方法文章

利用吗啉代寡核苷酸脑室微量注射技术对成年斑马鱼大脑进行基因表达的微操作

DOI：

10.3791/50415

⸱

2013年5月23日

 ,  ,  , 
1DFG-Center for Regenerative Therapies Dresden, Cluster of Excellence (CRTD) and Biotechnology Center (BIOTEC) of the Technische Universität Dresden

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种利用反义吗啉环寡核苷酸在成年斑马鱼端脑室管膜细胞中调控基因表达的方法。我们提出该方法是一种高效且快速的实验方案，可用于成年脊椎动物脑部的功能研究。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

组织中基因表达的操控是开展功能研究的必要手段。本文中，我们展示了脑室微注射（cerebroventricular microinjection, CVMI）技术作为一种在成年斑马鱼脑中调控基因表达的方法。通过CVMI，物质可被注入脑室液中，并沿脑的头尾轴广泛分布。我们特别聚焦于反义吗啉代寡核苷酸（antisense morpholino oligonucleotides）的应用，这类分子是高效敲低基因表达的有力工具 体内在本方法中，当施用时，吗啉寡核苷酸分子会被脑室表面衬里细胞摄取。这些细胞包括作为成神经祖细胞的放射状胶质细胞。因此，敲低放射状胶质细胞中的基因表达对于分析斑马鱼广泛的神经发生反应至关重要，同时也将有助于理解脊椎动物如何维持成体神经发生反应。此类认识还将推动针对人类神经退行性疾病及中枢神经系统再生的临床应用研究。因此，我们提出脑室微注射法（CVMI）作为一种快速高效调控成年斑马鱼前脑基因表达和神经发生反应的方法。同时，我们还提供了有关实施CVMI操作的故障排除建议及其他实用信息。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

成年神经发生是脊椎动物的共同特征，但其普遍程度和效率随系统发育而异1,2,3,4,5,6。例如，成年哺乳动物的大脑中，干细胞区域主要局限于前脑7,8，而硬骨鱼类中的斑马鱼在整个大脑中则具有十六个不同的干细胞结构域及相关的神经发生区4,5,9,10。哺乳动物与斑马鱼之间的这种差异可能反映了干细胞维持机制以及前体细胞神经发生能力的不同。斑马鱼终生具备在大脑中产生神经元的能力，这一特性也可能具有临床意义，因为斑马鱼大脑所采用的分子机制有望被用于开发治疗人类神经退行性疾病的疗法。

已对成年斑马鱼大脑的多个干细胞区域进行了分析，结果表明，这些区域室管膜表面的细胞具有祖细胞功能9,11-20。例如，对斑马鱼端脑的详细分析发现，构成该脑区室管膜表面的放射状胶质细胞是具有神经发生能力的祖细胞19, 20。这一现象同样存在于其他脑区，如小脑和视顶盖，其中位于脑室表面的神经上皮细胞提供了神经发生的来源16,21。因此，要理解成年斑马鱼大脑中广泛存在的神经发生潜能所依赖的分子机制，就需要对祖细胞中的基因表达进行调控。

既往已有多种方法被用于调控斑马鱼的基因功能，包括构建可诱导的转基因品系以表达特定蛋白的变异体，以及基于质粒的局部注射联合电穿孔或化学处理等技术。我们此前设计了一种通过脑室微注射将多种物质（包括吗啉寡核苷酸或蛋白质）递送至成年斑马鱼脑内的方法，该方法可快速高效地调控成年斑马鱼前脑室管膜细胞中的基因功能22。在我们的研究中，采用了体内吗啉寡核苷酸（vivo morpholinos），因其化学结构中吗啉环分子共价连接富含精氨酸的递送肽，可在无需额外通透化处理（如电穿孔）的情况下实现向目标细胞的高效递送23。这使得注射后能够对目标组织实现充分靶向，正如我们在成年斑马鱼端脑中所观察到的结果22。因此，与现有的组织靶向方法（如电穿孔或DNA分子的局部注射）相比，体内吗啉寡核苷酸的使用具有明显优势。

本文以可视化方式演示了该操作的具体实施步骤，并提供了详细的分步实验方案。我们首先介绍注射混合物的制备以及待注射鱼类的准备，随后展示注射装置的组装过程。文中详细描述了脑室注射方法，包括在颅骨上制造切口，并使用微量注射器将吗啉寡核苷酸（morpholinos）注入脑室。此外，我们还阐述了整个操作过程中需要特别注意的关键环节，并以优化建议或故障排除指南的形式进行了说明。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 注射混合物的制备

