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方法文章

荧光组织移植后用于可视化细胞来源、类型及相互作用的定量多光谱分析

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DOI：

10.3791/50385

⸱

2013年9月22日

 ,  , 
1Department of Leukemia, MD Anderson Cancer Center, 2Wake Forest Baptist Medical Center, Institute for Regenerative Medicine

本文内容

摘要

复杂的组织团块，从器官到肿瘤，均由多种细胞成分构成。我们利用多重荧光标记的转基因小鼠，结合多参数免疫荧光染色及光谱解混技术，解析了组织内不同细胞表型的贡献，从而根据蛋白质表达情况确定细胞来源及其特性。

摘要

为了理解多种细胞成分在复杂组织发育过程中的作用——例如参与组织再生、肿瘤形成或血管发生过程中的多种细胞类型，我们设计了一种多色细胞移植模型来研究肿瘤发育。在该模型中，不同荧光标记的报告基因小鼠来源的细胞群体被移植、植入或注射到正在发育的肿瘤内部或周围。这些带有颜色标记的细胞随后被募集并整合进肿瘤间质中。为了定量评估来源于骨髓的肿瘤间质细胞，我们按照IACUC批准的方案，将表达GFP的转基因全骨髓移植到经致死剂量照射的表达RFP的小鼠体内。移植小鼠体内原位注射卵巢肿瘤后，于移植后6–8周切除肿瘤，并利用多光谱成像技术分析其骨髓来源标记（GFP）以及检测肿瘤相关间质的抗体标记。随后，我们改进了一种称为MIMicc（多光谱解析多重细胞组成）的方法，通过荧光探针的多光谱解混技术，定量评估每种标记细胞来源于哪一群起始细胞（依据原始报告基因标签）。随着每张切片可解混4、5、6或更多光谱的能力不断提升，我们进一步增加了与细胞谱系或分化相关的免疫组织化学染色，以提高分析精度。通过使用软件识别共定位的多重荧光信号，可对肿瘤间质细胞群体进行追踪、计数和基于标志物染色的表征。1

引言

理解组织发育和修复过程对于阐明伤口愈合2,3、再生医学、发育生物学以及肿瘤生物学中参与的细胞成分具有重要意义。在修复过程中，多种类型的细胞会浸润至周围微环境，参与血管化、细胞外基质（ECM）沉积、细胞增殖及组织重构。基于多参数、多重标记物，可识别细胞因子和细胞表型，从而确定研究微环境中各细胞成分的定位、分化状态及其相互作用。本文以肿瘤发育为例，介绍这种多色-多细胞移植模型的典型应用，并结合多光谱成像与光谱解混分析方法进行阐述。

肿瘤进展是一个多步骤过程，其特征是获得多种能力，包括增强的增殖能力、抗凋亡能力、侵袭性以及血管生成特性。4 肿瘤的发展依赖于被招募至其周围环境中的非肿瘤性细胞，这些细胞可提供生长因子、结构基质、血管网络以及免疫调节作用。1,5,6 这种微环境由来自局部邻近组织（如脂肪组织和血管）以及远端来源（如骨髓来源细胞）的细胞共同构成。1 非肿瘤性细胞的整合程度取决于肿瘤的需求，通常与肿瘤的分期/分级相对应。为了理解肿瘤支持性微环境的作用，必须明确这些非肿瘤性细胞群体的来源及其分化潜能。

本方案旨在通过可视化骨髓来源的细胞组分和局部组织来源的细胞，辅助解读肿瘤进展过程。利用表达荧光报告基因的转基因小鼠，我们将表达GFP（绿色荧光蛋白）的骨髓移植到经致死剂量照射的RFP（红色荧光蛋白）小鼠体内。在骨髓成功植入后，将同基因型肿瘤细胞系原位注射，并使其植入生长4至8周。随后将小鼠体内的肿瘤组织切除，并进行免疫荧光（IF）染色，以观察其基质组分。多重IF标记是一种常用技术，通常需要大量优化7-9；然而，采用多光谱成像/解混平台可提高对具有光谱重叠的荧光标记组合的检测能力。本文介绍一种我们称之为MIMicc（多光谱解析多重细胞组分）的技术，可在单张肿瘤切片上对多达八种标记物进行染色与分析，从而研究肿瘤微环境中各组分的细胞来源、细胞分化状态以及细胞间相互作用。这一简化的示例具有扩展潜力，可用于分析五种、六种或更多标记物，所用方法包括抗体染色或由细胞内启动子驱动的荧光表达。表1列出了考虑了合适物种来源的潜在荧光抗体染色组合。

