我们采用视网膜切除术获取的视网膜样本，对视网膜脱离进行了转录组学分析。我们建立了一种可在手术标本与实验室之间保持RNA稳定性的操作流程。我们标准化了一种通过氯化铯超速离心法纯化RNA的方案，以确保所获得的纯化RNA适用于微阵列分析。
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本文内容
摘要
摘要
视网膜脱离（RD）是指神经感觉层视网膜与视网膜色素上皮层（RPE）之间的分离。RPE 对光敏神经元（即感光细胞）的正常功能至关重要。视网膜与 RPE 的脱离会形成一个由细胞外液填充的物理间隙。RD 会引发一系列影响神经感觉层视网膜和 RPE 的细胞与分子水平的不良事件，因为离子和代谢物的生理交换受到严重干扰。视力受损的程度与脱离持续的时间相关，因为两种组织若能迅速复位，视力便可恢复1。RD 的治疗完全依赖手术。手术中首先切除玻璃体凝胶（玻璃体切除术），随后去除脱离区域周围非必需的视网膜组织，以促进视网膜复位。所切除的视网膜标本属于res nullius（无主之物），因此通常被丢弃。为了从这些手术标本中回收 RNA，我们开发了 jouRNAl 流程，可在标本从手术室转运至实验室的过程中实现 RNA 的有效保存。我们还标准化了一种通过氯化铯超速离心纯化 RNA 的方案，以确保所获得的 RNA 适用于全基因表达分析。RNA 质量通过 RT-PCR 和微阵列分析均得到了验证。数据分析显示，在 RD 过程中炎症反应与感光细胞退化同时发生。
引言
视网膜脱离（RD）的主要治疗目标是寻找一种方法，以限制因感光细胞与视网膜色素上皮细胞分离所导致的感光细胞损伤和视网膜炎症。在RD过程中，RPE细胞被激活，在脱离的视网膜表面迁移、去分化并增殖，产生收缩力，从而引发并发症。对RD进行转录组学分析，有助于识别在RD后表达发生改变的靶基因，进而发现可与手术联合使用以改善最终视力预后的潜在治疗分子。众所周知，核糖核酸（RNA）不如脱氧核糖核酸（DNA）稳定，后者因稳定性高而被广泛用于遗传学研究，甚至可从距今超过30,000年的古生物学样本中测序出尼安德特人基因组2。基因组中基因DNA转录为信使RNA（mRNA）是基因表达的主要过程，而mRNA具有不稳定性，以构成一种可调控的信号。RNA会迅速被RNA酶降解，从而终止该信号。当组织从生物体中分离后，RNA常常在研究实验室进行表达分析前就已降解。降解的RNA不适合用于基因表达分析。由于实验室人员无法参与手术过程，我们开发了一种简便的方法，仅要求外科医生将组织放入适当的无RNA酶溶液中即可。在这种溶液中，组织的RNA在室温下可稳定保存72小时而无任何降解迹象。组织样本中的RNA被转移至实验室后，采用标准化方法进行纯化，包括在氯化铯梯度中进行超速离心3。随后，通过琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR评估RNA的质量。该RNA纯化方案的优势在于可根据DNA与RNA密度不同的物理特性将其分离，确保RNA不被DNA污染，避免在基因表达研究中产生假信号。此外，转运RNA（tRNA）——细胞中含量最丰富的RNA——也可依据相同的物理性质与核糖体RNA（rRNA）和信使RNA（mRNA）分离，后两者即为纯化过程的最终产物。去除tRNA具有重要意义，因为大多数微阵列分析方案涉及使用逆转录酶和RNA聚合酶，而这些酶的活性会受到tRNA的抑制4-6。手术标本中纯化的RNA采用标准流程标记后，杂交至微阵列芯片，结果通过两种互补方法进行分析：错误发现率法，以及基于互信息的新方法，并在基于网络的服务器Retinobase上进行可视化呈现7,8。
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方案
1. jouRNAl：从手术组织块中回收标本的操作步骤
在实验室中
- 从快递公司获取进口合同。
- 填写10份（或25份）运输表格，写明实验室的邮寄地址，并注明实验室的联系人（电话号码和电子邮件地址）。
- 准备10份（或25份）编号为1至10（或25）的样本表格。这些表格包含用于填写以下信息的专用区域：a) 患者的匿名标识信息，b) 手术日期，c) 外科医生希望添加的任何其他备注。同时准备10个（或25个）带衬垫的信封（150 × 210 mm）。
- 使用无RNA酶的试剂配制25 ml（或65 ml）6 M 盐酸胍溶液，溶剂为经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的 H2O（GHCl）。
