用于钙成像、细胞损伤检测及腺病毒感染的胰腺腺泡细胞制备

摘要

我们介绍一种可重复的小鼠胰腺腺泡细胞制备方法，用于在生理和病理相关刺激下检测腺泡细胞的钙信号及细胞损伤。同时提供了一种对这些细胞进行腺病毒转染的方法。

摘要

胰腺腺泡细胞是外分泌胰腺的主要实质细胞，主要负责将胰酶分泌至胰管中，同时也是胰腺炎起始发生的部位。本文描述了如何从完整的胰腺组织中分离腺泡细胞，并检测细胞内钙信号的方法。此外，还介绍了利用腺病毒载体转染这些细胞的技术，以及在诱导腺泡细胞损伤的条件下， subsequently 测定乳酸脱氢酶泄漏量（细胞损伤标志物）的方法。 体外这些技术为表征腺泡细胞的生理学和病理学提供了强有力的工具。

引言

细胞质钙离子的动态变化对于腺泡细胞的生理和病理事件均至关重要。钙信号在空间和时间上的不同模式被认为是导致这些不同生物学效应的原因。 ¹例如，腺泡细胞的酶和液体分泌与分泌发生区域——顶极局部区域的钙振荡密切相关 ²相比之下，伴随强烈非振荡性钙信号的全局性钙波与导致急性胰腺炎的早期病理事件相关 ^3,4这些包括腺泡内蛋白酶的激活、酶分泌减少以及腺泡细胞损伤。我们的实验室利用分离的胰腺腺泡来研究这些导致疾病的早期病理事件 体内 和 体外 ^5-7. 本文所述方法用于分离原代腺泡细胞，以检测细胞质钙离子水平和细胞损伤。同时提供了一种针对这些细胞的腺病毒感染方法。

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方案

1. 钙成像用胰腺腺泡细胞的制备

1. 配制含有 20 mM HEPES、95 mM NaCl、4.7 mM KCl、0.6 mM MgCl₂、1.3 mM CaCl₂、10 mM 葡萄糖、2 mM 谷氨酰胺和 1 × 最低必需培养基非必需氨基酸的 HEPES 孵育缓冲液。用 NaOH 将最终溶液调节至 pH 7.4。
2. 向 25 ml 上述 HEPES 孵育缓冲液中加入牛血清白蛋白（BSA），使其终浓度为 1%（w/v），配制 BSA 孵育缓冲液。
3. 向 6 ml 上述 BSA 孵育缓冲液中加入 1.1 mg/ml（200 单位/ml）IV 型胶原酶和 1 mg/ml 大豆胰蛋白酶抑制剂，配制胶原酶消化缓冲液。
4. 将 22×22 mm 盖玻片浸入两份 HNO₃ 与一份 HCl 的混合液中酸洗 2 小时，然后用去离子水倾倒清洗，并保存于 70% 乙醇中。
5. 通过 CO₂ 窒息法处死一只小鼠。将动物置于仰卧位，用 70% 乙醇清洁腹部表面。进行剖腹手术以暴露腹腔，解剖取出胰腺，并立即在含有 6 ml 胶原酶消化缓冲液的小称量皿中冲洗。
6. 去除所有大块脂肪组织和可见血管，然后移除 5 ml 胶原酶消化缓冲液并将其加回 15 ml 圆锥形离心管中。
7. 使用精细解剖剪在含有 1 ml 胶原酶消化缓冲液的小称量皿中将胰腺剪碎，直....

结果

在图3中展示了腺泡细胞在生理刺激下钙离子浓度变化的测量示例。腺泡细胞负载了钙离子荧光染料Fluo-4，并灌注乙酰胆碱类似物卡巴胆碱（CCh；1 μM）⁸。细胞产生钙波作为响应，该钙波起始于顶区，并向基底外侧区传播^3,9。图3B中所示的代表性记录曲线显示了使用1 μM卡巴胆碱时常见的峰-平台型响应模式。相反，使用亚最大浓度的胆囊收缩素类似物雨蛙素（10 pM）则产生振荡型钙响应（图4）¹⁰。

在胰腺炎诱导性激动剂作用下，腺泡细胞乳酸脱氢酶（LDH）的泄漏情况如图5所示。本研究显示，在存在雨蛙素（caerulein）、卡巴胆碱（carbachol）或胆汁酸牛磺石胆酸-3-硫酸盐（TLCS）的情况下，LDH的泄漏量呈浓度依赖性增加。诱导LDH最大泄漏所需的浓度与诱导腺泡内蛋白酶活化及病理性钙信号所需的浓度一致，提示这些事件可能导致细胞损伤。

