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方法文章

通过遗传操作调控小鼠发育期下丘脑 在子宫内 电穿孔

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DOI：

10.3791/50412

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2013年7月24日

 ,  ,  , 
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Heidelberg , 2Institut de recherches cliniques de Montreal

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

尽管下丘脑在功能和医学上具有重要意义， 在子宫内 其发育过程的遗传操作鲜有尝试。本文展示了一种详细的实验流程 在子宫内 电穿孔转染小鼠下丘脑，并展示全脑及部分（区域）下丘脑转染的代表性结果。

摘要

对发育中哺乳动物大脑特定区域进行遗传学改造是一种非常强大的实验方法。然而，培育新的小鼠突变体通常耗时较长且令人困扰。已有研究表明，能够进入发育中小鼠大脑的特定区域 在子宫内 术后生存情况良好是可能的。然而，有关该手术方法的报道几乎仅限于发育中大脑最表层且最容易触及的区域， 即 大脑皮层。丘脑是一个更狭窄且位置更偏内侧的区域，其靶向操作已被证明更为困难。对更深层核团（尤其是下丘脑核团）进行转染极具挑战性，因此相关研究成果极少。本文中，我们展示了一种通过电穿孔技术靶向整个下丘脑神经上皮或其部分区域（下丘脑区域）进行转染的操作流程。本方法的关键在于延长麻醉时间、向第三脑室注射以及选择合适类型并准确定位电极。此外，我们还展示了靶向最深部下丘脑核团——乳头体，并对其进行后续组织学分析的结果。

引言

对小鼠胚胎大脑进行遗传操作是研究发育调控的首选方法。然而，构建突变小鼠品系的过程耗时且昂贵。一种在哺乳动物大脑发育中的神经元内引入特定遗传改变的有力方法是子宫内电穿孔（in utero electroporation）。该技术的基本原理是通过电脉冲将DNA转染至胚胎大脑的神经上皮，随后让胚胎继续存活一段时间，之后收集大脑并检测可能出现的新的、具有信息价值的表型。通过这种方法，实验人员几乎可以立即验证假设，而无需等待漫长的突变小鼠制备周期。

将DNA转染到发育中的胚胎始于鸡胚的in ovo电穿孔技术1。小鼠中的关键概念验证实验最初在体外培养中完成2。随后不久，该技术首次在小鼠体内（in utero）应用的报道相继出现3,4。

主要问题是如何在不杀死胚胎或母体的情况下，对子宫内发育的胚胎大脑进行转染。in utero 所需的手术操作（剖腹手术、注射、电穿孔）需要较长的学习训练周期。一旦掌握手术技术，使胚胎存活率达到可接受水平后，下一个关键问题是：哪些脑区可以被靶向？不出所料，最早发表的关于in utero电穿孔技术的研究成果均集中于皮层发育5-9。目前大多数使用该技术的文献仍以皮层为主要研究对象，因为小鼠发育中大脑最易于进行手术操作的区域就是大脑皮层（图1）。皮层内in utero电穿孔的操作流程已有文字描述10和视频演示11-14。该技术的一种改进版本可用于靶向端脑的腹侧区域——基底神经节15。

除了端脑之外，间脑（传统上分为丘脑和下丘脑）是前脑中较难到达的一个区域。仅有少数论文报道了针对其背侧最易接近部分——丘脑的靶向操作16-19。

下丘脑是前脑最腹侧的部分，因此也是从背侧表面（皮层）位置最深的部分图1）。这一区域对于致力于对小鼠大脑进行遗传操作的研究人员而言，仍然是一个巨大的挑战 在子宫内据我们所知，仅有极少数文章报道了相关结果 在子宫内 转染小鼠下丘脑 20,21然而，下丘脑的功能重要性不容低估，因为它调控着摄食与饮水、交配、繁殖及育幼等行为。22此外，下丘脑发育的改变可能导致成年后出现肥胖、高血压、糖尿病和性早熟等疾病。23在发育过程中能够对下丘脑进行遗传学改造，将为理解其功能提供一种极为强大的工具。