- 将2.4 ml GHCl溶液分装至10个或25个已编号的5 ml无菌聚乙烯圆底管中。
- 用氩气填充这些管子的上部空间，然后用力拧紧管盖，以防止GHCl溶液在手术柜中长期储存（数年）期间发生氧化。
- 将每个5 ml管放入一个50 ml无菌聚丙烯锥底螺口管中。使用一小块洁净的纸巾固定5 ml管于50 ml管内，然后盖紧管盖。
- 将50 ml管置于聚苯乙烯支架上，并将支架连同带衬垫的信封、运输表格和样本表格一起放入纸板箱中。
- 将操作说明（见：1.12–1.19）粘贴在纸板箱盖内侧，以便于阅读。
- 将纸板箱通过邮寄方式寄送给医院的联系人。
在医院内
- 将纸箱从手术柜中取出，移至手术室。注意事项：如果手术涉及免疫功能低下的患者，则不应将纸箱带入手术室。
- 手术过程中，将视网膜标本放入已编号的5 ml无菌聚丙烯管中，管内预先装有GHCl溶液。盖紧管盖。
- 短暂退回试管。
- 将试管置于血液试管摇床上，摇动10分钟。
- 填写随附的标本编号表格。
- 将标本识别编号记录在对应的编号为50 ml的试管上。
- 将装有手术标本的5 ml试管放入50 ml试管中，更换纸巾并拧紧管盖。
- 将试管及已填写的标本表格一同放入随附的其中一个带衬垫的信封中，并封好信封。
- 联系快递公司安排取件。
2. RNA 纯化
在实验室中
- 将样本置于5 ml聚丙烯管中，加入GHCl溶液，使用匀浆器匀浆1分钟，同时上下移动管子。
- 加入270 μl 2 M乙酸钾溶液（pH 5.0），将管子水平放置于摇床上，剧烈振荡10分钟（420 min-1）。
- 在20 °C条件下，以5,000 rpm（6,500 × g）离心10分钟。
- 小心吸取上清液，避免扰动沉淀。
- 转移至一个14 ml无菌管中。
- 加入5.3 ml 100 mM Tris（pH 8.0）和1% N-月桂酰肌氨酸钠溶液。
- 加入3.2 g氯化铯（CsCl），通过涡旋振荡混合管内溶液。
- 在无菌的11 ml聚碳酸酯离心管中加入1.8 ml氯化铯/乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。
- 使用10 ml无菌巴斯德吸管，将RNA溶液沿管壁缓慢滑入1.8 ml CsCl/EDTA溶液中，避免扰动密度垫层。
- 将离心管（必要时另加一支含缓冲液但不含视网膜的对照管）放入转子中。
- 在20 °C条件下，以32,000 rpm（225,000 × g）离心24小时。
- 用无菌巴斯德吸管移除上层溶液，并弃去。
- 逐渐吸取下层液体，同时观察，当DNA（呈黏稠状）开始被吸出时，立即用第二支无菌巴斯德吸管将其弃去。
- 使用第三支无菌巴斯德吸管小心移除剩余液体，注意不要搅起RNA沉淀。
- 用火焰灭菌的手术刀片切开管底，然后将管子剩余部分倒置在无菌纱布上。
- 翻转管子，用160 μl GHCl溶液轻轻冲洗。
- 让沉淀在空气中干燥10分钟。
- 将沉淀重悬于150 μl（10 mM Tris pH 7.5 - 1 mM EDTA - 0.1% SDS）溶液中。
- 将溶液转移至2 ml无菌微量离心管中，再用30 μl（10 mM Tris pH 7.5 - 1 mM EDTA - 0.1% SDS）溶液收集残留沉淀。
- 加入150 μl（10 mM Tris pH 7.5 - 1 mM EDTA）溶液。
- 加入30 μl 3 M乙酸钠溶液（pH 5.0），涡旋振荡混匀。
- 加入900 μl 100%乙醇（-20 °C预冷），涡旋振荡混匀。
- 将管子置于冰水混合物中放置30分钟。
- 在4 °C条件下，以15,000 rpm离心30分钟。
- 小心吸取上清液并弃去。
- 加入500 μl 70%乙醇（室温），涡旋振荡混匀。
- 在4 °C条件下，以15,000 rpm（18,000 × g）离心20分钟。
- 重复一次洗涤步骤（使用70%乙醇）。
- 短暂离心，用P200移液器吸除残留乙醇。
- 让沉淀在空气中干燥10分钟。
- 将沉淀重悬于50 μl经DEPC处理的H2O中。
- 充分涡旋振荡混匀。
- 在45 °C水浴中孵育15分钟。
3. 琼脂糖凝胶电泳进行RNA分析
- 在化学通风橱内倒入琼脂糖凝胶。
- 在无菌的 1.5 ml 微量离心管中，加入 2 μl 待分析的 RNA 和 6.4 μl 样品制备缓冲液。
