本文详细介绍了肿瘤靶向纳米颗粒HerDox的光学成像分析步骤。特别是，本文描述了如何使用多功能成像设备检测肿瘤靶向性以及评估肿瘤穿透能力的具体方法。
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摘要
摘要
HER2+ 肿瘤靶向纳米颗粒 HerDox 在 HER2+ 癌症动物模型中表现出对肿瘤的优先富集及肿瘤生长抑制作用。HerDox 通过肿瘤靶向性细胞穿透蛋白与化疗药物阿霉素经由一小段核酸连接子非共价自组装而成。多种相互作用，包括亲电作用、嵌插作用和寡聚化作用，共同促进其自组装形成直径为 10–20 nm 的球形颗粒。HerDox 在血液中以及在不同温度下的长期储存中均表现出良好的稳定性。在荷瘤小鼠中系统性给予 HerDox 可导致肿瘤细胞死亡，且对非肿瘤组织（包括心脏和肝脏）未见可检测的不良影响（而未靶向的阿霉素则会对这些组织造成明显损伤）。HER2 表达水平升高有助于靶向表达人表皮生长因子受体的细胞，因此，相较于 HER2 低表达的细胞，高表达 HER2 的肿瘤对 HerDox 的富集程度更高 体外 和 体内荧光强度成像结合 原位 共聚焦和光谱分析使我们能够验证 体内 系统给药后 HerDox 的肿瘤靶向性及肿瘤细胞穿透能力。本文详细描述了我们通过多模态成像评估系统给药后肿瘤靶向性的方法。
引言
化疗药物的肿瘤靶向递送有望以较低剂量杀灭癌细胞，相较于非靶向药物，更多的治疗药物可富集于目标部位，而非分布至非肿瘤组织。在后一种情况下，药物疗效会被稀释，因而需要更高剂量才能达到治疗效果。因此，肿瘤靶向递送相比传统的非靶向治疗具有治疗和安全性的双重优势。
通过将化疗药物包封在自组装纳米颗粒中实现靶向递送，可使药物保持化学结构不变，而与靶向分子共价连接的药物则无法做到这一点。由于共价连接可能改变药物和靶向分子的活性，而非共价组装方式则能够保留药物的原有药效。
我们先前已证明，这种新型三组分自组装复合物HerDox可靶向HER2+肿瘤 体内 并在保护正常组织（包括心脏）的同时，诱导肿瘤生长消融 1HerDox 是通过受体结合型穿膜蛋白 HerPBK10 与化疗药物阿霉素（Dox）之间经由一小段核酸连接子通过非共价相互作用形成的。HerPBK10 可结合人表皮生长因子受体（HER），并触发受体介导的内吞作用。 2-4，而内涵体膜穿透则通过整合腺病毒来源的五邻体基底衣壳蛋白实现 4-6蛋白质上的一个带正电荷的区域使其能够结合核酸 4, 5，通过该结构可实现DNA嵌插型阿霉素（Dox）的转运，用于靶向递送。亲电作用、嵌插作用及可能的蛋白质寡聚化相互作用促使自组装形成圆形、直径10–20 nm的纳米颗粒，该颗粒在血液中及不同温度下长期储存时均具有稳定性 1HER2 水平升高时，配体亲和力增强，从而促进对 HER2+ 肿瘤细胞的优先靶向。
我们之前的研究表明，与非靶向的阿霉素（Dox）相比，HerDox 的全身递送在肿瘤组织中的蓄积优于非肿瘤组织 1，以及穿透进入肿瘤细胞 体内 7我们观察到HerDox在进入肿瘤细胞后释放Dox，从而使Dox在细胞核内积累 1肿瘤蓄积量似乎与受体水平相关，HER2表达相对较低的肿瘤对HerDox的蓄积量少于HER2水平相对较高的肿瘤。 1此外，有效细胞死亡浓度与表达不同细胞表面HER2水平的肿瘤细胞系中HER2的表达量呈负相关。 1HerDox 相较于非靶向性阿霉素（Dox）具有更优的治疗效果与安全性，其在肿瘤杀伤作用中所需剂量较非靶向药物低十倍以上，且未观察到对心脏（通过超声心动图和组织学染色检测）或肝脏（通过TUNEL染色检测）组织产生可检测的不良影响，而未靶向的Dox则存在此类不良反应。 1尽管HerPBK10源自病毒衣壳蛋白，但在治疗剂量下未表现出可检测的免疫原性 2然而，针对完整腺病毒的预存抗体虽能识别HerPBK10，却无法阻止其与细胞结合 2.
