分析有针对性的病毒蛋白的纳米粒子递送HER2 +肿瘤

Summary

本文详细介绍了肿瘤靶向纳米粒子，HerDox光学成像分析的程序。特别是，使用多模成像装置，用于检测肿瘤靶向和评估肿瘤渗透详细描述在这里。

Abstract

HER2 +肿瘤靶向纳米粒子，HerDox，具有肿瘤优惠的积累和消融治疗HER2 +癌症动物模型中肿瘤生长。 HerDox形成通过非共价的肿瘤靶向与化疗剂，多柔比星的细胞渗透蛋白的自组装体，通过一个小的核酸连接器。电，插层，齐聚相互作用的结合，促进成圆形的10-20纳米粒子自组装。 HerDox显示出在不同温度下的血中稳定性，以及在扩展存储。全身给药HerDox在荷瘤小鼠的肿瘤细胞死亡的结果没有检测到不利影响的非肿瘤组织，包括心脏和肝脏（发生明显损坏由无目标的多柔比星）。 HER2海拔细胞中的表达相比，有利于靶向表达人表皮生长因子受体的细胞，因此，显示升高的HER2水平的肿瘤表现出较大的积累HerDox唱较低的水平，无论是在体外和体内 。 原位共焦和频谱分析相结合的荧光强度成像已经让我们在体内肿瘤靶向肿瘤细胞渗透全身给药后HerDox的验证。在这里，我们详细介绍我们的方法，以评估肿瘤靶向全身给药后通过多模成像。

Introduction

肿瘤靶向化疗有可能消除癌细胞不相关的药物相比，在​​较低的剂量，因为可以在其预定的目的地，而不是分发非肿瘤组织蓄积的交付治疗。作为后一种情况下，会稀释药的药效，因此需要较高的剂量是有效的，肿瘤靶向治疗和安全性优于标准的非针对性的治疗。

通过封装在自组装纳米颗粒靶向化疗使药物保持化学改性的共价连接到靶向分子的药物相比。因此联动有可能改变的活性的药物，靶向分子非共价键的组件允许保留药物效力。

我们先前的研究显示，这种新型三分量，复杂的自组装，HerDox，针对HER2 +肿瘤1。通过受体结合的细胞渗透蛋白，HerPBK10，与化疗剂之间的非共价相互作用，形成HerDox，多柔比星（阿霉素），通过一个小的核酸连接器。 HerPBK10结合人类表皮生长因子受体（HER）和，触发受体介导的内吞作用^2-4，而核内体膜的渗透是通过腺病毒衍生的聚氯基地衣壳蛋白^4-6成立。甲带正电荷的蛋白质域使核酸结合^4，5，通过该DNA插霉素可以用于靶向递送运。亲电，插层，并有可能蛋白低聚相互作用促进自组装成圆形10-20nm的颗粒是稳定的血液和根据扩展存储在不同温度下^1。她的优先目标2 +肿瘤细胞是促进增强配体的亲和力，时HER2升高。

Protocol

1。全身交付体内的

1. 用无菌生理盐水足够HerDox的混合等同于0.2毫升0.004毫克/千克的剂量注射HerDox每6-8周的老NU / NU鼠标轴承皮下双边侧翼异种移植肿瘤。
2. 轻轻绘制HerDox的混合物倒入一个3/10毫升配备29G针头的胰岛素注射器，避免气泡。
3. 进行了简短的异氟醚麻醉诱导感应室配备一个气体净化系统（氧气流速:0.5-1升/分钟，异氟醚浓度:3-4％（或更低）。
4. 整个混合物注入到麻醉小鼠的尾静脉中（0.2毫升，每次注射）。内敛的，非麻醉鼠标也可以进行静脉注射。
5. 六年多的连续天重复注射相同的鼠标，每天一次。

2。 在体内荧光成像

积累的HerDox荧光肿瘤注射的最后一天（7天）使用多模成像仪可以探测到。下面的过程中需要使用自定义的宏照明和探测系统（ 图^1）8。

1. 打开模体内光学成像仪 。
2. 选择适合阿霉素荧光检测发射带通滤波器（590纳米±30纳米）。
3. 打开氩气，氪激光，在激光的光路中放置一个激励的带通滤波器（488纳米±10nm的）。
4. 打开麻醉系统上，然后放置到麻醉箱（氧气流速:0.5〜1升/分钟，异氟醚的浓度为3-4％....

Results

图1显示了在体内光学成像样机下图像采集多种方式，包括荧光强度，光谱，寿命，双光子，重要的内焦，生物发光成像的目的，这是建。此外，冷却的高灵敏度的摄像头和纳入在本系统中的高功率激光线会产生更高的对比度比商业光学成像系统^11的荧光图像，特别是用于检测体内阿霉素荧光。因此，该系统是用于在本研究中，获得多个互补的数据点在体内的评估HerDox的关键。

如图2所示的高肿瘤荧光典型全身给药HerDox后，表示其肿瘤优先定位。骨骼肌中检测到的荧光是非典型的，并可能导致来回米在注射过程中的异常（ 即注入太接近身体）。定性地说，在图2a中所示的图像具有低的背景。然而，为了执行组织相对荧光强度进行定量分析，它是要执行背景校正，用一个空盘，如在图2b中所示。这可能会导致在背景校正" 图2c中所示的图像相比，具有更高的背景信号在图像的边缘的原.......

Discussion

阿霉素荧光可以检测到体内时使用多模成像肿瘤皮下。然而，治疗有效剂量的HerDox（0.004毫克/千克）的检测阈值以下后，单次剂量。相比之下，经过7每天注射（7天1x/day），，肿瘤的积累和保留的粒子是足以使阿霉素荧光可视化。

这是至关重要的工作时，与阿霉素在体内成像，使用清洁技术或任何其他荧光。鼠标的外侧上的滴水应避免，因为成像器将检测到皮肤的外侧上，没有鉴别是否霉素是外部的还是内部的荧光。同样，在手套上的阿霉素污染可以离开鼠标以外的荧光标记的动物处理过程中，从而导致错误的荧光检测。

在多模光纤的系统，一个利用激光束激发HerDox的。的激光束通常具有高斯分布。因此，对于利益的标本一致激励，利用光学扩散。然而，扩散激光有所保留了高斯光束轮廓。因此，对于理想的定量分析中，进行背景校正。修正前和背景图像，典型地具有16位深度的。因此，在执行背景校正，图像深度应被转换为32位，以避免不必要的错误，从得到的图像和输入图像之间的差异的图像的深度。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
荧光激光扫描共聚焦显微镜	徕卡	SPE
体内 光学成像仪	光谱分子成像	多模式 体内 光学成像仪
阿霉素-HCl	Sigma-Aldrich	D4035
裸鼠 （NU/NU） 小鼠，雌性，6-8 周	Charles River	菌株代码 088
MDA-MB-435 人 HER2 + 肿瘤细胞	NCI-Frederick 癌症 DCTD 肿瘤/细胞系储存库	0507292
3/10 cc 胰岛素注射器 U-100，带 29G x 1/2" Ultra-FineIV 永久连接针	BD	309301
Delta T 室	Bioptechs	04200417B