通过遗传操作调控小鼠发育期下丘脑 在子宫内 电穿孔

摘要

尽管下丘脑在功能和医学上具有重要意义， 在子宫内 其发育过程的遗传操作鲜有尝试。本文展示了一种详细的实验流程 在子宫内 电穿孔转染小鼠下丘脑，并展示全脑及部分（区域）下丘脑转染的代表性结果。

摘要

对发育中哺乳动物大脑特定区域进行遗传学改造是一种非常强大的实验方法。然而，培育新的小鼠突变体通常耗时较长且令人困扰。已有研究表明，能够进入发育中小鼠大脑的特定区域 在子宫内 术后生存情况良好是可能的。然而，有关该手术方法的报道几乎仅限于发育中大脑最表层且最容易触及的区域， 即 大脑皮层。丘脑是一个更狭窄且位置更偏内侧的区域，其靶向操作已被证明更为困难。对更深层核团（尤其是下丘脑核团）进行转染极具挑战性，因此相关研究成果极少。本文中，我们展示了一种通过电穿孔技术靶向整个下丘脑神经上皮或其部分区域（下丘脑区域）进行转染的操作流程。本方法的关键在于延长麻醉时间、向第三脑室注射以及选择合适类型并准确定位电极。此外，我们还展示了靶向最深部下丘脑核团——乳头体，并对其进行后续组织学分析的结果。

引言

对小鼠胚胎大脑进行遗传操作是研究发育调控的首选方法。然而，构建突变小鼠品系的过程耗时且昂贵。一种在哺乳动物大脑发育中的神经元内引入特定遗传改变的有力方法是子宫内电穿孔（in utero electroporation）。该技术的基本原理是通过电脉冲将DNA转染至胚胎大脑的神经上皮，随后让胚胎继续存活一段时间，之后收集大脑并检测可能出现的新的、具有信息价值的表型。通过这种方法，实验人员几乎可以立即验证假设，而无需等待漫长的突变小鼠制备周期。

将DNA转染到发育中的胚胎始于鸡胚的in ovo电穿孔技术¹。小鼠中的关键概念验证实验最初在体外培养中完成²。随后不久，该技术首次在小鼠体内（in utero）应用的报道相继出现^3,4。

主要问题是如何在不杀死胚胎或母体的情况下，对子宫内发育的胚胎大脑进行转染。in utero 所需的手术操作（剖腹手术、注射、电穿孔）需要较长的学习训练周期。一旦掌握手术技术，使胚胎存活率达到可接受水平后，下一个关键问题是：哪些脑区可以被靶向？不出所料，最早发表的关于in utero电穿孔技术的研究成果均集中于皮层发育^5-9。目前大多数使用该技术的文献仍以皮层为主要研究对象，因为小鼠发育中大脑最易于进行手术操作的区域就是....

方案

1. 注射用 DNA 和玻璃微量移液管的制备

1. 高质量的玻璃微电极对于减少因羊水流失导致的早期高流产率至关重要。拉制玻璃微电极的操作步骤已有详细记录^13,18,25。使用直径为1.2 mm的毛细管，在传统的Sutter P-97仪器中按以下参数拉制：P=500；Heat=300；Pull=40；Velocity=50；Time=50。拉制仪应配备3 mm的“槽型”灯丝（Sutter Instrument FT330B）。我们发现使用2 mm尺寸的灯丝所获得的结果不够理想。另一方面，对微电极尖端进行斜面打磨似乎并未改善实验效果。
2. 将纯化、无内毒素的质粒DNA溶解于含0.1%快绿（Fast Green）的磷酸盐缓冲液（PBS，细胞培养级）中，终浓度为1至2 μg/μl。快绿可使注射液在胚胎脑室中清晰可见。
3. 将10 μl DNA溶液吸入玻璃微电极中。
4. 将玻璃微电极连接至注射系统（Pico Pump）或口吸管装置。

2. 麻醉

在手术台上准备好加热垫和手术器械。打开冷光源以方便观察胚胎。使用玻璃珠灭菌器等工具对手术器械进行消毒。

本方案可采用三种不同的麻醉方法（参见讨论部分）。此处我们将描述我们认为最佳的一种方法，即使用异氟烷吸入进行麻醉诱导（流速0.5 L/m....

