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方法文章

应用一种 体外 DNA保护实验以观察Dps蛋白的应激介导特性

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DOI：

10.3791/50390

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2013年5月31日

 ,  , 
1Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology

本文内容

摘要

饥饿细胞DNA结合蛋白（Dps）在应对细菌应激中发挥关键作用。本文讨论了Dps蛋白的纯化方法。 E. coli Dps 及其相关实验方案 体外 通过活性氧物种降解DNA的检测实验，证明Dps对DNA的保护作用。

摘要

氧化应激是有氧生命不可避免的副产物。分子氧对陆地生物的代谢至关重要，但也会参与生物体内许多有害反应。有氧代谢与生命所需的另一种重要化合物铁相结合，足以通过芬顿化学反应产生自由基，并降解细胞组分。在涉及细胞内自由基的各类过程中，DNA降解可能是最具破坏性的，因为DNA修复远非易事。本文所介绍的检测方法提供了一种定量技术，用于测量和可视化分子及酶对自由基介导的DNA损伤的影响。

DNA保护实验是一种简单、快速且稳健的工具，用于 体外 表征蛋白质或化学物质保护特性的方法。该方法通过将DNA暴露于破坏性的氧化反应中，并加入不同浓度的目标化合物，随后利用凝胶电泳可视化检测随化合物浓度变化而产生的DNA损伤减少或增加情况。本文中，我们通过测定饥饿细胞DNA结合蛋白（Dps）的保护特性，演示DNA保护实验的技术流程。Dps是一种迷你铁蛋白，被超过300种细菌用于高效抵御环境应激。本文提供了Dps的纯化方案以及评估其DNA保护作用的优化实验条件。

引言

需氧生物必须持续应对活性氧物种，这些物质可能损伤其DNA以及其他关键的生物大分子。一种对抗氧化损伤毒性的有力工具是饥饿细胞DNA结合蛋白（Dps）。自1992年从饥饿状态的E. coli培养物中发现Dps以来1，已在超过300种细菌和古菌中鉴定出该蛋白2。在静止期，Dps的大量上调使其成为饥饿条件下E. coli中表达量最高的拟核相关蛋白3, 4。此外，研究表明，Dps在多种应激条件下均能维持细菌的存活能力及DNA完整性，这些条件包括营养缺乏、高铁浓度、紫外线照射、热激以及氧化应激5, 6。

在结构上，Dps 自我缔合成由12个单体组成的稳定同源寡聚复合物，组装成一个中空的球形壳体。约4.5 nm宽的内部空腔通过允许小分子通过的孔道与外部溶剂相通7，并能够螯合如铁等矿化的金属离子8。Dps 的保护作用源于其多种生物化学活性，包括非特异性的DNA结合1、亚铁氧化酶活性以及铁储存能力8。

深入研究Dps蛋白有益的生化活性，首先需要对其进行纯化。Dps的纯化过程较为复杂，因为不仅需要将Dps与其他蛋白质分离，还需去除其结合的任何DNA7。我们优化的纯化流程采用了多种常规技术，包括两步离子交换层析和硫酸铵沉淀步骤。由于高浓度的Dps在低盐条件下容易从溶液中析出，因此过程中需要多次缓冲液置换。Dps蛋白纯化完成后，可用于直接测定其亚铁氧化酶活性8、DNA结合化学计量比9以及铁结合机制10的实验分析。纯化的Dps还具有其他潜在应用价值。Dps稳定的中空球形结构已被用作支架，用于在蛋白空腔内储存疏水性颗粒11，甚至可作为反应室合成新型磁性纳米颗粒12。

Dps 抵抗活性氧造成损伤的保护能力可通过 DNA 保护实验进行清晰且直接的验证 13, 14. 在此 体外 步骤，当铁催化H2O2 通过芬顿化学反应引发降解。这些自由基可直接损伤反应体系中存在的DNA，在高浓度条件下甚至能将其完全降解。Dps蛋白的两种关键活性均可能直接抵消芬顿反应产生自由基所造成的影响：Dps通过矿化作用降低催化性铁离子的浓度，并在此过程中消耗可利用的过氧化氢；此外，Dps与DNA结合可能在物理上屏蔽DNA免受自由基损伤，同时将其压缩为体积更小、反应表面积更小的致密结构。这两种特性的结合使得DNA保护实验成为检测Dps保护活性的适宜方法。

DNA保护实验具有较高的通用性，除Dps蛋白的表征外，还可应用于多种其他研究场景。自由基损伤是细胞中常见的应激形式，许多不同的蛋白质和化学物质可用于抵抗此类损伤。该实验的基本原理是利用DNA完整性作为自由基损伤的指标，可与几乎任何产生自由基的反应或抗氧化物质联合使用。已有研究成功应用该方法测定K. paniculata提取物在食品工业中的抗氧化特性15，用于表征尿酸在羟基自由基损伤调控中的作用16，以及深入揭示Fur转录调控蛋白的功能机制17。