我们在此使用的妊娠小鼠开腹手术基本外科方案与其他方案中所述相似11,13,14,24。为完整起见，我们将在下文简要描述。然而，本操作的关键在于麻醉方式、注射部位、电极类型，以及正极相对于胚胎头部的插入方式和位置。我们倾向于通过气体吸入而非单纯的腹腔注射进行麻醉诱导与维持，因为前者能够满足困难手术所需的较长麻醉时间。异氟烷吸入麻醉可实现更快的苏醒，通常母鼠在术后数分钟内即可恢复正常行为。使用玻璃微量移液管注射DNA溶液时，最方便的注射位点是侧脑室，但该位置完全不适用于下丘脑的电穿孔。直接注入第三脑室对于靶向深部间脑结构至关重要。自E12.0或E12.5起，使用市售的标准电极即可实现下丘脑的转染。我们发现日本千叶市Nepa Gene公司生产的部分电极特别适用于此目的。

通过我们的操作，可实现下丘脑神经上皮的全层转染或根据电极方向决定的部分区域转染。本文通过转染哺乳体—— arguably 所有下丘脑核团中最深且位置最隐匿的核团——来演示该技术。此外，我们还展示了在细胞分辨率水平上对转染细胞进行的详细组织学分析。

A comparison of 在子宫内 电穿孔与其他小鼠发育期脑部转染方法的比较 在子宫内 可在讨论部分找到。

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方案

1. 注射用 DNA 和玻璃微量移液管的制备

  1. 高质量的玻璃微电极对于减少因羊水流失导致的早期高流产率至关重要。拉制玻璃微电极的操作步骤已有详细记录13,18,25。使用直径为1.2 mm的毛细管，在传统的Sutter P-97仪器中按以下参数拉制：P=500；Heat=300；Pull=40；Velocity=50；Time=50。拉制仪应配备3 mm的“槽型”灯丝（Sutter Instrument FT330B）。我们发现使用2 mm尺寸的灯丝所获得的结果不够理想。另一方面，对微电极尖端进行斜面打磨似乎并未改善实验效果。
  2. 将纯化、无内毒素的质粒DNA溶解于含0.1%快绿（Fast Green）的磷酸盐缓冲液（PBS，细胞培养级）中，终浓度为1至2 μg/μl。快绿可使注射液在胚胎脑室中清晰可见。
  3. 将10 μl DNA溶液吸入玻璃微电极中。
  4. 将玻璃微电极连接至注射系统（Pico Pump）或口吸管装置。

2. 麻醉

在手术台上准备好加热垫和手术器械。打开冷光源以方便观察胚胎。使用玻璃珠灭菌器等工具对手术器械进行消毒。

本方案可采用三种不同的麻醉方法（参见讨论部分）。此处我们将描述我们认为最佳的一种方法，即使用异氟烷吸入进行麻醉诱导（流速0.5 L/min）和维持（流速1 L/min）。

  1. 将怀孕的小鼠放入一个小型透明容器中（确保小鼠可见），并通过一段短管将该容器连接至Komesaroff Mark 5麻醉装置。
  2. 向蒸发器中加入异氟烷，然后打开连接在装置上的氧气瓶。向盛有小鼠的容器内吹入一到两次异氟烷/氧气混合气体（0.5 L/min），观察小鼠是否进入麻醉状态。
  3. 取出小鼠，用眼膏覆盖其眼睛以防止干燥，并立即在其头部佩戴气流麻醉面罩。

3. 剖腹手术

  1. 将小鼠仰卧于加热垫上（否则其体温会迅速下降，降低复苏几率），用胶带将其四肢固定于两侧以固定身体。通过检查对反射刺激的反应是否消失来评估麻醉深度例如 脚趾或尾部施加牢固压力的夹捏）
  2. 剃除腹部表面毛发，并使用聚维酮碘（Braunoderm）进行消毒。
  3. 在腹部皮肤上做一个纵向切口（1至1.5 cm长），然后切开腹膜。将棉纱布置于切口周围。使一侧子宫角显露，用钝头镊子小心将其拉出，放置于经PBS冲洗过的纱布上。频繁用PBS冲洗子宫，以保持其始终湿润图2A 和 2B在整个操作过程中，应避免牵拉子宫阔韧带或子宫过紧，因为子宫内的高压会传递至胚胎，增加注射时液体流失的风险，从而导致流产。