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方案

根据机构IACUC方案批准的同基因小鼠骨髓移植（BMT）（注意：本方案的成功实施需要使用任何标记的细胞类型作为多光谱分析的目标；为了便于下游分析，可利用任何遗传性或稳定的细胞标记。我们建议，任何细胞、组织或未来器官均可应用于移植模型，且移植物中可包含研究所需数量的多种独特标记细胞群体。此外，可设计多重标记的细胞系统，例如在转基因小鼠中包含多种谱系限制性荧光标记群体，以消除移植并发症，用于特定病理状态的研究。

  1. 在用供体骨髓重建前4小时，以单次9.5 Gy剂量致死性照射BMT受体小鼠。（BMT GFP受体小鼠应为6–10周龄）。
  2. 用70%乙醇润湿小鼠皮毛，然后用无菌手术剪剪开并剥离皮毛以暴露后肢。在骶髂关节处切除整个后肢，包括髂嵴。在踝关节上方剪除足部，然后彻底去除骨骼上的所有肌肉、韧带和多余组织。使用23 G针头，以含2%无菌胎牛血清的PBS（PBS-2）冲洗胫骨、腓骨和髂嵴中的骨髓。（BMT RFP供体小鼠应按照机构标准实施安乐死。）
  3. 使用解剖刀和镊子将残留骨骼切片并轻轻压碎成碎片，放入50 ml锥形管中，加入含3 μg/ml I型胶原酶的溶液，在37 °C、300 rpm条件下消化1小时。
  4. 用PBS-2补满管体积，收集上清液至新管中，并与冲洗所得细胞合并。在4 °C条件下以250 rpm离心5分钟。
  5. 将细胞重悬于PBS-2中，经40 nm细胞滤器过滤。此时，若需对BMT中的特定细胞群进行操作，可对细胞进行荧光标记并进行荧光激活细胞分选（FACS）。
  6. 每只小鼠按每100 μl PBS重悬2 × 106个细胞。使用29 G针头，通过尾静脉或眶后静脉（针尖斜面朝上）系统性注射至经照射的GFP受体小鼠体内。另设一只小鼠仅注射100 μl PBS作为移植对照。注射前使用加热灯扩张血管，注射时使用尾静脉注射固定器。准备无菌纱布，用于注射后对尾部施加轻压。
  7. BMT术后三周，通过眶后途径采集血液，利用流式细胞术分析，确认循环中存在GFP阳性细胞且无RFP阳性细胞。此时对照小鼠应已死亡。

2. 根据机构IACUC指南进行肿瘤移植

  1. 培养ID8小鼠卵巢肿瘤细胞 体外 之前 在体内 注射（1 × 106 每只小鼠的细胞数）。注射当天，用胰蛋白酶消化细胞，以 PBS 洗涤，并重悬于 PBS 中至浓度为 1 × 10⁶6 每 100 μl 细胞数
  2. 将肿瘤细胞注入小鼠腹腔内，进针时针头斜面朝上。用70%乙醇对注射部位进行消毒。注射部位为腹部左下象限或右下象限（位于雌性小鼠下部乳头的头侧且略偏内侧），注意避免刺中器官。通过抓握小鼠颈背部皮肤并用小指或无名指固定尾巴来固定小鼠。此操作过程中可使用异氟烷对小鼠进行麻醉。
  3. 当出现肿瘤移植成功的迹象（如轻微腹部膨胀）时，处死小鼠。此过程将在4至12周内发生。
  4. 从腹腔内切除肿瘤。腹腔内的肿瘤表现为器官表面及其周围白色的结节。使用手术刀将肿瘤切除，并置于含有10%福尔马林的试管或容器中固定24小时。若缺乏石蜡包埋和切片制备所需的试剂与材料，可将组织学样品外包至病理科或组织学核心实验室进行处理。将组织在载玻片上切成5–8 μm的切片，用于后续染色操作。

