本实验方案描述了一种高通量比色法，该方法基于碘与淀粉中葡萄糖分子链形成复合物的原理。碘可与直链淀粉以及支链淀粉中的长链部分形成复合物。在向淀粉样品中加入碘后，直链淀粉和支链淀粉的最大吸收峰分别出现在620 nm和550 nm处。通过计算620 nm与550 nm处吸光度值的比值，并与标准曲线（将已知特定浓度对吸光度值作图）进行比较，可估算出直链淀粉与支链淀粉的比例。该方法具有高通量、成本低、可靠且可重复的优点，适用于对大量马铃薯克隆群体进行分析评估。
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摘要
摘要
本实验方案描述了一种高通量比色法，该方法基于碘与淀粉中葡萄糖分子链形成复合物的原理。碘可与直链淀粉以及支链淀粉中的长链部分形成复合物。在向淀粉样品中加入碘后，直链淀粉和支链淀粉的最大吸收峰分别出现在620 nm和550 nm处。通过计算620 nm与550 nm处吸光度值的比值，并与标准曲线（将已知特定浓度与吸光度值作图）进行比较，可估算出直链淀粉与支链淀粉的比例。该方法具有高通量、成本低、可靠且可重复的优点，适用于对大量马铃薯克隆群体进行分析评估。
引言
马铃薯块茎鲜重的约80%为水分；其余几乎所有的干物质均为淀粉1。大部分淀粉（70%）由支链淀粉组成，其余为直链淀粉。直链淀粉与支链淀粉的比例是影响淀粉物理性质的最重要特性。直链淀粉为线性α-1,4-葡萄糖链，而支链淀粉则为具有α-1,6-分支的线性α-1,4-葡萄糖链2。目前已开发出多种用于不同作物种类中淀粉测定的方法，如碘结合法、差示扫描量热法（DSC）、高效尺寸排阻色谱法（HPSEC）以及刀豆蛋白A相互作用法3,4。每种方法均需要特殊技能和设备，难以实现对大量样品的同时定量分析。本文所介绍的方法是对Hovenkamp-Hermelink et al.5提出的方案的改进，该方法基于染色淀粉颗粒的双波长碘结合法。与其它方法相比，该方法的优势包括无需纯化即可从原淀粉中测定直链淀粉含量，以及采用双波长系统以提高测定精度4,6。
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方案
1. 马铃薯块茎淀粉中直链淀粉的测定
- 将新鲜块茎去皮并切成小方块。
- 将土豆块放入小型牛皮纸袋中，并于 -80 °C 条件下过夜保存。
- 将土豆块转移至尼龙袋中，用于冻干。
- 冻干后，使用研钵和研杵或Wiley磨将马铃薯样品研磨成粉末。
- 在50 ml离心管中，加入20–30 mg冻干并研磨的块茎样品。
- 配制45%（w/v）高氯酸溶液（将24.4 ml 60%高氯酸与25.6 ml超纯水混合）。
- 加入500 μl 45%（w/v）高氯酸，振荡或涡旋以分散淀粉颗粒。
- 室温孵育四分钟后，向溶液中加入16 ml超纯水，涡旋混匀。
- 待不溶性物质沉降至管底后（7–10 分钟） 随后，将40 μl溶液转移至微量滴定板中（避免吸入任何颗粒）。
- 加入50 μl碘溶液（2 g KI + 1 g I₂溶于300 ml去离子水）2 在900 ml超纯水中，用移液器混合样品。
- 立即在 550 nm 和 620 nm 处读取吸光度。
- 通过将各样品的直链淀粉/支链淀粉比率（620 nm/550 nm 吸光度）与由不同浓度的直链淀粉和支链淀粉溶液绘制的标准曲线进行比较，确定直链淀粉百分比。该步骤将在下文中详细描述。读取空白对照（碘溶液和高氯酸）以及待测样品的吸光度。分析时使用扣除空白后的数据。
2. 直链淀粉/支链淀粉曲线
- 在不同的离心管中分别称取12.5 mg的直链淀粉和12.5 mg的支链淀粉。
- 向每根离心管中加入5 ml的45% (w/v) 高氯酸，并完全溶解。
- 将上述两种溶液（直链淀粉和支链淀粉）分别用超纯水定容至50 ml。
- 取上一步配制的直链淀粉储备液6.25 ml，加入18.75 ml超纯水混匀，得到浓度为6.25 mg/ml的直链淀粉溶液。
- 对支链淀粉溶液重复相同操作。
- 使用步骤2.4和2.5中制备的直链淀粉和支链淀粉标准溶液，配制含0–100%直链淀粉（对应100–0%支链淀粉）的标准系列，每份定容至5 ml，用于建立每间隔10%的标准曲线。
例如：
配制0%直链淀粉 / 100%支链淀粉标准品：移取5 ml支链淀粉溶液。
配制10%直链淀粉 / 90%支链淀粉标准品：混合0.5 ml直链淀粉溶液与4.5 ml支链淀粉溶液。
配制20%直链淀粉 / 80%支链淀粉标准品：混合1.0 ml直链淀粉溶液与4.0 ml支链淀粉溶液。
配制30%直链淀粉 / 70%支链淀粉标准品：混合1.5 ml直链淀粉溶液与3.5 ml支链淀粉溶液。
配制40%直链淀粉 / 60%支链淀粉标准品：混合2.0 ml直链淀粉溶液与2.0 ml支链淀粉溶液。
配制50%直链淀粉 / 50%支链淀粉标准品：混合2.5 ml直链淀粉溶液与2.5 ml支链淀粉溶液。
配制60%直链淀粉 / 40%支链淀粉标准品：混合3.0 ml直链淀粉溶液与2.0 ml支链淀粉溶液，依此类推。 - 将每种标准混合液各40 μl转移至微孔板中。设一个空白孔，加入40 μl的45% (w/v) 高氯酸。
- 向每个孔中加入50 μl碘溶液（将2 g KI和1 g I2 溶于900 ml超纯水中），并通过移液器吹打混匀各样品（包括空白孔）。
- 立即在550 nm和620 nm波长下测定吸光度，并计算每个浓度下的直链淀粉/支链淀粉比值。
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结果
