移至60毫米×15毫米的聚苯乙烯培养皿中。注意：必须使用培养皿，因为此类培养皿未经表面处理，可防止胰岛贴壁。
- 在另一个 15 mm × 60 mm 的聚苯乙烯培养皿中，加入 5 ml 小鼠胰岛培养基（100 ml） RPMI 1640 培养基，10 ml 热灭活胎牛血清，1 ml 青霉素/链霉素；滤膜除菌。
- 在具备背光功能的解剖显微镜辅助下，使用P-20移液器将胰岛挑取至含有胰岛培养基的培养皿中，注意避免转移腺泡组织碎片。在背光条件下，胰岛呈棕金色，其外膜可能有光泽，而腺泡组织则呈浅灰色且无光泽。若胰岛制备物中含有大量碎片，建议将胰岛在新鲜培养基中手工挑选两次。减少碎片污染可限制胰岛在过夜培养后发生聚集。在消化缓冲液中添加DNA酶（3,000 U/ml）也可能有助于减少胰岛聚集（J.W.J.，个人观察）。注意：为规划后续实验，准确计数所分离的胰岛数量至关重要。
- 过夜孵育胰岛 在设定为37的培养箱中 °C，5% CO₂2.
9. cAMP 检测
- 标记 1.7 ml 微量离心管，每个重复样本各一个 该检测。注意：每个处理条件下，cAMP 检测应至少设置两个重复，但建议每个处理设置更多重复。
- 通气后 Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液孵育 15 分钟 含95% O₂2/5% CO₂2 用巴氏吸管加入0.5% RIA级BSA和终浓度为1.7 mM的葡萄糖（预孵育溶液）。然后加入1 ml 将新鲜充气的Krebs溶液各2 ml加入每个微量离心管中。 每管预孵育和处理时间点需要 Krebs 液；但建议至少准备 5–10 ml 额外。
- 将胰岛轻轻混匀至培养皿中央，使用P-20移液器手动挑选胰岛至新的含5 ml液体的15 mm × 60 mm聚苯乙烯培养皿中 用预孵育液洗涤胰岛，以去除含葡萄糖的培养基。
- 所使用的cAMP检测试剂盒为GE Healthcare的cAMP Direct BioTrak EIA。所采用的实验方案是对“使用非”中所述方法的修改 乙酰化EIA实验步骤采用新型裂解试剂，已优化为每管所需胰岛数量最少，从而可增加处理条件和技术重复的数量。使用P-20移液器，从步骤9.2中将至少13个胰岛转移至每根试管，保持各管间胰岛大小一致，每管体积为1 ml 预孵育缓冲液。注意：增加重复次数比增加每管胰岛数量更有利。然而，如果胰岛数量充足，可均匀增加每管中的胰岛数，建议每管最多使用25–50个胰岛。
- 将微型离心管管盖打开，转移至37 °5% CO₂ 培养箱2 孵育45分钟 以标准化胰岛素分泌 所有胰岛恢复至基线水平。
- 在样品孵育的同时，准备处理液（即 8 mM、11.1 mM、16.7 mM 葡萄糖等）从第9.2步的充气Krebs液中取15 ml 锥形管，含1 ml 额外加入以弥补移液误差。加入3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX），使其终浓度为200 μM. IBMX 是一种广谱磷酸二酯酶抑制剂，可阻断 cAMP 的降解，使其在细胞内随生成而积累。（注意：这是一种真正的 cAMP 生成检测法。有关测量 cAMP 生成可能不理想的情况，请参见讨论部分。若在检测中省略 IBMX，则每管需要更多的胰岛组织，才能获得处于标准曲线线性范围内的 cAMP 数据）。
- 45 分钟后 预孵育后，从培养箱中取出微量离心管，盖上管盖，短暂涡旋振荡每个样品（小于0.5秒）。此步骤旨在混匀因胰岛沉降至管底而可能形成的胰岛素浓度梯度。操作时需避免剧烈涡旋，以免影响胰岛的稳定性（注意：若无法轻柔地进行脉冲式涡旋，可轻轻弹击或颠倒带有胰岛的带盖试管。这些替代操作将延长实验时间，实验设计时应予以考虑）。
- 将每根试管转移至台式离心机（室温）中，离心至胰岛达到10,000 rpm（7,000–7,500 g），随后立即关闭。