4. 脑室 DNA 注射

  1. 以能够观察到脑室的方式持握子宫。不要过度调整位置不利的胚胎——这样做只会增加流产的风险。
  2. 从上方观察胚胎头部，视觉上定位左右大脑皮层半球之间的缝隙或裂隙。这两个半球易于分辨，其内部的侧脑室（不应作为靶点）通常呈现为略深的区域。若发现胚胎方位完全适合进行DNA注射（图2C和2D），可直接刺穿子宫壁并进入第三脑室。将玻璃微量移液管与子宫壁呈45°角，在皮层半球间裂隙的头端穿刺进入约1 mm深度。通过这种方式，玻璃微量移液管的尖端将进入脑部的第三脑室（而非侧脑室）（图2C和2D）。对于方位欠佳的胚胎，可先在胚胎头部附近以45°角刺穿子宫壁，将微量移液管尖端置于皮层半球之间的正确位置，然后再穿刺进入脑组织。向第三脑室内注射约1 μl DNA溶液（成功的注射会使绿色液体充满脑室）。对同一子宫角内的所有胚胎重复相同操作。这有助于DNA溶液与脑室内液体充分混合，并均匀扩散至整个神经上皮。

5. 靶向下丘脑进行电穿孔

  1. 打开电穿孔仪，根据胚胎发育天数调整参数（对于E12.5胚胎，使用5次方波脉冲，50 V，通电50毫秒/间歇950毫秒）。正极使用不锈钢针状电极（CUY550-10），负极使用圆形平板电极（CUY700P4L）。（电极尺寸必须小于胚胎，否则电流将绕过胚胎而无法通过胚胎内部，这一点至关重要。）
  2. 选择背侧朝上的胚胎进行电穿孔即 朝向实验者）（大多数胚胎均为此朝向），剔除朝向不利的胚胎。此时可用经乙醇消毒的手指或戴手套接触子宫。然而，若使用镊子夹持子宫，会影响电穿孔过程中电流的流动。
  3. 用针电极的尖端在胚胎头部位置，于羊膜囊与胎盘之间的子宫壁处向下穿刺。另一只手的食指作为抵住子宫壁的支撑点。此时，电极尖端约有5毫米应位于羊膜囊与子宫壁之间，高度大致与中脑水平相当。图2E 和 2F）。请注意，这是“靶向电极”，因此其位置将决定下丘脑神经上皮的哪个部分最有可能被转染。胚胎需在电极之间非常轻柔地“挤压”。
  4. 另一只手将圆形平板电极置于子宫壁外，与胚胎头部相对的一侧图2E 和 2G).
  5. 使用脚踏开关施加电压（50 V，开启50毫秒，关闭950毫秒，5次方波脉冲）。
  6. 用另一只手的食指固定住子宫，同时缓慢将针电极从子宫中抽出——如果羊水从穿刺处流失，胚胎通常会发生流产。对所有胚胎重复此操作。
  7. 将子宫角放回腹腔，并在另一侧子宫角重复注射和电穿孔操作。

6. 完成手术

  1. 所有胚胎注射并电穿孔后，将子宫非常小心地放回腹腔，保持其原来的位置，并在关闭腹腔前用生理盐水湿润腹膜腔。
  2. 使用外科肠线缝合腹膜（Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914）。皮肤缝合采用“间断缝合”方法，使用更坚固的缝线（Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TO 07171L）。
  3. 用聚维酮碘（Braunoderm）消毒腹部表面，并皮下注射非甾体类抗炎药（e.g. 将Rimadyl溶于0.9% NaCl中，配制成1:10溶液，注射100 μl）或更优选择——阿片类药物如布托啡诺（Temgesic，在0.9% NaCl中按0.05至0.1 mg/kg体重剂量）以缓解疼痛。
  4. 将母鼠从麻醉机中取出，置于由加热垫保温的笼子中。持续监测小鼠，直至其完全从麻醉中恢复。之后每日检查动物，确保其术后恢复良好，无感染或疼痛迹象。

7. 结果分析

  1. 根据所需的分析时间点收集胚胎（或出生后样本）。出生后1至2天的小鼠通过断头法处死。
  2. 根据先前的电穿孔标记分离每个胚胎。在体视显微镜下解剖脑组织，并在显微镜下检查目标区域是否存在绿色荧光信号（来自GFP报告基因）。
  3. 所选脑组织可进行“新鲜”分析：将组织在4%多聚甲醛中短时间固定，包埋于4%琼脂糖或明胶-白蛋白中，然后使用振动切片机进行切片（图3）。如需更详细的免疫组织化学分析（图4），则先将脑组织在30%蔗糖溶液中进行冷冻保护，再包埋于OCT包埋剂（Tissue Tek）中，随后在恒冷切片机中切取20 μm厚的切片。