3. 多参数免疫荧光染色

  1. 为实验中使用的每种荧光探针制备单色对照切片。在此情况下，共使用四种颜色，因此需要为每种单独颜色各准备一张切片，另加一张背景噪声对照切片，以及一张全组合染色切片（总切片数 = 6）。所有切片需并行处理，操作方式完全相同，以尽量减少实验变异。
  2. 将石蜡切片在 56 °C 下烘烤 1 小时。
  3. 用二甲苯洗涤切片 3 次，每次 10 分钟。
  4. 用 100% 乙醇洗涤 2 次，每次 5 分钟。
  5. 用 95% 乙醇洗涤 1 次，持续 3 分钟。
  6. 用 90% 乙醇洗涤 1 次，持续 2 分钟。
  7. 用 70% 乙醇洗涤 1 次，持续 2 分钟。
  8. 用水洗涤 1 次，持续 2 分钟。将染色架缓慢浸入水中并取出，重复 10 次。
  9. 在最后一次洗涤过程中，将柠檬酸钠缓冲液预煮沸 2 分钟（高火微波加热）。（可根据所用抗体替换为 Tris-EDTA 缓冲液）
  10. 将切片在柠檬酸钠缓冲液中煮沸 20 分钟（微波炉 10% 功率或使用压力锅）。若缓冲液沸腾，关闭微波炉并静置。
  11. 从热源移开，让切片在柠檬酸钠缓冲液中静置 30 分钟以冷却。
  12. 用清水冲洗切片 5 分钟。
  13. 用 Pap Pen 在肿瘤组织切片周围画圈，并加入 2% BSA/1% FBS 马来酸阻断缓冲液，封闭 1 小时。此步骤中需单独处理各张切片，避免其干燥。
  14. 在阻断缓冲液中按最佳稀释比例配制一抗。（如果所用抗体来自不同物种（或同一物种的不同 IgG 亚型，例如 IgG1 与 IgG2a），则可在一次孵育中联合使用。若抗体物种相同，则必须依次孵育，以尽量减少抗体交叉反应。）
  15. 此时，保留两张切片仅含阻断缓冲液，作为未染色对照和细胞核染色对照。其余单色对照切片将分别与对应的一抗孵育。仅分析切片将同时含有多种一抗的组合。
  16. 将切片置于湿盒中，在 4 °C 下于缓慢旋转摇床上与一抗孵育过夜（约 16–20 小时）（注意： 当使用 4 种及以上荧光染料时，可能需要采用顺序染色或直接偶联方法，以尽量减少抗体交叉反应。在此情况下，需重复步骤 1.16–1.21，直至所有抗体均已被施加到切片上。）
  17. 在 PBST 中轻轻振荡洗涤切片 10 分钟（2 次）。
  18. 在洗涤过程中，用阻断缓冲液配制 Alexa Fluor 488、594 和 647 二抗，最终稀释比例为 1:1,000。（确保这些抗体及其稀释液始终保存在 4 °C 并避光，以维持批次间及长时间内的荧光稳定性。）
  19. 在单色对照切片上，加入与所用一抗物种匹配的单一 Alexa Fluor 稀释液。所有二抗均加至分析切片上。未染色对照和细胞核染色对照切片在此步骤中继续保留阻断缓冲液。
  20. 在湿盒中孵育（用铝箔覆盖以避免光照），于室温下在缓慢旋转摇床上孵育 2 小时。
  21. 在 PBST 中轻轻振荡洗涤切片 5 分钟（2 次）。用铝箔覆盖以避光。
  22. 向 仅 DAPI 染色切片 和 分析切片 中加入 DAPI（1:10,000），孵育 1 分钟。用铝箔覆盖以避光。其余切片可保留在洗涤容器中并覆盖。
  23. 将经 DAPI 孵育的两张切片在单独容器中进行第一次 5 分钟洗涤，以避免 DAPI 污染其他切片。第二次 5 分钟洗涤时，可将所有切片合并于 PBST 中（所有洗涤均应在摇床上进行）。用铝箔覆盖以避光。
  24. 封片前将切片短暂浸入水中（使用 1.5 厚度盖玻片和水性封片介质以保持荧光）。
  25. 在室温下避光干燥 3 小时。
  26. 用指甲硬化剂密封盖玻片边缘。（切勿使用指甲油，因其含有的丙酮可能淬灭荧光信号）。
  27. 立即进行切片分析，或于 4 °C 保存以备后续分析。