- 在第二个 1.5 ml 管中，加入 3 μl RNA 标准品和 9.6 μl 样品制备缓冲液。
- 将上述管子在 65 °C 下加热 15 分钟，然后置于冰上冷却。
- 在 RNA 样品管中加入 1 μl 不含染料的溴化乙锭（EB）上样缓冲液，在 RNA 标准品管中加入 1 μl 含染料的 EB 上样缓冲液。
- 在化学通风橱内，以 80–100 V 电压在电泳缓冲液中进行电泳，直至其中一种染料（溴酚蓝）迁移至凝胶底部的 2/3 处。
- 用 250 ml 经 DEPC 处理的 2× SSC 溶液冲洗凝胶，每次 15 分钟，共冲洗两次。
- 在紫外光照射下拍摄数字化图像。
- 计算上条带（23S rRNA）与下条带（16S rRNA）之间的比值。
4. RNA 的最终纯化
- 用经DEPC处理的H2O将RNA样品体积调至100 μl（如有必要）。
- 加入100 μl酸性酚（1 ml经DEPC处理的H2O饱和酚 + 130 μl 50 mM乙酸钠，pH 5.2），剧烈涡旋振荡。
- 室温下以13,000 rpm（15,000 × g）离心10分钟。
- 小心回收并转移水相（上层）至新的无菌1.5 ml微量离心管中。
- 加入10 μl 3 M乙酸钠（pH 5.2）和250 μl 100%乙醇（-20 °C预冷）。
- 将离心管置于冰水混合物中孵育30分钟。
- 在4 °C下以14,000 rpm（18,000 × g）离心30分钟。
- 小心吸除上清液，并弃去。
- 加入500 μl 70%乙醇（室温），涡旋振荡混匀。
- 在4 °C下以14,000 rpm（18,000 × g）离心20分钟。
- 重复洗涤步骤（70%乙醇）一次。
- 短暂离心，用P200移液器吸除残留乙醇。
- 将沉淀在空气中干燥10分钟。
- 将沉淀重悬于50 μl经DEPC处理的H2O中。
- 随后将离心管在45 °C孵育15分钟。
- 取2 μl RNA样品，测定260 nm和280 nm处的吸光度（Abs），计算Abs260/Abs280比值。
- 将RNA样品储存于-80 °C（可稳定保存数年）。
5. 溶液与清洗步骤
- 2 M 醋酸钾，pH 5.0：将 19.6 g 醋酸钾溶解于 70 ml DEPC 处理的 H2O 中。将 pH 计探头浸泡于 1 M NaOH 中 15 分钟进行清洗，随后用 DEPC 处理的 H2O 冲洗 5 次。用乙酸调节 pH 至 5.0，再用 DEPC 处理的 H2O 定容至 100 ml。
- 100 mM Tris-HCl，pH 8.0，1% N-月桂酰肌氨酸钠：在通风橱中将 2 g N-月桂酰肌氨酸钠溶解于 40 ml 0.5 M Tris 碱液（pH 8.0）中，再用 DEPC 处理的 H2O 定容至 200 ml。CsCl/EDTA：将 96 g CsCl 溶解于 50 ml 用 DEPC 处理的 H2O 配制的 10 mM EDTA（pH 7.5）中。高压灭菌后，用 DEPC 处理的 H2O 定容至 100 ml。检测 pH<7.5。
- 1% 琼脂糖凝胶：将 1 g 琼脂糖加入 62 ml DEPC 处理的 H2O 中，在微波炉中煮沸。加入 18 ml 12.3 M 甲醛和 20 ml 5x MOPS 缓冲液。在化学通风橱内倒入模具。
- 样品制备缓冲液：现用现配。在化学通风橱中混合 8 μl 5x MOPS、16 μl 12.3 M 甲醛和 40 μl 甲酰胺。
- EB 上样缓冲液（无染料）：现用现配。将 4 μl 10 mg/ml 溴化乙锭加入 20 μl 用 DEPC 处理的 H2O 配制的 80% 甘油中。
- EB 上样缓冲液（含染料）：现用现配。将 2 μl 10 mg/ml 溴化乙锭加入 10 μl 含 0.25% 二甲苯青、0.25% 溴酚蓝的 80% 甘油溶液中（以 DEPC 处理的 H2O 配制）。
- 电泳缓冲液：向 60 ml 5x MOPS 缓冲液中加入 54 ml 12.3 M 甲醛和 186 ml DEPC 处理的 H2O。
- DEPC 处理的 H2O：将蒸馏水与 0.1%（v/v）焦碳酸二乙酯混合，在 37 °C 下搅拌孵育 2 小时，高压灭菌灭活。
- 匀浆器清洗：将 25 ml 清洗液（RBS）加入 1 L DEPC 处理的 H2O 中，将转轴浸入并搅拌 1 分钟。60 °C 孵育 2 小时，用 DEPC 处理的 H2O 充分冲洗。用铝箔包裹仪器并放入仪器盒中，再将盒子包好，高压灭菌。
