荧光组织移植后用于可视化细胞来源、类型及相互作用的定量多光谱分析

摘要

复杂的组织团块，从器官到肿瘤，均由多种细胞成分构成。我们利用多重荧光标记的转基因小鼠，结合多参数免疫荧光染色及光谱解混技术，解析了组织内不同细胞表型的贡献，从而根据蛋白质表达情况确定细胞来源及其特性。

摘要

为了理解多种细胞成分在复杂组织发育过程中的作用——例如参与组织再生、肿瘤形成或血管发生过程中的多种细胞类型，我们设计了一种多色细胞移植模型来研究肿瘤发育。在该模型中，不同荧光标记的报告基因小鼠来源的细胞群体被移植、植入或注射到正在发育的肿瘤内部或周围。这些带有颜色标记的细胞随后被募集并整合进肿瘤间质中。为了定量评估来源于骨髓的肿瘤间质细胞，我们按照IACUC批准的方案，将表达GFP的转基因全骨髓移植到经致死剂量照射的表达RFP的小鼠体内。移植小鼠体内原位注射卵巢肿瘤后，于移植后6–8周切除肿瘤，并利用多光谱成像技术分析其骨髓来源标记（GFP）以及检测肿瘤相关间质的抗体标记。随后，我们改进了一种称为MIMicc（多光谱解析多重细胞组成）的方法，通过荧光探针的多光谱解混技术，定量评估每种标记细胞来源于哪一群起始细胞（依据原始报告基因标签）。随着每张切片可解混4、5、6或更多光谱的能力不断提升，我们进一步增加了与细胞谱系或分化相关的免疫组织化学染色，以提高分析精度。通过使用软件识别共定位的多重荧光信号，可对肿瘤间质细胞群体进行追踪、计数和基于标志物染色的表征。¹

引言

理解组织发育和修复过程对于阐明伤口愈合^2,3、再生医学、发育生物学以及肿瘤生物学中参与的细胞成分具有重要意义。在修复过程中，多种类型的细胞会浸润至周围微环境，参与血管化、细胞外基质（ECM）沉积、细胞增殖及组织重构。基于多参数、多重标记物，可识别细胞因子和细胞表型，从而确定研究微环境中各细胞成分的定位、分化状态及其相互作用。本文以肿瘤发育为例，介绍这种多色-多细胞移植模型的典型应用，并结合多光谱成像与光谱解混分析方法进行阐述。

肿瘤进展是一个多步骤过程，其特征是获得多种能力，包括增强的增殖能力、抗凋亡能力、侵袭性以及血管生成特性。⁴ 肿瘤的发展依赖于被招募至其周围环境中的非肿瘤性细胞，这些细胞可提供生长因子、结构基质、血管网络以及免疫调节作用。^1,5,6 这种微环境由来自局部邻近组织（如脂肪组织和血管）以及远端来源（如骨髓来源细胞）的细胞共同构成。¹ 非肿瘤性细胞的整合程度取决于肿瘤的需求，通常与肿瘤的分期/分级相对应。为了理解肿瘤支持性微环境的作用，必须明确这些非肿瘤性细胞群体的来源及其分化潜能。

本方案旨在通过可视化骨髓来源的细胞组分和局部组织来源的细胞，辅助解读肿瘤进展过程。利用表达荧光报告基因的转基因小鼠，我们将表达GFP（绿色荧光蛋白）的骨髓移植到经致死剂量照射的RFP（红色荧光蛋白）小鼠体内。在骨髓成功植入后，将同....

方案

根据机构IACUC方案批准的同基因小鼠骨髓移植（BMT）（注意：本方案的成功实施需要使用任何标记的细胞类型作为多光谱分析的目标；为了便于下游分析，可利用任何遗传性或稳定的细胞标记。我们建议，任何细胞、组织或未来器官均可应用于移植模型，且移植物中可包含研究所需数量的多种独特标记细胞群体。此外，可设计多重标记的细胞系统，例如在转基因小鼠中包含多种谱系限制性荧光标记群体，以消除移植并发症，用于特定病理状态的研究。

1. 在用供体骨髓重建前4小时，以单次9.5 Gy剂量致死性照射BMT受体小鼠。（BMT GFP受体小鼠应为6–10周龄）。
2. 用70%乙醇润湿小鼠皮毛，然后用无菌手术剪剪开并剥离皮毛以暴露后肢。在骶髂关节处切除整个后肢，包括髂嵴。在踝关节上方剪除足部，然后彻底去除骨骼上的所有肌肉、韧带和多余组织。使用23 G针头，以含2%无菌胎牛血清的PBS（PBS-2）冲洗胫骨、腓骨和髂嵴中的骨髓。（BMT RFP供体小鼠应按照机构标准实施安乐死。）
3. 使用解剖刀和镊子将残留骨骼切片并轻轻压碎成碎片，放入50 ml锥形管中，加入含3 μg/ml I型胶原酶的溶液，在37 °C、300 rpm条件下消化1小时。
4. 用PBS-2补满管体积，收集上清液至新管中，并与冲洗所得细胞合并。在4 °C条件下以250 rpm离心5分钟。
5. 将细胞重悬于PBS-2中，经40 nm细胞滤器过滤。此时，若需对BMT中的特定细胞群进行操....

