宿主-病原体蛋白质-蛋白质相互作用图谱的比较研究方法

摘要

本文重点介绍利用两种正交方法相结合的策略，鉴定宿主与病原体蛋白质之间高可信度相互作用数据集：酵母双杂交系统，随后进行一种称为高通量哺乳动物细胞相互作用检测（HT-GPCA）的高通量相互作用分析。

摘要

人们已投入大量努力来构建大规模、全面的蛋白质-蛋白质相互作用网络图谱。这对于理解病原体与宿主之间的关系至关重要，早期主要通过酵母双杂交系统中的遗传筛选来实现。近年来，基于Gaussia荧光素酶的片段互补检测技术显著提升了蛋白质-蛋白质相互作用的检测能力，现为发展整合性比较互作组学方法提供了契机，从而能够严格比较不同病原体菌株变体的蛋白质与一组共同细胞因子之间的相互作用谱。

本文重点探讨结合两种正交方法生成蛋白质-蛋白质相互作用数据集的实用性：酵母双杂交（Y2H）和一种新方法——在哺乳动物细胞中进行的高通量Gaussia princeps蛋白质互补分析（HT-GPCA）。

通过基于交配的酵母双杂交筛选，利用多种病原菌株变体对cDNA文库进行大规模鉴定，以识别病原体蛋白的细胞互作伙伴。根据高置信度统计评分选出一部分互作伙伴后，进一步在哺乳动物细胞中使用HT-GPCA技术，针对全套病原体变体蛋白进行成对互作验证。这两种互补方法的结合提高了互作数据集的可靠性，并可实现严格的比较性互作分析。此类比较互作组学研究构成了剖析任何病原体-宿主相互作用的可靠而强大的策略。

引言

为构建蛋白质-蛋白质相互作用图谱而收集的大量数据，为进一步理解病原体感染提供了新的视角。随着对病原体感染的全局性认识逐步形成，研究人员得以了解病原体蛋白在与人类蛋白质组连接时所引发的各种扰动¹。这为理解病原体如何操控宿主细胞机制提供了途径。特别是，多个病毒-宿主相互作用网络的绘制揭示，病毒蛋白倾向于靶向细胞网络中连接度较高的宿主蛋白（即“枢纽”蛋白），或在网络多条通路中处于中心位置的蛋白（即“瓶颈”蛋白）^2-4。这些相互作用使病毒能够操控关键的细胞过程，从而实现自身复制并产生具有感染性的子代病毒。近期，研究人员对相关病毒开展了比较性相互作用图谱研究，旨在提取与致病机制相关的信息⁴。此外，对宿主-病原体相互作用格局的研究已扩展至多种病原体⁵。靶向宿主细胞因子的鉴定有助于揭示病原体感染细胞所采用的策略，并为发现潜在的致病标志物提供线索。

酵母双杂交系统是鉴定二元相互作用最常用的方法，因为遗传筛选是一种高效且灵敏的高通量蛋白质-蛋白质相互作用作图工具。本文提出的方法通过评估多种病原体菌株变体的同一蛋白质，进一步改进了单个酵母双杂交筛选，从而提供病原体-宿主蛋白质相互作用的比较性概览。此外，酵母双杂交筛选的一个主要局限在于假阴性率较高，因其仅能检测到约全部相互作用的20%⁶。这意味着仅在部分病原体变体中检测到的相互作用可能在其他变体中未能被发现。因此，从所有双杂交筛选中获得....