- 电泳装置清洗：清洗电泳装置、托盘和 15 孔梳子。在 3% 过氧化氢中孵育 15 分钟，用 100% 乙醇冲洗一次，自然晾干。
- 玻璃器皿清洗：用 2% RBS 溶液清洗玻璃器皿过夜，然后在 200 °C 灭菌前用蒸馏水冲洗干净。
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结果
该方案（图1）使我们能够从手术组织块中获取视网膜样本，提取纯化RNA，并分析视网膜脱离状态下的转录组。视网膜脱离导致单核细胞趋化因子MCP1基因CCL2的表达上调，同时导致视杆光感受器转导基因GNAT1、短波视锥视蛋白OPN1SW以及同源盒基因CRX的表达下降（图2）。CCL2的诱导表达源于炎症反应9，而GNAT1、OPN1SW和CRX的同步减少则是视杆细胞和视锥细胞发生光感受器变性的结果。视锥细胞的丢失可能与NXNL1基因表达的丧失有关，该基因编码一种由视杆细胞衍生的视锥细胞存活因子7,10，或与其旁系同源物RdCVF2有关，后者由NXNL2基因编码。令人意外的是，NXNL2信使RNA存在两种不同的形式。版本1（NM_001161625.1）是基于系统发育分析推导出的编码序列，但此前尚未见其表达报道11；而版...
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讨论
建立从手术组织块中回收组织的流程对于视网膜脱离的转录组分析至关重要。需要注意的是，此类手术属于急诊手术，眼科医生在手术过程中几乎没有时间参与生物医学研究项目。此外，这种视网膜切除术在各个医疗机构中均为随机开展，因此要达到统计学样本量，最有效的方式是通过协作网络进行合作。在这种协作网络中，组织样本采集的标准化对于后续生物学分析的成功至关重要。我们提供了一种使用极为简便且说明精确的采集工具包，可常温存放于手术室附近的手术柜中，从而鼓励外科医生积极参与本研究。
此外，通过标准化RNA纯化流程，可最大限度地利用这些珍贵的临床样本。纯化的RNA样品可在-80 °C长期保存数年，并可用于未来随着新兴基因组学技术发展而开展的进一步研究。本方案适用于视网膜手术样本，也可成功用于分离大鼠视网膜组织（经解剖后）的RNA。若RNA发生降解，a）请检查CsCl/EDTA溶液的pH值；b）确保所有溶液均使用未开封的全新试剂配制。该技术的主要限制在于起始材料的数量，应至少相当于50,000个细胞。
此处所用方法与大多数商业试剂在分离总RNA方面的区别在于...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Sacha Reichman 和 Dominique Santiard-Baron 在编辑 RNA 纯化方案过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 离心机 | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| 转子 | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| 超速离心机 | Beckman Coulter | LE 80K | |
| 转子 | Beckman Coulter | SW41 | |
| 电源 | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | 配备 PT-DA 2105:2 |
| 琼脂糖凝胶电泳装置 | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| 成像系统 | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml 无菌聚乙烯管 | Greiner | 115261 | |
| 无菌聚碳酸酯离心管 | Beckman Coulter | 331372 | |
| 化学试剂 | Sigma | 分子生物学级（无RNase和DNase产品） | |
| 清洗液 | VWR | RBS | |
| 微阵列芯片 | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
参考文献
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重印与许可