随时间测量肿瘤体积是评估靶向治疗药物疗效的标准方法，已用于评估 HerDox 的治疗效果。通过以下方法对此方法进行补充： 体内 和 离体 荧光强度成像使我们能够更准确地评估靶向效率 7我们已特别整合 原位 通过多光谱分析阿霉素荧光对切除肿瘤进行共聚焦成像，以验证HerDox不仅在肿瘤部位富集 体内 但可穿透肿瘤细胞，将阿霉素递送至细胞质和细胞核 7光谱分析还使我们能够区分阿霉素荧光与自发荧光 7.
本文更详细地展示了我们在全身给药后对 HerDox 进行 in vivo 评估的方法，尤其是通过多模态成像技术和分析手段来评估靶向性的策略。
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方案
1. 全身递送 在体
- 将足量的 HerDox 与无菌生理盐水混合，配制成每只 6–8 周龄荷瘤裸鼠（NU/NU 小鼠）每次注射 0.2 ml 的剂量，相当于 0.004 mg/kg 的 HerDox，用于皮下双侧 flank 异种移植瘤模型。
- 用装有 29G 针头的 3/10 cc 胰岛素注射器轻柔吸取 HerDox 混悬液，避免产生气泡。
- 通过配备废气清除系统的诱导室以短暂暴露于异氟烷的方式诱导麻醉（氧气流速：0.5–1 L/min，异氟烷浓度：3–4%（或更低））。
- 将全部混合液注射至麻醉小鼠的尾静脉（每次注射 0.2 ml）。也可在固定但未麻醉的小鼠中进行尾静脉注射。
- 在同一小鼠上连续六天每日重复注射一次。
2. 活体荧光成像 In vivo
使用多模态成像仪，在注射的最后一天（第7天）即可检测到Herdox荧光在肿瘤中的积累。以下步骤涉及使用定制的宏观照明与检测系统（图1）8。
- 打开Multimode In vivo Optical Imager。
- 选择适合阿霉素荧光检测的发射带通滤光片（590 nm ± 30 nm）。
- 开启氩-氪激光器，并在激光光路中放置激发带通滤光片（488 nm ± 10 nm）。
- 打开麻醉系统，将小鼠放入麻醉室（氧气流速：0.5–1 L/min，异氟烷浓度：3–4%（或更低）），并配备废气清除系统。
- 当小鼠被麻醉后，将其从麻醉室转移至 Multimode In vivo Optical Imager 的成像室中。
- 将鼻罩罩住小鼠鼻部，并打开气流以在图像采集期间持续给予麻醉（氧气流速：0.5–1 L/min，异氟烷浓度：2–3%（或更低））。
- 使用 5–15 秒的曝光时间采集荧光图像。
- 进行图像分析与处理，包括背景校正或对比度调整。
3. 离体荧光成像 Ex vivo
在最后一次（第7天）注射HerDox后24小时，可对安乐死小鼠的肿瘤及特定器官（包括肝脏、肾脏、脾脏、心脏和骨骼肌）中采集的组织进行HerDox荧光成像。
- 开启Multimode In vivo Optical Imager。
- 选择用于阿霉素荧光检测的发射带通滤光片（580 nm ± 20 nm）。
- 打开氩-氪激光器，并在激光光路中放置激发带通滤光片（488 nm ± 10 nm）。
- 将排列在培养皿中的肿瘤和特定器官放入Multimode In vivo Optical Imager的成像室中。
- 使用5–15秒的曝光时间采集组织的荧光图像。初始荧光图像采集的示例如图2a所示。使用空的培养皿重复相同操作，作为空白背景（图2b）。
- 进行图像分析与处理，包括背景校正或对比度调整。校正后图像的示例如图2c所示，由图2a减去图2b得到。
4. 原位 肿瘤的共聚焦成像
原位 共聚焦成像可实现对 HerDox 在肿瘤细胞水平蓄积的检测与分析。
- 打开 Leica SPE 共聚焦显微镜。
- 选择488 nm激光作为阿霉素的激发光源，并设置发射波长（560-620 nm）用于检测阿霉素荧光。
- 选择40倍或63倍物镜，并在物镜镜头上滴加镜油。
- 从经安乐死的小鼠中分离新鲜肿瘤组织，这些小鼠此前已接受过HerDox和模拟治疗，具体操作如实验步骤所述 2.
- 将肿瘤置于冰上的培养皿中，以防止组织降解，随后将肿瘤转移至Delta T腔室进行共聚焦成像。
- 以共聚焦显微镜沿z轴方向按顺序采集肿瘤在不同焦平面的图像（步长：1 μm，厚度：20 μm）。沿z轴依次采集的图像示例如下所示： 图3，左图.
- 对图像进行最大强度Z投影。显示了Z堆栈图像的最大强度投影。 图3，右侧面板.