尽管该检测方法在已发表的论文中有诸多应用，但我们发现其建立过程中需要进行大量的优化和故障排查，这使得许多研究人员首次建立该方法时面临不必要的繁琐过程。本文所介绍的实验方案旨在消除这一入门障碍。

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方案

1. Dps 蛋白的表达与纯化

获得高纯度的蛋白质是进行DNA保护实验的关键第一步。Dps蛋白的纯化可在4至5天内完成。

  1. 将编码 Dps 蛋白的序列克隆至 pET 载体（如 pET17）中，并转化至一种蛋白酶缺陷型的大肠杆菌（E. coli）菌株（如 BL21(DE3) pLysS）中。
  2. 将转化后的细胞涂布于含有适当抗生素（如步骤 1.1 中示例所用的氨苄青霉素和氯霉素）的 LB（Luria Broth）琼脂平板上，于 37 °C 培养过夜。
  3. 挑取平板上的单菌落接种至 30 ml 含有适当抗生素的 LB 培养基中，于 37 °C 摇床培养过夜，摇速为 200–250 rpm。
  4. 将过夜培养物各取 10 ml 接种至两份 1 L 的含适当抗生素的 LB 培养基中，在 37 °C 摇床培养至 O.D.600 约为 0.6（细胞培养至更高光密度可提高蛋白产量，且不会明显影响最终产物的纯度）。加入 IPTG 至终浓度为 0.3 mM 以诱导 Dps 蛋白表达，并于 37 °C 继续摇床培养 3–4 小时。
  5. 在 6,000 × g 条件下离心 15 分钟收集菌体。每升诱导培养物的菌体沉淀用 7.5 ml DEAE 缓冲液 A（50 mM HEPES-KOH，pH 7.5，100 mM NaCl，0.1 mM EDTA）重悬。如需保存，可用液氮速冻后于 -80 °C 冻存。后续操作可在 4 °C 水浴中解冻样品后继续进行。
  6. 向细胞悬液中加入蛋白酶抑制剂混合物（如 Calbiochem III 型蛋白酶抑制剂，每毫升细胞悬液加入 0.167 μl），以防止过表达的 Dps 蛋白降解。
  7. 使用高压均质器（French press）制备无细胞提取物。若使用连续流动型装置，先用 20 ml DEAE 缓冲液 A 预处理高压均质器，然后在 20 kpsi 压力下裂解样品两次。将裂解液在 4 °C 条件下以 30,000 × g 离心 35 分钟，去除不溶性颗粒，收集上清液。如需保存，可用液氮速冻后于 -80 °C 冻存。
  8. 使用 FPLC 系统，以 DEAE 缓冲液 A 平衡 30 ml DEAE Sepharose CL-6B 层析柱，流速为 1–2 ml/min，背压最大不超过 0.2 MPa。将无细胞提取物上样至层析柱，当 O.D.280 信号开始高于基线时开始收集穿流液。用 DEAE 缓冲液 A 洗脱至 O.D.280 恢复基线水平，持续收集穿流液。Dps 蛋白主要存在于穿流液中，且不含结合的 DNA。随后用 100% 缓冲液 B（50 mM HEPES-KOH，pH 7.5，1 M NaCl，0.1 mM EDTA）洗涤层析柱，该洗脱液含有 Dps-DNA 复合物及其他蛋白，可弃去。
  9. 通过硫酸铵沉淀法去除残留杂质蛋白。测定合并穿流液的总体积，在搅拌条件下于 4 °C 缓慢（10–20 分钟内）加入细颗粒硫酸铵至 62% 饱和度（每毫升溶液加入 390 mg），充分搅拌。加完后继续搅拌 20–30 分钟，确保充分平衡。在此条件下，Dps 保持溶解状态，而杂质蛋白则发生沉淀。
  10. 在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 30 分钟去除沉淀蛋白，保留上清液。
  11. 向每毫升上清液中缓慢加入额外的 227 mg 硫酸铵，使终浓度达到 94% 饱和度，搅拌 20–30 分钟以确保充分平衡。在此高盐浓度下 Dps 发生沉淀，可通过在 4 °C 以 20,000 × g 离心 30 分钟收集沉淀。Dps 存在于沉淀中，上清液可弃去。如需保存，沉淀可于 -80 °C 冻存。
  12. 用重悬缓冲液（50 mM HEPES-KOH，pH 7.5，150 mM NaCl，0.1 mM EDTA）重悬含 Dps 的沉淀，并将样品体积调整至 2.5 ml。
  13. 使用 PD-10 脱盐柱进行缓冲液置换以去除硫酸铵。用 25 ml 重悬缓冲液平衡凝胶柱。将 2.5 ml Dps 样品加至 PD-10 柱顶部，待其完全渗入柱床后弃去穿流液。用 3.5 ml 重悬缓冲液洗脱，收集 Dps 组分。
  14. 将经缓冲液置换的样品在 4 °C 以 16,000 × g 离心 10 分钟，去除不溶性成分，然后用 6–10 ml 稀释缓冲液（50 mM HEPES-KOH，pH 7.5，0.1 mM EDTA）稀释，以确保盐浓度足够低，使 Dps 能够结合 SP Sepharose 层析柱。某些高浓度 Dps 样品在低盐缓冲液中稀释后可能出现浑浊（溶解度降低），但可通过加入少量 5 M NaCl 溶液（额外 10–20 mM）完全重新溶解。
  15. 使用 SP 缓冲液 A（50 mM HEPES-KOH，pH 7.5，50 mM NaCl，0.1 mM EDTA）平衡 30 ml SP Sepharose Fast Flow 层析柱，流速为 1.5–2 ml/min，背压不超过 0.3 MPa。将样品上样至柱中，用 SP 缓冲液 A 洗脱至 O.D.280 恢复基线，弃去穿流液。使用 150 ml 线性梯度（0–100% 缓冲液 B）洗脱，同时收集 2 ml 馏分。Dps 通常在约 50% 缓冲液 B 时以尖锐峰形洗脱，但可能有 ±10% 的波动。
  16. 取洗脱组分进行 15% SDS-PAGE 电泳分析，并用分光光度计测定 O.D.260/O.D.280 比值以检测 DNA 污染。电泳应仅在约 19 kDa 处显示单一蛋白条带，O.D.260/O.D.280 比值通常约为 0.7。合并最纯的 Dps 组分，使用截留分子量为 10K 的离心过滤装置（如 Amicon Ultra 超滤装置）浓缩蛋白并置换至储存缓冲液（50 mM HEPES-KOH，pH 7.5，50 mM NaCl）中。分装纯化的 Dps 蛋白，用液氮速冻后于 -80 °C 保存。