- 使用 P-1000 移液器去除每个微量离心管中的大部分 Krebs 溶液，保留约 10–15 μl 用P-20移液器吸除靠近胰岛沉淀物的克雷布斯液部分。若沉淀物受到扰动，将克雷布斯液重新吸入管中并再次离心。
（注意：如果实验者发现去除胰岛沉淀中的Krebs液时难以在不扰动沉淀的情况下完全移除，可保留最后10-15 μL） μl 可在后续步骤中保留，并计入总体积。 - 在保温容器中准备足量液氮，用于孵育后快速冷冻样品。
- 从培养箱中取出样品，盖上管盖，快速涡旋（少于0.5秒），然后将微量离心管在台式离心机（室温）中离心，转速最高达10,000 rpm （7,000–7,500 g），然后立即关闭离心机。如果胰岛素或其他代谢物是后续应用的目标，使用P-1000移液器吸取一定量培养基至微量离心管中，于-20℃保存 °C，以待进一步分析。若无需收集刺激培养基，可将其弃去。
（注意：IBMX 是葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）的强效增强剂。因此，通过 cAMP 刺激培养基获得的 GSIS 结果可能无法准确反映特定处理对 GSIS 的真实作用，尤其是当这些作用较为微弱时。） - 重复步骤 9.9，尽可能吸除刺激液，同时避免扰动胰岛沉淀物。当残留液体少于 10–15 μL 时，立即将胰岛沉淀物在液氮中速冻。 μl 克氏液残留于胰岛沉淀中。所有样本速冻完成后，于-80℃保存 °直至进行 cAMP 测定。
- 在测定cAMP的当天，根据生产商的说明书配制新型裂解试剂。向每支微量离心管中加入200 μl裂解试剂1B，涡旋振荡30秒至充分混匀。将离心管置于冰上孵育10分钟，每隔2分钟涡旋振荡一次。 30秒。（注意：该方案建议使用台盼蓝进行显微镜分析以确认细胞裂解，但胰岛细胞不进行此步骤）。
- 按照制造商说明书中的要求配制工作标准品并设置EIA微孔板。在酶底物与微孔板孵育30分钟后，进行可选的1.0 M硫酸终止步骤，并使用微孔板读数仪在450 nm处测定各孔的吸光度。
- 环磷酸腺苷（cAMP）结果将以 fmol/孔 表示。该数值应根据原始样本的总体积（200 μL）进行归一化处理。 μl + 第9.9步中残留于胰岛的任何剩余克雷布斯液）。随后，结果可归一化至胰岛总数，表示为每个胰岛产生的cAMP飞摩尔数（fmol cAMP/islet）；或者对裂解样品进行二辛可宁酸（BCA）蛋白测定，以总细胞蛋白为基准进行归一化（表示为fmol/μG蛋白）。当样本间胰岛大小不一致时，建议采用后一种方法，可作为替代指标 用于胰岛大小分析。本方案中已成功使用Pierce BCA蛋白检测试剂盒，仅需25 μl样品。牛血清白蛋白（BSA）标准品应使用cAMP检测试剂盒中的裂解试剂1B配制。
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结果
为了在分离过程中获得较高的胰岛产量，应严格遵循本方案中所述的手术技术。尽管此处介绍的技术需根据每个实验室的具体情况进行调整，但仍有一些关键步骤可确保分离成功。为了便于暴露胆总管，建议将小鼠的器官移至右侧（图1）。此外，这样做可减少限制胰腺膨胀的重量，从而使胰腺以较小的阻力充分膨胀。另一个提高胰岛产量的关键步骤是在靠近奥迪括约肌处结扎胆总管（图2A-C）。若结扎位置距离奥迪括约肌过远，可能导致胰腺主导管进入的胶原酶溶液量减少，从而造成胰腺部分膨胀。同时，应打紧结，以防止胶原酶溶液流入肠道。
在胆总管上做切口时，应距离肝脏分叉处足够远，但又要足够近，以实现胰腺的最大程度膨胀（图3）。若切口过于靠近分叉处，胶原酶溶液可能流入肝脏。当胶原酶溶液进入肝脏时，肝脏会失去深红色，开始变为灰白色。若出现此情况，应拔出针头，并尝试在距离肝脏更远处重新进行插管。此外，胆总管的切口应仅穿透管壁一半左右（约50%）。若将管壁完全剪断，将难以在针尖周围封闭胆管。恰当的切口可使胆管在针头周围完全闭合，从而产生...