根据不同直链淀粉/支链淀粉浓度溶液的空白校正数据绘制的标准曲线，显示出吸光度比值大约在0.7至1.6之间（表1）。该数据的线性回归趋势线随后用于推断冻干马铃薯样品中的直链淀粉含量（图1）。
植物生长环境对马铃薯块茎中的直链淀粉含量有一定影响7。在两个不同田间地点进行的重复直链淀粉含量测定显示，马铃薯块茎之间的差异较小（表2）。彩色薯肉马铃薯中的色素似乎不影响直链淀粉测定实验的结果。
| 直链淀粉溶液 %1 | 550 nm 吸光度 | 620 nm 吸光度 | 比值2 620 nm/550 nm |
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讨论
马铃薯块茎中的直链淀粉含量通常在20%-35%之间7,8。如果大多数测定值超出此范围，需考虑以下可能的误差：1）在构建直链淀粉/支链淀粉标准曲线时，使用了未经空白校正的原始数据；2）在测定马铃薯样品的直链淀粉/支链淀粉比例时，使用了未经空白校正的原始数据；或3）分析所用水的纯度不足。我们注意到，若在分析中使用蒸馏水而非超纯水，所得结果无法重复。一个简便的验证碘溶液是否配制正确或是否已过期不可用的方法是：检查空白样品在550 nm处的原始吸光度值是否约为0.1。
碘溶液和支链淀粉/直链淀粉溶液的配制精度对于获得可靠的直链淀粉测定结果至关重要。由于我们测定的是马铃薯淀粉中直链淀粉的比例，而非其确切含量，因此无需像其他测定方法那样对马铃薯粉末进行纯淀粉提取的纯化步骤。
为测定马铃薯品种中的直链淀粉含量，每个品种在每个地点分别处理两个独立的冷冻干燥块茎。我们发现，马铃薯块茎间直链淀粉含量的变异较小（低于一个百分点），且无显著性差异。
在初始马铃薯淀粉用量为2...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本研究的部分经费由美国农业部农业研究局研究协会项目和美国农业部作物种质委员会提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 直链淀粉 | Sigma | 859656 | |
| 支链淀粉 | Sigma | A8515 | |
| 高氯酸 60% | Sigma | 311413 | 对皮肤和眼睛有极高危害 |
| 碘 | Sigma | 23214TD | |
| 碘化钾 | Sigma | 08625JE | |
| 仪器 | |||
| 酶标仪 | Bio Tek | ELx800 |
参考文献
- Composition Hoover, R. molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review. Carbohydr. 45 (3), 253-267 (2001).
- Bertoft, E., Blennow, A. Structure of Potato Starch. Advances in Potato Chemistry and Technology. , 1st ed, Elsevier Ltd. 83-98 (2009).
- Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds. Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).
- Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique. Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).
- Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato. Potato Res. 31, 241-246 (1988).
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Genetics and Physiology of Starch Development. Starch. , 3rd ed, Elsevier Inc. 23-82 (2009).
- Haase, N. U., Plate, J. Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors. Stärke. 48 (5), 167-171 (1996).
- Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules. Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).
- Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A. J. Cereal Sci. 25 (2), 111-119 (1997).
- Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -H. Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A. Starch. 42, 302-305 (1990).
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重印与许可
