应用一种 体外 DNA保护实验以观察Dps蛋白的应激介导特性

摘要

饥饿细胞DNA结合蛋白（Dps）在应对细菌应激中发挥关键作用。本文讨论了Dps蛋白的纯化方法。 E. coli Dps 及其相关实验方案 体外 通过活性氧物种降解DNA的检测实验，证明Dps对DNA的保护作用。

摘要

氧化应激是有氧生命不可避免的副产物。分子氧对陆地生物的代谢至关重要，但也会参与生物体内许多有害反应。有氧代谢与生命所需的另一种重要化合物铁相结合，足以通过芬顿化学反应产生自由基，并降解细胞组分。在涉及细胞内自由基的各类过程中，DNA降解可能是最具破坏性的，因为DNA修复远非易事。本文所介绍的检测方法提供了一种定量技术，用于测量和可视化分子及酶对自由基介导的DNA损伤的影响。

DNA保护实验是一种简单、快速且稳健的工具，用于 体外 表征蛋白质或化学物质保护特性的方法。该方法通过将DNA暴露于破坏性的氧化反应中，并加入不同浓度的目标化合物，随后利用凝胶电泳可视化检测随化合物浓度变化而产生的DNA损伤减少或增加情况。本文中，我们通过测定饥饿细胞DNA结合蛋白（Dps）的保护特性，演示DNA保护实验的技术流程。Dps是一种迷你铁蛋白，被超过300种细菌用于高效抵御环境应激。本文提供了Dps的纯化方案以及评估其DNA保护作用的优化实验条件。

引言

需氧生物必须持续应对活性氧物种，这些物质可能损伤其DNA以及其他关键的生物大分子。一种对抗氧化损伤毒性的有力工具是饥饿细胞DNA结合蛋白（Dps）。自1992年从饥饿状态的E. coli培养物中发现Dps以来¹，已在超过300种细菌和古菌中鉴定出该蛋白²。在静止期，Dps的大量上调使其成为饥饿条件下E. coli中表达量最高的拟核相关蛋白^{3, 4}。此外，研究表明，Dps在多种应激条件下均能维持细菌的存活能力及DNA完整性，这些条件包括营养缺乏、高铁浓度、紫外线照射、热激以及氧化应激^{5, 6}。

在结构上，Dps 自我缔合成由12个单体组成的稳定同源寡聚复合物，组装成一个中空的球形壳体。约4.5 nm宽的内部空腔通过允许小分子通过的孔道与外部溶剂相通⁷，并能够螯合如铁等矿化的金属离子⁸。Dps 的保护作用源于其多种生物化学活性，包括非特异性的DNA结合¹、亚铁氧化酶活性以及铁储存能力⁸。

深入研究Dps蛋白有益的生化活性，首先需要对其进行纯化。Dps的纯化过程较为复杂，因为不仅需要将Dps与其他蛋白质分离，还需去除其结合的任何DNA⁷。我们优化的纯化流程采用了多种常规技术，包括两步离子交换层....

方案

1. Dps 蛋白的表达与纯化

获得高纯度的蛋白质是进行DNA保护实验的关键第一步。Dps蛋白的纯化可在4至5天内完成。

1. 将编码 Dps 蛋白的序列克隆至 pET 载体（如 pET17）中，并转化至一种蛋白酶缺陷型的大肠杆菌（E. coli）菌株（如 BL21(DE3) pLysS）中。
2. 将转化后的细胞涂布于含有适当抗生素（如步骤 1.1 中示例所用的氨苄青霉素和氯霉素）的 LB（Luria Broth）琼脂平板上，于 37 °C 培养过夜。
3. 挑取平板上的单菌落接种至 30 ml 含有适当抗生素的 LB 培养基中，于 37 °C 摇床培养过夜，摇速为 200–250 rpm。
4. 将过夜培养物各取 10 ml 接种至两份 1 L 的含适当抗生素的 LB 培养基中，在 37 °C 摇床培养至 O.D.₆₀₀ 约为 0.6（细胞培养至更高光密度可提高蛋白产量，且不会明显影响最终产物的纯度）。加入 IPTG 至终浓度为 0.3 mM 以诱导 Dps 蛋白表达，并于 37 °C 继续摇床培养 3–4 小时。
5. 在 6,000 × g 条件下离心 15 分钟收集菌体。每升诱导培养物的菌体沉淀用 7.5 ml DEAE 缓冲液 A（50 mM HEPES-KOH，pH 7.5，100 mM NaCl，0.1 mM EDTA）重悬。如需保存，可用液氮速冻....