2. DNA 保护实验

该实验包含多个对时间敏感的步骤，必须精确到秒计时，以获得可重复的结果。实验涉及多种试剂和移液操作，因此建议使用移液表格（见表1）来记录各步骤及对应体积。完成整个实验所需的总时间不超过3小时。

  1. 将30 ml水加入一个密封小瓶中；用N₂冲洗水样2 10 分钟（使用两支注射器针头，一支插入液体中，另一支置于液面上方），以去除溶液中的氧气。加入 0.0168 g FeSO4•7H2将O加入水中，配制成2 mM的储备液。密封小瓶，再通入氮气5分钟，然后混匀。溶液必须澄清；若呈现任何黄色迹象，需重新配制铁溶液。
  2. 配制100 mM H2O2 溶液（9.2 M HCl 的 10.87 μl）2O2 加入1 ml水）；置于冰上并用铝箔包裹避光。由于会自发降解，配制后仅可使用约1-2小时。过氧化氢储备液同样易发生分解，适当保存（避光、4 °C）可在一定程度上减缓降解。应定期通过测定O.D.值检查储备液浓度。240 建议使用。
  3. 将纯化的 Dps 样品在室温水浴中快速解冻，随后置于冰上保存。在台式微量离心机中以 4,000 × g 离心 10 秒，以沉淀聚集体。离心后使用分光光度计测定浓度（O.D.2801.547 表示单体 Dps 的浓度为 100 μM。
  4. 使用12倍反应缓冲液（1 M MOPS-KOH pH 7.0，1 M NaCl）将高浓度储存液中的线性DNA稀释至100 ng/μl。使用线性DNA可便于定量，但也可使用质粒DNA。
  5. 将1 μl DNA-缓冲液混合物移液至PCR管中。加入适量水，使反应体系最终体积（不含SDS）达到12 μl，该体积应预先根据移液表计算确定。加入Dps，使其十二聚体终浓度为3 μM。室温孵育15分钟，使Dps与DNA充分结合。
  6. 加入足量的 2 mM FeSO₄4 溶液以达到所需的浓度。一个典型的实验使用从 0 到 1 mM FeSO 的浓度范围4较高浓度会导致更严重的DNA降解，但也可能引起反应体系中三价铁沉淀的形成。迅速加入1 μl的100 mM H2O2 溶液（终浓度为10 mM），室温孵育5分钟，使芬顿介导的降解反应发生。
  7. 加入0.8 μl的20% SDS（十二烷基硫酸钠）。混匀后在85 °C孵育5分钟，以破坏Dps-DNA复合物。SDS可使Dps-DNA复合物失稳，并防止DNA发生非特异性凝胶迁移，从而提高定量的准确性。可选步骤是通过催化降解过氧化氢生成无毒产物来终止反应。但在本方案所述条件下，该步骤并非获得广泛DNA降解所必需。
  8. 冰上孵育1分钟，加入上样染料，上样至琼脂糖凝胶。电泳运行凝胶后，使用溴化乙锭对DNA进行染色。应在电泳结束后进行染色，而非电泳前染色，以防止SDS干扰溴化乙锭在凝胶中的分布。