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讨论
随着糖尿病患病率预计将达到全球人口的7.7%，开发新型研究技术对于深入理解与有效治疗糖尿病至关重要18目前的胰岛分离是一种广泛应用且成熟的方案，用于 体外 实验已在此前略有修改的情况下进行过并已展示11,14,16尽管胰岛素分泌是分离胰岛的常见下游应用，但关注上游组分（如cAMP）可能有助于阐明增强胰岛素生成和分泌的机制。
安乐死方法的选择必须慎重考虑，以确保实验动物的人道待遇以及实验测量结果的完整性。对于胰岛分离，我们首选在麻醉状态下放血致死作为安乐死方法，因为该方法可在胰腺膨胀前使胰岛持续接受含氧血液灌注，时间最长。CO2 吸入法是一种较差的安乐死选择，因为按照人道操作规程进行时，会使胰岛暴露于缺氧血液中至少5-6分钟 在开始操作前。在没有麻醉的情况下进行颈椎脱位，若有科学依据支持，可能是一种可接受的方法，但操作者必须对该安乐死方法以及小鼠解剖和胰腺灌注技术具有丰富经验，以确保人道处死并维持胰岛功能。本方案中选择在麻醉下进行放血处死，首选麻醉剂为 Avertin。选择 Avertin ...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Renee L. Pasker和Harpreet K. Brar在本研究所述实验方案中提供的专业技术支持。此外，我们感谢杜克大学Christopher B. Newgard和威斯康星大学麦迪逊分校Alan D. Attie的指导，以及他们实验室成员的支持，这些支持为我们优化所述实验方案提供了必要的时间与资源。特别感谢Newgard实验室的Hans Hohmeier、Danhong Lu和Helena Winfield，以及Attie实验室的Mary Rabaglia，他们在讨论中提供了富有成效的建议与指导。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金DK080845和青少年糖尿病研究基金会594的资助。
研究基金会资助 17-2011-608（授予 M.E.K.）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶原酶来自 Clostridium histolyticum 适用于分离活性胰岛 | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Hanks平衡盐溶液 10X | 英杰（吉比科） | 14065-056 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| RPMI 1640（粉末） | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| 3/0 丝线缝合线 | Fine Science Tools | 18020-30 | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 0.8 mm 镊子 | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| 弯头剪刀 | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Vannas-Tü宾根弹簧剪 - 直头/锐利/8.5 cm/5 mm 刃口 | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| 解剖剪 | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| 5 ml BD Luer-Lok 注射器 | BD | 309646 | |
| 1 ml BD 注射器 | BD | 309628 | |
| 30 G BD 针头 1/2" 长度 | BD | 305106 | |
| 27 G BD 针头 1/2" 长度 | BD | 305109 | |
| 磨刀石 | Fine Science Tools | 29008-01 | |
| 2-2-2-三溴乙醇 | Sigma-Aldrich | T48402-25G | |
| 2-甲基-2-丁醇 | Sigma-Aldrich | 240486-100mL | |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| 碳酸氢钠（NaHCO₃）3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO₄4·7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| 青霉素-链霉素 | 英杰（吉伯科） | 15140-122 | |
| 热灭活胎牛血清（H.I. FBS） | Fisher Scientific | SH30088.03HI | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX） | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
参考文献
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