4. 多光谱成像

  1. 使用配备液体可调谐滤光片的 Nuance EX 相机，在 Olympus X-63 正置显微镜上结合 Nuance 软件采集多光谱图像。
  2. 使用油镜以提高分辨率采集图像。
  3. 初始设置包括为所使用的每种荧光染料设定光谱范围。
    1. 对于4色：
      1. DAPI：420-480 nm
      2. AF488：490-580纳米
      3. AF594：590-640纳米
      4. AF647：650-720 nm
  4. 拍摄分析载玻片的初始图像，以获得每个光谱范围的合适曝光时间。
  5. 创建 "谱图库" 软件将利用该参数来识别并区分各荧光染料之间的信噪比以及背景信号。注意： 每个 每种荧光染料必须拥有独立的单色对照切片，以构建包含适当波长曲线的光谱库，从而确保数据集的准确分析。（示例：3 种荧光染料 = 4 张对照切片；5 种荧光染料 = 6 张对照切片）
    1. 成像 未染色载玻片 首先。该切片将在光谱库中被指定为 背景.>
    2. 成像 仅DAPI染色载玻片 第二步。此载玻片将用于标记经 DAPI 染色的细胞核 "绘制" 工具，并将保存在谱库中作为 DAPI.>
    3. 成像 仅AF488载玻片 第三步。此载玻片将用于标记AF488染色的区域 "绘制" 工具，并将保存在光谱库中作为 AF488.>
    4. 成像 仅含AF594的载玻片 第四步。此载玻片将用于标记AF594染色的区域 "绘制" 工具，并将保存在光谱库中作为 AF594.>
    5. 成像 仅 AF647 载玻片 第五步。此载玻片将用于标记AF647染色的区域 "绘制" 工具，并将保存在谱库中 AF647.>
    6. 在收集完每个单独的光谱组分后，保存光谱库和实验方案。>
  6. 一旦光谱库构建完成，即可在其中寻找感兴趣的区域 分析载玻片 在显微镜下观察并采集/保存图像。>

5. 多光谱图像的定量分析

  1. 使用 InForm 软件导入一组具有代表性的已获取的 Nuance 图像。
  2. 按照程序提示打开已保存的光谱库。
  3. 识别待分析的感兴趣组织区域（例如 肿瘤组织与脂肪组织）。
  4. 基于 DAPI 染色识别单个细胞。细胞质将根据细胞核的形态自动定义。
  5. 为每个荧光参数选择所需的荧光强度读数方式（例如 均值、标准差）。
  6. 批量处理已获取的图像，并让软件使用建议的算法进行处理。
  7. 图像处理完成后，合并结果文件。
  8. 在 Excel（或其他分析软件）中打开结果，将两种荧光强度以 XY 坐标轴形式相互对照作图。每种荧光强度均按单个细胞给出。双阳性细胞将出现在右上象限。用户需自行定义基础荧光强度阈值。

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结果

利用多光谱成像技术分析移植于我们转基因BMT小鼠模型中的肿瘤，能够识别出源于骨髓的肿瘤间质组分。移植后三周通过流式细胞术确认了初始BMT结果。图 1）。在确认骨髓移植（BMT）嵌合后，将未标记的卵巢肿瘤正位注射至小鼠体内，初次注射肿瘤6周后切除肿瘤组织并用福尔马林固定。将石蜡包埋的肿瘤组织切片进行切片处理 <8 μm 切片并染色。为每种荧光染料制备相应的单色对照切片，包括一个用于背景自发荧光的对照。 表1 包含用于2至7个参数的潜在物种和荧光染料组合。染色完成后，使用Nuance相机附件和Nuance软件采集图像。通过单色对照切片建立光谱库后（图2A），我们能够分离出多标记卵巢肿瘤切片的图像，这些图像显示了GFP（抗体#1）的表达以及细胞核DAPI和另外两种标记物（抗体#2和抗体#3）的信号。图2B可添加更多标记物 图2C-D 显示了包含六个标记物及细胞核染色的肿瘤切片图像。最后，将所有获取的图像导入InForm（CaliperLS, Hopkinton, M...