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结果

本文所述的Dps纯化过程具有很高的可重复性。按照所述方案，以2 L的E. coli培养物为起始材料，通常可获得2.5 ml含有Dps12的蛋白样品，其浓度介于5至12 μM之间。较长的诱导时间（4小时）似乎可进一步降低变异性。蛋白纯度始终高于99%，SDS-PAGE凝胶结果（图1）可证实这一点。DNA污染水平始终可忽略不计，琼脂糖凝胶DNA染色结果及O.D.260/O.D.280比值均能证明该结论。该比值可能存在波动，但从未超过0.9，表明DNA污染水平始终低于5%。

DNA保护实验结果的可重复性在很大程度上取决于操作的准确性。如果所有组分的浓度均被精确测量（尤其是离心后的蛋白质浓度），并且各样本的孵育时间保持一致，则实验结果将始终与图2所示结果相似。若实验条件不够理想，则不同实验之间可能会出现轻微的差异，但总体上仍可观察到随着铁浓度增加，DNA降解程度上升的趋势。通过使用ImageLab等图像处理软件，可对DNA保护实验获得的结果...

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讨论

本文所述的Dps纯化过程非常可靠。纯度 consistently 很高（> 99%）；SDS-PAGE凝胶上未见其他蛋白质形成的可见条带。尽管如此，某些批次的纯化Dps表现出核酸酶活性，表现为在与极高浓度Dps共孵育时出现部分DNA降解。这可能表明存在浓度很低但活性很高的DNase，无法通过纯化步骤完全去除。然而，这种DNA降解仅在通常不用于体外（in vitro）检测的浓度下观察到，因此通常不会造成问题。

本文所介绍的Dps蛋白纯化方案具有多个优点。该蛋白无需进行亲和标签标记，因此不存在影响其功能的可能性。所获得的纯化蛋白不含DNA，因此 体外 涉及DNA结合特性的实验不会受到可能的污染干扰。最后，纯化的Dps几乎不含铁<通过菲罗啉法测定蛋白质空腔内储存的铁含量（每 Dps 十二聚体含 1 个铁原子） 18, 19这一特性使得能够精确控制Dps腔内的装载物质，或直接将中空的Dps复合物用作微反应器，而无需担心干扰问题。

DNA保护实验是快速、可靠地表征Dp...

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

我们感谢 Michela de Martino、Wilfred R. Hagen 和 Kourosh Honarmand Ebrahimi 富有成效的讨论。本工作得到了代尔夫特理工大学启动资金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BL21(DE3)pLysS 感受态细胞PromegaL1195
pET-17b DNAEMD-Millipore69663-3
LB 肉汤粉末Sigma-AldrichL3022
氨苄青霉素钠盐Sigma-AldrichA0166
氯霉素Sigma-AldrichC0378
IPTGSigma-AldrichI6758
HEPESBDH441476L
氢氧化钾Merck105033
氯化钠VWR443824T
EDTASigma-AldrichE9884
蛋白酶抑制剂混合物套装 IIIEMD-Millipore539134
DEAE-SepharoseSigma-AldrichDFF100
硫酸铵Sigma-AldrichA4418
PD-10 脱盐柱GE Healthcare LS17-0851-01
SP-SepharoseSigma-AldrichS1799
Amicon Ultra 离心过滤器（10K 分子量截留）MilliporeUFC901024
七水合硫酸亚铁Sigma-AldrichF8048
过氧化氢溶液Sigma-Aldrich216763
MOPSCalbiochem475898
SDS 溶液Bio-Rad161-0418
溴化乙锭Sigma-AldrichE1510
静态培养箱HettichINE500
摇床培养箱New Brunswick Sc.Inova 44
冷却离心机Beckman CoulterAvanti J-E
台式离心机Eppendorf5424
细胞破碎仪Constant Systems Ltd.TS2/40/AA/AA
FPLC 纯化系统General ElectricAKTA
密封小瓶Cole-ParmerEW-08918-85
注射器针头BD305128
移液器EppendorfZ683779-1EA, Z683795-1EA

参考文献

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