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结果

根据大鼠的出生日期分析，大多数下丘脑神经元的生成时间在E11.5至E15.2之间，这一时期对应于发育周期相对较短的小鼠胚胎期26，并已转换至小鼠发育时间轴27,28。下丘脑神经发生的高峰期出现在E12.529-31。因此，在本研究选定的转染时间点（E12.5），在任意给定的吻侧-尾侧水平上，均可标记到大量下丘脑神经元。

在 E18.5 时期对较厚的振动切片机切片进行分析（图 3A 和 3B）显示，下丘脑神经上皮的整个头-尾向延伸区域均可被电穿孔标记（图 3A）。在任一特定发育阶段，所有中-侧向水平的神经元均可被标记（图 3B），这与谱系研究结果一致32。乳头体（MBO）是起源于前脑最腹侧且最尾端区域一个隐窝内衬神经上皮的神经元核团。这一位置使得乳头体在原则上极难靶向。功能上，乳头体是记忆巩固的关键结构，其病理性退化可导致顺行性遗忘症33。...

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讨论

关于麻醉：由于 在子宫内 将电穿孔技术应用于下丘脑在技术上可能较为困难，且需要较长的麻醉时间，因此我们更倾向于通过给予氧气与异氟烷混合气体来诱导并维持麻醉。根据我们的经验，动物以这种方式至少可维持适宜的麻醉状态达一小时，母体恢复迅速，且胚胎存活率有所提高。其他麻醉方法也可选用。最简单的方法是通过腹腔注射“三联麻醉剂”来诱导和维持麻醉，剂量为每公斤体重2.5 ml，该混合液包含氯胺酮（25 mg/ml）、赛拉嗪（1.2 mg/ml）和乙酰丙嗪（0.35 mg/ml）溶于0.9%无菌NaCl溶液中。仅使用该混合液并按此处推荐剂量给药时，可诱导约30分钟的麻醉（在某些情况下可达45分钟），这通常已足够满足 在子宫内 在E12.5时期通过侧脑室注射对大脑皮层进行电穿孔。该方法的优势在于完全无需使用麻醉设备及其他辅助装置。然而，若手术时间较长，则不推荐采用此类腹腔麻醉，因为在已麻醉动物体内追加注射以延长麻醉时间常导致动物死亡。也可将腹腔麻醉与吸入麻醉联合使用，即首先注射“三联制剂”（如前所述）以诱导麻醉，随后通过吸入异氟烷/氧气维持麻醉状态。尽管采用此特定方法可按需维持麻醉时间，但孕鼠术后恢复情况不如单独使用吸...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
 <强>试剂
乙酰丙嗪赛诺菲有限公司麻醉剂
异氟烷BaxterHDG9623麻醉剂
氯胺酮Pharma GmbH麻醉剂
快绿Fluka44715 
Rimadyl辉瑞非甾体抗炎
Braunoderm布劳恩3887138聚维酮碘
磷酸盐缓冲液 PBSGibco14190 
丁丙诺啡（Temgesic）Essex Pharma阿片类镇痛药
眼膏泛眼科学7136926 
赛拉嗪拜耳 
 <强>设备
麻醉设备 Komesaroff Mark-5Medical Developments AustraliaACN 004 903 682 
毛细管拉制仪 P-97Sutter Instrument Co.P-97 
CompresstomePrecisionary Instr.VF-300振动切片机类型装置
共聚焦显微镜蔡司LSM700 
冷冻切片机LeicaCM3050S 
电穿孔仪Nepa Gene Co. Ltd.CUY21EDIT 
电极 1Nepa Gene Co. Ltd.CUY550-10不锈钢针电极，10 mm 尖端，0.5 mm 直径
电极 2Nepa Gene Co. Ltd.CUY700P4L直径4 mm圆形铂金盖板
光纤冷光源LeicaKL2500 LCD 
玻璃毛细管哈佛仪器GC120T-151. 外径2 mm × 内径0.94 mm
玻璃珠灭菌器Fine Science ToolsFST250 
加热垫哈佛仪器py872-5272 
注射装置World Precision InstrumentsPneumatic Pico Pump PV820 
涂有缝合线的VicrylEthiconV4914腹膜缝合
缝合线 SupramidSerag WiessnerTO07171L皮肤缝合

参考文献

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