  1. 使用体内型吗啉寡聚体（vivo morpholinos），因为细胞对其的摄取效率高于普通吗啉寡聚体分子。详情请参见生产商提供的说明表1： 试剂和材料
  2. 使用荧光示踪染料（例如 使用CellTracker Red CMTPX（Invitrogen）以观察注射的准确性。该染料被细胞摄取后可在细胞内代谢，仅在细胞内产生荧光。因此，此步骤对于确定脑室微量注射有效靶向的细胞至关重要。
  3. 制备磷酸盐缓冲液（PBS）（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4，pH：7.4）稀释吗啉代溶液。如果需要稀释吗啉代溶液，务必使用PBS。
  4. 通过加入9 μl吗啉代寡核苷酸溶液和1 μl细胞示踪染料（可稀释或不稀释）配制10 μl注射混合液。吗啉代寡核苷酸溶液的储存浓度为500 μM。我们之前的结果 22 表明不同浓度的吗啉代寡核苷酸（范围从50 μM到500 μM）会导致不同程度的基因敲降，从高效的基因敲降至低效型表型。每1 μl溶液足以注射一只斑马鱼的大脑。
  5. 充分混匀，室温保存至注射前。

2. 注射装置的准备

  1. 使用拉针仪制备玻璃注射毛细管。参数设置如下：加热循环值：463，拉制循环值：230，速度：1.5 秒，时间：75 毫秒。
  2. 打开压力源，并将压力调节至 50 psi 或 3.5 bar。
  3. 调节显微注射仪的参数如下：维持压力 20 psi，喷射压力 10 psi，周期值为 2.5，门控范围为 100 毫秒。
  4. 打开环形照明器，并将其定位在显微镜载物台上方。
  5. 将毛细管夹持器放置在显微镜旁合适的位置。
  6. 将玻璃毛细管插入夹持器中，并调节注射角度至 45 度。
  7. 使用尖端精细的镊子折断玻璃毛细管的尖端，并校准喷口处的压力输出。校准方法是将针尖浸入鱼水中并施加持续的压力脉冲进行测试。产生的气泡应仅为单排，表明压力与喷口尺寸处于最佳状态。校准操作的演示请参见视频。
  8. 将注射溶液装入玻璃毛细管中，避免混入气泡。
  9. 施加压力，以排除玻璃毛细管尖端与所加载注射溶液之间的空气。

3. 麻醉

  1. 制备麻醉剂的储备液（0.1% MESAB - 乙基-m-氨基苯甲酸甲磺酸盐）。
  2. 将所需数量的鱼从养殖缸中取出，放入塑料小鼠笼或其他运输容器中，容器中需含有足量的水。
  3. 在小型塑料盒中，将200 ml鱼用水平衡液与5 ml麻醉剂储备液混合，配制麻醉工作液。麻醉剂的终浓度为0.0025%（v/v）。
  4. 用麻醉液半充满一个塑料培养皿。此培养皿用于后续注射操作。
  5. 将鱼置于麻醉液中孵育，直至鱼体活动完全抑制。

4. 切口与脑室微量注射

  1. 使用鱼网将鱼从盒子中取出，并放入培养皿中。
  2. 用镊子轻轻夹住鱼，使头部略微向下倾斜，以便于进行切口。
  3. 使用30号带倒钩针头在颅骨上制造一个小切口。仅使用针尖，且刺入深度不宜过深，以免损伤脑组织并引起出血。
  4. 持续固定鱼体，并将玻璃毛细管尖端通过切口处插入。
  5. 将玻璃毛细管尖端对准端脑方向。避免接触脑组织，以防造成组织损伤并影响注射溶液的扩散。
  6. 注射溶液。液体在注射后会立即扩散。

5. 注射准确性的回收与分析

  1. 将鱼从注射装置中取出，放入装有新鲜鱼水的塑料盒中。
  2. 允许恢复。
  3. 用0.0025% MESAB短暂重新麻醉斑马鱼，并在荧光显微镜下检查。若观察到红色荧光广泛弥散，表明注射液体已广泛分布。
  4. 将鱼放回塑料盒中。
  5. 将塑料箱连接至循环系统，以对鱼类进行供氧并维持较长时间的存活。
  6. 根据实验需求，可将鱼类用于行为学分析，或在注射后的预定时间点处死动物以制备组织样本，用于后续分析（如组织学染色、免疫组织化学）。 等等。）。以下参考文献提供了分析成年斑马鱼大脑的方法示例： 9,11,17-20,24-27在我们的研究中，观察到有效基因敲低（敲低效率超过50%）的最短时间为12小时。 22.

6. 建议的科学对照

  1. 使用一种不应引起任何表型的错配吗啉代寡核苷酸作为阴性对照。可采用标准吗啉代分子，或为每个目的基因专门设计吗啉代对照。此外，使用溶剂（本实验中为PBS）作为另一阴性对照，以评估错配/对照吗啉代注射可能带来的非特异性效应或毒性。
  2. 使用先前报道的PCNA吗啉代寡核苷酸作为阳性对照22。该吗啉代在成年斑马鱼脑中可实现高效敲低（注射后1天内敲低效率达75–95%）22。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脑室微注射可导致注射溶液广泛分布