结果

本文所述的Dps纯化过程具有很高的可重复性。按照所述方案，以2 L的E. coli培养物为起始材料，通常可获得2.5 ml含有Dps₁₂的蛋白样品，其浓度介于5至12 μM之间。较长的诱导时间（4小时）似乎可进一步降低变异性。蛋白纯度始终高于99%，SDS-PAGE凝胶结果（图1）可证实这一点。DNA污染水平始终可忽略不计，琼脂糖凝胶DNA染色结果及O.D.₂₆₀/O.D.₂₈₀比值均能证明该结论。该比值可能存在波动，但从未超过0.9，表明DNA污染水平始终低于5%。

DNA保护实验结果的可重复性在很大程度上取决于操作的准确性。如果所有组分的浓度均被精确测量（尤其是离心后的蛋白质浓度），并且各样本的孵育时间保持一致，则实验结果将始终与图2所示结果相似。若实验条件不够理想，则不同实验之间可能会出现轻微的差异，但总体上仍可观察到随着铁浓度增加，DNA降解程度上升的趋势。通过使用ImageLab等图像处理软件，可对DNA保护实验获得的结果.......

讨论

本文所述的Dps纯化过程非常可靠。纯度 consistently 很高（> 99%）；SDS-PAGE凝胶上未见其他蛋白质形成的可见条带。尽管如此，某些批次的纯化Dps表现出核酸酶活性，表现为在与极高浓度Dps共孵育时出现部分DNA降解。这可能表明存在浓度很低但活性很高的DNase，无法通过纯化步骤完全去除。然而，这种DNA降解仅在通常不用于体外（in vitro）检测的浓度下观察到，因此通常不会造成问题。

本文所介绍的Dps蛋白纯化方案具有多个优点。该蛋白无需进行亲和标签标记，因此不存在影响其功能的可能性。所获得的纯化蛋白不含DNA，因此 体外 涉及DNA结合特性的实验不会受到可能的污染干扰。最后，纯化的Dps几乎不含铁<通过菲罗啉法测定蛋白质空腔内储存的铁含量（每 Dps 十二聚体含 1 个铁原子） ^{18, 19}这一特性使得能够精确控制Dps腔内的装载物质，或直接将中空的Dps复合物用作微反应器，而无需担心干扰问题。

DNA保护实验是快速、可靠地表征Dp.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BL21(DE3)pLysS 感受态细胞	Promega	L1195
pET-17b DNA	EMD-Millipore	69663-3
LB 肉汤粉末	Sigma-Aldrich	L3022
氨苄青霉素钠盐	Sigma-Aldrich	A0166
氯霉素	Sigma-Aldrich	C0378
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
HEPES	BDH	441476L
氢氧化钾	Merck	105033
氯化钠	VWR	443824T
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
蛋白酶抑制剂混合物套装 III	EMD-Millipore	539134
DEAE-Sepharose	Sigma-Aldrich	DFF100
硫酸铵	Sigma-Aldrich	A4418
PD-10 脱盐柱	GE Healthcare LS	17-0851-01
SP-Sepharose	Sigma-Aldrich	S1799
Amicon Ultra 离心过滤器（10K 分子量截留）	Millipore	UFC901024
七水合硫酸亚铁	Sigma-Aldrich	F8048
过氧化氢溶液	Sigma-Aldrich	216763
MOPS	Calbiochem	475898
SDS 溶液	Bio-Rad	161-0418
溴化乙锭	Sigma-Aldrich	E1510
静态培养箱	Hettich	INE500
摇床培养箱	New Brunswick Sc.	Inova 44
冷却离心机	Beckman Coulter	Avanti J-E
台式离心机	Eppendorf	5424
细胞破碎仪	Constant Systems Ltd.	TS2/40/AA/AA
FPLC 纯化系统	General Electric	AKTA
密封小瓶	Cole-Parmer	EW-08918-85
注射器针头	BD	305128
移液器	Eppendorf	Z683779-1EA, Z683795-1EA