讨论

本文所述的细胞分离方法及后续实验是研究外分泌胰腺生理与病理生理特征的有力工具。分散胰腺腺泡细胞的分离方法最早由 Amsterdam 和 Jamieson 于 1972 年描述¹¹。本文所采用的方法是在 Van Acker 及其同事近期描述的细胞分离技术基础上改进而来¹²。尽管这些技术具有高度可重复性且易于掌握，但每种方法中均存在若干关键步骤，必须精确执行。充分理解这些技术细节将有助于更便捷地排除故障并提升实验效果。

在为钙离子检测准备细胞时，我们发现来自较年轻啮齿类动物的胰腺能获得更一致的结果。腺泡分布更为均匀，可能是因为其中含有的纤维脂肪组织较少。对于 Ca²⁺ 检测，我们制备较小的腺泡，以实现最佳的单细胞成像。这需要比乳酸脱氢酶（LDH）检测更高的胶原酶浓度（1.1 mg/ml 或 200 U/ml）。而对于 LDH 检测，我们制备较大的腺泡，因为该方法在基础状态下造成的损伤更小。因此，其制备过程中使用的胶原酶浓度较低（0.5 mg/ml 或 91 U/ml）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠	美国国家癌症研究所	N/A	雄性，20-30克；几乎任何品系均可获得可比结果。
HEPES	American Bioanalytical	AB00892
氯化钠	J.T. Baker	3624-05
氯化钾	J.T. Baker	3040-01
氯化镁	Sigma	M-8266
氯化钙	Fischer	C79
葡萄糖	J.T. Baker	1916-01
L-谷氨酰胺	Sigma	G-8540
1X 最小必需培养基非必需氨基酸混合液	Gibco	11140-050
氢氧化钠	电子显微镜	SX0593
牛血清白蛋白	Sigma	A7906
胶原酶	沃辛顿	4188
大豆胰蛋白酶抑制剂	Sigma	T-9003
二氧化碳	Matheson Gas	124-38-9
125 ml 锥形塑料烧瓶	Crystalgen	26-0005
解剖工具包	精细科学工具	14161-10
70% 乙醇	LabChem	LC222102
P1000、P100、P10 移液器	Gilson	FA10005P
称量纸	Heathrow Scientific	HS1420A
塑料移液管	USA Scientific	1020-2500
15 ml 离心管	BD Falcon	352095
50 ml 锥形管	BD Falcon	352070
1.5 ml 微量离心管	Fisher	05-408-129
0.65 ml 微型离心管	VWR	20170-293
22 x 22 mm 玻璃盖玻片	Fisher	032811-9
硝酸	Fischer	A483-212
盐酸	Fischer	A142-212
去离子水	N/A	N/A
18 x 18 mm 盖玻片	Fischer	021510-9
实验室用薄膜	Parafilm	PM-996
Fluo-4AM	Invitrogen	F14201
二甲基亚砜	Sigma	D2650
鲁尔锁	Becton Dickinson	932777
60 ml 注射器	BD 生物科学	DG567805
23 ¾ 规格针头	BD 生物科学	9328270
PE50 管	Clay Adam	PE50-427411
平头螺丝刀	N/A	N/A
DMEM/F-12，无酚红	Gibco	21041-025
30.5号针头	BD生物科学	305106
5 CC 注射器	BD 生物科学	309603
25 ml 锥形瓶	Fischer	FB50025
尼龙网滤器	Nitex	03-150/38	150 um 孔径
48孔组织培养板	Costar	3548
96孔组织培养板	Costar	3795
6孔组织培养板	Costar	3506
液氮	Matheson Gas	7727-37-9
细胞毒性检测试剂盒	Promega	G1782
Adeno-GFP	N/A	N/A	J. Williams 惠赠
<强>仪器设备
带夹子的铁架台	联合科学	SET462
灌流室	N/A	N/A	由耶鲁大学的 S.Z.H 及其同事设计
真空管线	Manostat	72-100-000
带振荡器的水浴锅	精准科学	51220076
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM 710
BioTek Synergy H1 酶标仪	BioTek	11-120-534
组织培养罩	Nuaire	NU-425-600
组织培养箱	赛默飞世尔科技	3110