结果

利用多光谱成像技术分析移植于我们转基因BMT小鼠模型中的肿瘤，能够识别出源于骨髓的肿瘤间质组分。移植后三周通过流式细胞术确认了初始BMT结果。图 1）。在确认骨髓移植（BMT）嵌合后，将未标记的卵巢肿瘤正位注射至小鼠体内，初次注射肿瘤6周后切除肿瘤组织并用福尔马林固定。将石蜡包埋的肿瘤组织切片进行切片处理 <8 μm 切片并染色。为每种荧光染料制备相应的单色对照切片，包括一个用于背景自发荧光的对照。 表1 包含用于2至7个参数的潜在物种和荧光染料组合。染色完成后，使用Nuance相机附件和Nuance软件采集图像。通过单色对照切片建立光谱库后（图2A），我们能够分离出多标记卵巢肿瘤切片的图像，这些图像显示了GFP（抗体#1）的表达以及细胞核DAPI和另外两种标记物（抗体#2和抗体#3）的信号。图2B可添加更多标记物 图2C-D 显示了包含六个标记物及细胞核染色的肿瘤切片图像。最后，将所有获取的图像导入InForm（CaliperLS, Hopkinton, M.......

讨论

本文中，我们描述了一种多光谱成像技术的应用，称为MIMicc（多光谱解析多重细胞组成），用于分析肿瘤微环境中来源于骨髓的基质成分。然而，该方法和概念亦可应用于解析构成复杂组织的其他细胞组分，例如在伤口愈合反应或再生组织过程中所观察到的组织。在这些实验中，我们利用转基因小鼠，通过荧光信号区分移植肿瘤微环境中的骨髓来源细胞与宿主来源细胞。然而，该技术同样适用于任何报告基因标记的细胞，尤其适用于可通过免疫组织化学清晰识别的基因标签表达细胞，例如LacZ、葡萄糖醛酸酶、His(6X)-、HA、FLAG标签标记的细胞。 等等。¹¹.

在本模型中，移植小鼠处死后，对肿瘤组织切片进行处理，并使用抗体染色以鉴定细胞来源：来源于RFP+骨髓供体或GFP+宿主组织。在图2中，我们展示了两种标志物与肿瘤微环境中宿主来源的GFP+细胞共表达。然而，在图2D中，我们展示了利用同一系统实现七色染色的潜力。

这些数据展示了利用我们的移植和多光.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
.2 μm 滤膜	Fisher	09-740-35A
10 ml 带锁扣注射器	BD	309604
25 G 针头	Cardinal	BF305122
40 nm 滤膜	BD	352340
50 ml 锥形管	Fisher	1495949A
Alexa Fluor 488-ms1	Invitrogen	A21121
Alexa Fluor 594-Rb	Invitrogen	A21207
Alexa Fluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
盖玻片	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
乙醇	Dharmacon	4004-DV
FBS	Invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
胰岛素针头	BD	329424
马来酸	Acros	100-16-7
湿盒	Evergreen	240-9020-Z10
封片介质	Dako	S3023
指甲硬化剂	Sally Hansen	2103
画圈笔（Pap pen）	Abcam	Ab2601
青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺	Invitrogen	10378016
无菌 PBS	Invitrogen	14040-182
胰蛋白酶	Invitrogen	252000-56
封闭缓冲液 14.51 g 10.95 g9+g250 ml 马来酸 NaCl NaOH 颗粒（调至 pH 7.5） 蒸馏水 *将 0.2% Tween-20 加入 1x 溶液中，配制含 2% BSA/2% FBS 的封闭缓冲液。搅拌并过滤。 抗原修复缓冲液： 1.21 g0.37 g1000 ml（配制 10x 用 100 ml，配制 20x 用 50 ml）0.5 ml Tris-EDTA 缓冲液 (10 mM Tris 碱，1 mM EDTA 溶液，0.05% Tween 20，pH 9.0) Tris 碱 EDTA 蒸馏水 Tween 20 *室温保存 3 个月，或 4 °C 长期保存 2.94 g1000 ml1N0.5 ml 柠檬酸钠缓冲液 (10 mM 柠檬酸钠，0.05% Tween 20，pH 6.0) 三水合柠檬酸三钠 蒸馏水 HCl（调节 pH 至 6.0） Tween 20