方案

1. 酵母双杂交筛选

1. 配制以下所需溶液
   1. 完全合成缺陷型（SD）培养基：将26.7 g含葡萄糖的最低限度SD基础培养基溶解于1 L水中。加入2 g按如下比例配制的氨基酸混合物：2 g硫酸腺嘌呤半盐、2 g盐酸精氨酸、2 gHistidine HCl、2 g异亮氨酸、4 gLeucine、2 g盐酸赖氨酸、2 g甲硫氨酸、3 g苯丙氨酸、2 g L-丝氨酸、2 g L-苏氨酸、3 gTryptophan、2 g酪氨酸、1.2 g尿嘧啶、9 g缬氨酸。
   2. 选择性缺陷型SD-L/-W/-H培养基：SD培养基中包含所有必需氨基酸，唯独缺少指定的氨基酸（-L：缺亮氨酸；-W：缺色氨酸；-H：缺组氨酸）。
   3. YPGLU培养基：配制1 L时，称取10 g酵母提取物、10 g胰蛋白胨和20 g葡萄糖。若制备固体培养基，则加入25 g琼脂粉。
   4. YCM培养基：成分与YPGLU相同，但pH值调节至4.5。
2. 酵母杂交与涂布
   1. 使用预先转化的Y187酵母菌株（交配型α）的冻存 aliquot，该菌株含有克隆在pACT2载体中的cDNA文库。通过在SD-L平板上进行系列稀释涂布，检测细胞活力。
   2. 将病原体ORF克隆至pGBKT7载体中，并通过标准方法将重组质粒转化....

结果

HT-GPCA 的一个主要优势在于其高灵敏度，这一点通过 图2 中人乳头瘤病毒（HPV）E2 蛋白的假阳性率和假阴性率评估结果得以体现（改编自参考文献13）。为确定假阴性率，使用 HT-GPCA 检测了 HPV16 E2 蛋白的已知相互作用（图2A）。在18个已知相互作用中，有4个未被检测到（对应22%的假阴性率）。通过将12种 HPV E2 蛋白与一组随机的细胞蛋白进行测试，测得假阳性率为5.8%（图2B）。此外，该方法的高特异性在 图2C 中得到进一步体现，结果显示，一个已知会干扰 E2 与其细胞伴侣 BRD4 结合的单点突变完全消除了 NLR 比值（图2C）。

这种大规模比较相互作用组学方法最近已成功应用于人乳头瘤病毒（HPV）的三种早期蛋白：E2、E6 和 E7，这些蛋白来源于代表HPV在嗜性与病理学上自然多样性的不同基因型。 ^13,14对于每种早期蛋白，其相互作用谱的层次聚类在很大.......

讨论

酵母双杂交和哺乳动物相互作用检测方法（如GST下拉、LUMIER或MAPPIT）各自已被证明是检测蛋白质-蛋白质相互作用的有效工具，但这些技术存在较高的假阳性和假阴性相互作用率，因而受到限制¹⁵。此外，越来越多的证据表明，联合使用正交方法可提高所获得相互作用数据集的可靠性⁷。本文所述的高通量GPCA（HT-GPCA）技术的最新发展，不仅提高了在哺乳动物细胞中检测二元蛋白质-蛋白质相互作用的灵敏度，还实现了对大量相互作用的并行处理。

本文所述策略通过检测多种菌株变体的相互作用，提高了单个酵母双杂交筛选的覆盖范围。此外，采用正交检测方法重新验证相互作用，可克服双杂交技术固有的局限性并避免实验假象，从而获得更为严格的比较性相互作用数据集。事实上，由于高通量GPCR阵列（HT-GPCA）在哺乳动物细胞中进行，蛋白质的翻译后修饰和天然亚细胞定位均不受影响。因此，与主要依赖酵母双杂交进行相互作用检测的方法相比，我们的方法能够在一步操作中生成质量更高的相互作用图谱⁴。

尽.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酵母菌株	Clontech
最小SD培养基基础	美国生物	D9500
氨基酸	Sigma
3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）	Acros Organics	264571000
Zymolase	Seikagaku	120491
DMEM	Gibco-Life Technologies	31966
胎牛血清	BioWest	S1810
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco-Life Technologies	14190
青霉素-链霉素	Gibco-Life Technologies	15140
胰蛋白酶-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300
海肾荧光素酶检测	Promega	E2820
白色培养皿	Greiner Bio-One	655083
96孔PCR板	4titude	4t-i0730/C
培养箱（30 °C)	Memmert
培养箱（37 °C)	Heraeus
光度计	贝特霍尔德	Centro XS-LB 960