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讨论

本文中，我们描述了一种多光谱成像技术的应用，称为MIMicc（多光谱解析多重细胞组成），用于分析肿瘤微环境中来源于骨髓的基质成分。然而，该方法和概念亦可应用于解析构成复杂组织的其他细胞组分，例如在伤口愈合反应或再生组织过程中所观察到的组织。在这些实验中，我们利用转基因小鼠，通过荧光信号区分移植肿瘤微环境中的骨髓来源细胞与宿主来源细胞。然而，该技术同样适用于任何报告基因标记的细胞，尤其适用于可通过免疫组织化学清晰识别的基因标签表达细胞，例如LacZ、葡萄糖醛酸酶、His(6X)-、HA、FLAG标签标记的细胞。 等等。11.

在本模型中，移植小鼠处死后，对肿瘤组织切片进行处理，并使用抗体染色以鉴定细胞来源：来源于RFP+骨髓供体或GFP+宿主组织。在图2中，我们展示了两种标志物与肿瘤微环境中宿主来源的GFP+细胞共表达。然而，在图2D中，我们展示了利用同一系统实现七色染色的潜力。

这些数据展示了利用我们的移植和多光...

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披露

FCM、CMB 和 ELS 不存在利益冲突，无可披露内容。

致谢

我们感谢来自MD安德森癌症中心流式细胞术与细胞成像核心设施的Michael Andreeff博士（医学博士、哲学博士）和Jared Burks博士（哲学博士）所提供的讨论、指导与支持。本工作部分由美国国家癌症研究所资助（资助号：RC1-CA146381、CA-083639、R01NS06994、CA116199 和 CA109451，用于FCM）。ELS还获得了美国国防部陆军部门（BC083397）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
.2 μm 滤膜Fisher09-740-35A
10 ml 带锁扣注射器BD309604
25 G 针头CardinalBF305122
40 nm 滤膜BD352340
50 ml 锥形管Fisher1495949A
Alexa Fluor 488-ms1InvitrogenA21121
Alexa Fluor 594-RbInvitrogenA21207
Alexa Fluor 647-chInvitrogenA21449
BSASigmaA7906-500G
盖玻片Corning2940-243
CRI-NuanceCaliper Life Sciences
DapiInvitrogenD1306
DMEMCellGro10-017-CV
乙醇Dharmacon4004-DV
FBSInvitrogen16000-044
GFP-ms1Abcamab38689
胰岛素针头BD329424
马来酸Acros100-16-7
湿盒Evergreen240-9020-Z10
封片介质DakoS3023
指甲硬化剂Sally Hansen2103
画圈笔（Pap pen）AbcamAb2601
青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺Invitrogen10378016
无菌 PBSInvitrogen14040-182
胰蛋白酶Invitrogen252000-56
封闭缓冲液 14.51 g 10.95 g9+g250 ml
马来酸
NaCl
NaOH 颗粒（调至 pH 7.5）
蒸馏水
*将 0.2% Tween-20 加入 1x 溶液中，配制含 2% BSA/2% FBS 的封闭缓冲液。搅拌并过滤。
抗原修复缓冲液： 1.21 g0.37 g1000 ml（配制 10x 用 100 ml，配制 20x 用 50 ml）0.5 ml
Tris-EDTA 缓冲液
(10 mM Tris 碱，1 mM EDTA 溶液，0.05% Tween 20，pH 9.0)
Tris 碱
EDTA
蒸馏水
Tween 20
*室温保存 3 个月，或 4 °C 长期保存 2.94 g1000 ml1N0.5 ml
柠檬酸钠缓冲液
(10 mM 柠檬酸钠，0.05% Tween 20，pH 6.0)
三水合柠檬酸三钠
蒸馏水
HCl（调节 pH 至 6.0）
Tween 20

参考文献

  1. Kidd, S., et al. Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma. PLoS ONE. 7, e30563(2012).
  2. Quintavalla, J., et al. Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects. Biomaterials. 23, 109-119 (2002).
  3. Sasaki, M. Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type. Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).
  4. Spaeth, E. L. Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression. PLoS ONE. 4, e4992(2009).
  5. Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells. Genes and Development. 22, 559-574 (2008).
  6. Weis, S. M., Cheresh, D. A. Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets. Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).
  7. Bataille, F. Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).
  8. van Vlierberghe, R. L., et al. Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections. Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).
  9. Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC cell biology. 9, 13(2008).
  10. Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
  11. Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. New routes for transgenesis of the mouse. Journal of applied. 53, 295-315 (2012).

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