结果

根据大鼠的出生日期分析，大多数下丘脑神经元的生成时间在E11.5至E15.2之间，这一时期对应于发育周期相对较短的小鼠胚胎期²⁶，并已转换至小鼠发育时间轴^27,28。下丘脑神经发生的高峰期出现在E12.5^29-31。因此，在本研究选定的转染时间点（E12.5），在任意给定的吻侧-尾侧水平上，均可标记到大量下丘脑神经元。

在 E18.5 时期对较厚的振动切片机切片进行分析（图 3A 和 3B）显示，下丘脑神经上皮的整个头-尾向延伸区域均可被电穿孔标记（图 3A）。在任一特定发育阶段，所有中-侧向水平的神经元均可被标记（图 3B），这与谱系研究结果一致³²。乳头体（MBO）是起源于前脑最腹侧且最尾端区域一个隐窝内衬神经上皮的神经元核团。这一位置使得乳头体在原则上极难靶向。功能上，乳头体是记忆巩固的关键结构，其病理性退化可导致顺行性遗忘症³³。.......

讨论

关于麻醉：由于 在子宫内 将电穿孔技术应用于下丘脑在技术上可能较为困难，且需要较长的麻醉时间，因此我们更倾向于通过给予氧气与异氟烷混合气体来诱导并维持麻醉。根据我们的经验，动物以这种方式至少可维持适宜的麻醉状态达一小时，母体恢复迅速，且胚胎存活率有所提高。其他麻醉方法也可选用。最简单的方法是通过腹腔注射“三联麻醉剂”来诱导和维持麻醉，剂量为每公斤体重2.5 ml，该混合液包含氯胺酮（25 mg/ml）、赛拉嗪（1.2 mg/ml）和乙酰丙嗪（0.35 mg/ml）溶于0.9%无菌NaCl溶液中。仅使用该混合液并按此处推荐剂量给药时，可诱导约30分钟的麻醉（在某些情况下可达45分钟），这通常已足够满足 在子宫内 在E12.5时期通过侧脑室注射对大脑皮层进行电穿孔。该方法的优势在于完全无需使用麻醉设备及其他辅助装置。然而，若手术时间较长，则不推荐采用此类腹腔麻醉，因为在已麻醉动物体内追加注射以延长麻醉时间常导致动物死亡。也可将腹腔麻醉与吸入麻醉联合使用，即首先注射“三联制剂”（如前所述）以诱导麻醉，随后通过吸入异氟烷/氧气维持麻醉状态。尽管采用此特定方法可按需维持麻醉时间，但孕鼠术后恢复情况不如单独使用吸.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
			<强>试剂
乙酰丙嗪	赛诺菲有限公司		麻醉剂
异氟烷	Baxter	HDG9623	麻醉剂
氯胺酮	Pharma GmbH		麻醉剂
快绿	Fluka	44715
Rimadyl	辉瑞		非甾体抗炎
Braunoderm	布劳恩	3887138	聚维酮碘
磷酸盐缓冲液 PBS	Gibco	14190
丁丙诺啡（Temgesic）	Essex Pharma		阿片类镇痛药
眼膏	泛眼科学	7136926
赛拉嗪	拜耳
			<强>设备
麻醉设备 Komesaroff Mark-5	Medical Developments Australia	ACN 004 903 682
毛细管拉制仪 P-97	Sutter Instrument Co.	P-97
Compresstome	Precisionary Instr.	VF-300	振动切片机类型装置
共聚焦显微镜	蔡司	LSM700
冷冻切片机	Leica	CM3050S
电穿孔仪	Nepa Gene Co. Ltd.	CUY21EDIT
电极 1	Nepa Gene Co. Ltd.	CUY550-10	不锈钢针电极，10 mm 尖端，0.5 mm 直径
电极 2	Nepa Gene Co. Ltd.	CUY700P4L	直径4 mm圆形铂金盖板
光纤冷光源	Leica	KL2500 LCD
玻璃毛细管	哈佛仪器	GC120T-15	1. 外径2 mm × 内径0.94 mm
玻璃珠灭菌器	Fine Science Tools	FST250
加热垫	哈佛仪器	py872-5272
注射装置	World Precision Instruments	Pneumatic Pico Pump PV820
涂有缝合线的Vicryl	Ethicon	V4914	腹膜缝合
缝合线 Supramid	Serag Wiessner	TO07171L	皮肤缝合