- 计算平均荧光强度 最大强度Z-投影图像。 使用 ImageJ 计算整个视野内图像的平均荧光强度。
5. 比值光谱成像与分析
比率光谱成像与分析可区分阿霉素荧光与自发荧光。
- 开启激光扫描荧光共聚焦显微镜。
- 使用 Leica SPE 共聚焦显微镜，在 488 nm 激光激发下，于 510–650 nm 光谱范围内（步长为 10 nm）在指定深度获取经 HerDox 处理与未处理肿瘤的 15 幅图像。
- 配制 100 μM 的阿霉素溶液。
- 对 100 μM 阿霉素溶液进行光谱成像，以获得阿霉素荧光的纯光谱特征（光谱范围：510–650 nm，步长：10 nm）。光谱成像的典型图像采集结果及绘制的荧光光谱图如图 4所示。
- 通过未处理肿瘤的光谱成像获取图像立方体数据（光谱范围：510–650 nm，步长：10 nm），从中提取自体荧光的光谱特征。光谱成像的典型图像采集结果及绘制的荧光光谱图如图 5所示。
- 使用我们开发的程序9生成四个参考光谱特征（纯自体荧光、0.1 阿霉素 + 0.9 自体荧光、0.2 阿霉素 + 0.8 自体荧光、0.3 阿霉素 + 0.7 自体荧光）。显示四个参考光谱特征的典型曲线如图 6所示。
- 利用我们先前开发的程序9，基于参考光谱特征通过欧几里得距离度量法对图像进行光谱分类。
- 使用我们开发的光谱解混程序（ImageJ 插件）7, 10对这些图像进行线性光谱解混，以与比率型光谱成像及分析结果进行比较。通过线性光谱解混将 HerDox 荧光与自体荧光分离的示例如图 7所示。
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结果
图1 显示 体内 光学成像仪原型，该原型机旨在实现多种成像模式下的图像采集，包括荧光强度、光谱、寿命、双光子、活体共聚焦及生物发光成像。此外，该系统集成了制冷型高灵敏度相机和高功率激光光源，相较于商用光学成像系统，可获得对比度更高的荧光图像 11，特别是对于 体内 检测阿霉素荧光。因此，该系统在本研究中至关重要，可用于获取多个互补数据点，以评估 HerDox 体内.
在全身给予 HerDox 后，图 2 中显示的高肿瘤荧光是典型的，表明其具有肿瘤偏好性靶向作用。在骨骼肌中检测到的荧光则不典型，可能是由于注射操作异常所致（例如 注射位置过于靠近身体）。从定性角度看，图 2a 所示图像的背景信号较低。然而，为了对相对组织荧光强度进行定量分析，有必要使用空白培养皿进行背景校正，如 图 2b 所示。这可能导致生成一张“背景校正后”的图像，如 图 2...
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讨论
当肿瘤位于皮下时，使用多模式成像仪可检测到阿霉素（Dox）的荧光信号。in vivo。然而，HerDox的治疗有效剂量（0.004 mg/kg）在单次给药后低于检测阈值。相比之下，连续注射7天（每天1次，共7次）后，纳米颗粒在肿瘤中的蓄积和滞留量足以实现Dox荧光的可视化。
在使用Dox或其他任何荧光染料时，这一点至关重要 在体 成像时应使用无菌技术。应避免小鼠体表出现液滴，因为成像仪会检测到皮肤表面的荧光，而无法区分多柔比星（Dox）是位于体外还是体内。同样，在操作动物过程中，若手套受到Dox污染，可能会在小鼠体表留下荧光痕迹，从而导致错误的荧光信号检测。
在多模态光学系统中，采用激光束激发 HerDox。激光束通常具有高斯光束轮廓。因此，为了实现对目标样本的均匀激发，需使用光学扩散片。然而，经扩散后的激光光仍部分保留高斯光束轮廓。因此，为了实现理想的定量分析，必须进行背景校正。校正前的图像与背景图像通常具有 16 位的深度。因此，在进行背景校正之前，应将图像深度转换为 32 位，以避...
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披露
作者 Daniel Farkas 是 Spectral Molecular Imaging 的主席。其余作者无竞争利益。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助（项目编号：R01CA129822 和 R01CA140995），资助对象为 LKM-K。Medina-Kauwe 博士感谢 C. Rey、M. M-Kauwe 和 D. Revetto 提供的持续支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 荧光激光扫描共聚焦显微镜 | Leica | SPE | |
| 体内光学成像仪 | 光谱分子成像 | 多模态体内光学成像仪 | |
| 盐酸阿霉素 | Sigma-Aldrich | D4035 | |
| 雌性裸鼠（NU/NU），6–8 周龄 | 查尔斯河实验室 | 品系编号 088 | |
| MDA-MB-435 人 HER2+ 肿瘤细胞 | 美国国家癌症研究所-弗雷德里克癌症治疗药物开发部肿瘤/细胞系库 | 0507292 | |
| 3/10 cc 胰岛素注射器 U-100，配 29G × 1/2" 超细 IV 固定针头 | BD | 309301 | |
| Delta T 培养室 | Bioptechs | 04200417B |
参考文献
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