根据图1所示的脑室微量注射工作流程与技术方案，我们将吗啉寡核苷酸注入成年斑马鱼脑内。准确的注射操作可使注入液体在全脑范围内弥散，并有效靶向脑室表面附近的细胞（图2A）。若玻璃毛细管刺穿脑组织，则在注射位点处会出现密集的荧光信号（图2B）。若注射量不足，则仅能观察到微弱的荧光信号（图2C）。

脑室微注射可用于敲低成年斑马鱼脑部室管膜区域的基因表达

我们已证明，活体吗啉寡聚物（vivo morpholinos）能够穿透心室表面数个细胞直径的深度，因此可有效靶向心室区细胞（图3A、3B）。通过注射吗啉寡聚物可实现基因表达的敲低，因其可抑制相应蛋白质的生成（例如PCNA，如图3C、3D所示）。我们先前已证实，利用该技术进行基因敲低可在成年神经发生过程（图3E、3F）或再生反应中引发功能性后果（图3G、3H）。我们证明，吗啉寡聚物注射后约12小时可达到有效的敲低水平（敲低效率超过50%）22。此外，我们观察到PCNA蛋白的有效敲低状态可持续至注射后约5天22，且在注射后3天内仍可观察到超过70%的敲低效率22。敲低曲线依赖于内源性蛋白的表达水平以及吗啉寡聚物分子的效率，因此每个基因的敲低动力学需由实验人员自行确定。在我们的研究中，未观察到CVMI操作影响动物的存活率，这可能是因为吗啉寡聚物的递送为局部给药，不会引起系统性毒性。

鱼类脑解剖示意图及解剖过程；端脑、嗅球、视顶盖。
图1. 脑室注射技术的示意图。(A) 注射操作从成年斑马鱼背侧（1）在视顶盖（ot，2）水平进行。使用30号针头在视顶盖颅骨板上做一切口（3）。通过玻璃毛细管将吗啉寡核苷酸分子注入脑室液中（4）。注射后可立即实现充分弥散（5）。(B) 高倍放大显示套管及其带倒钩的末端。(C) 切口前针头的方向。(D) 切口位置以虚线圈出并标示。(E) 注射毛细管按图示定位并进行注射。所有图示均改编自参考文献22。 点击此处查看大图。

显示生物样本中红色发射区域的荧光显微镜结果，标记为 A-C。
图 2. 注射效率与准确性的比较。 （A）良好的注射可使细胞靶向靠近脑室表面的区域。（B）若玻璃毛细管插入脑组织内部，则会产生位于中央的荧光信号。（C）若注射量较低，则会导致荧光信号减弱。

细胞增殖分析；GFP、PCNA荧光显微镜图像；对照组与实验组；图表。
图3. Morpholino的穿透性、基因敲低效率及其功能影响。（A）注射对照Morpholino的Tg(H2A:GFP)转基因系端脑横切面的GFP免疫染色，显示GFP阳性细胞核。（B）注射gfp反义Morpholino的Tg(H2A:GFP)转基因系端脑横切面的GFP免疫染色，显示GFP阳性细胞核。注意脑室区域GFP信号的差异。v：脑室。（C）注射对照Morpholino的脑组织中PCNA免疫染色，显示PCNA阳性细胞广泛分布。（D）注射pcna反义Morpholino的脑组织中PCNA免疫染色，显示PCNA阳性细胞数量显著减少，表明CVMI可有效敲低内源性基因。（E）注射对照Morpholino的脑组织进行BrdU与HuC/D免疫染色，以在先前描述的BrdU脉冲-追踪实验22后确定新生神经元。（F）注射pcna反义Morpholino的脑组织进行BrdU与HuC/D免疫染色，以在先前描述的BrdU脉冲-追踪实验22后确定新生神经元。（G）敲低PCNA导致新生神经元生成显著减少，表明CVMI可用于敲低内源性基因，并产生相应的功能影响。所有图示均改编自参考文献22 点击此处查看大图。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文所述方法可实现向成年斑马鱼脑部快速、简便地注射吗啉代寡核苷酸。我们已证明，该注射方法可有效阻断室管膜细胞中的基因表达，并对神经发生反应产生相应的功能影响。

在执行脑室微注射时，有一些重要事项需要特别注意。例如，吗啉寡核苷酸分子的效果取决于所使用的浓度，该浓度需由最终使用者自行确定。我们建议从储存液（500 μM）开始，进行系列稀释，并最好通过标准胚胎注射方案28-30预先在胚胎中进行注射测试。此前，我们使用50 μM至500 μM不同浓度的吗啉寡核苷酸，获得了不同程度的基因敲低效率22。第二，玻璃毛细管的开口不宜过大，否则会导致注射后大量液体涌入脑组织；同样，开口也不宜过窄，否则将影响注射的顺利进行。可通过向盛水的培养皿中泵入空气来确定最佳的开口-压力组合：产生的气泡应呈单列排出，而非多列，视频中对此进行了演示。第三，将鱼类置于麻醉剂中孵育的步骤至关重要，鱼类在麻醉剂中的时间不应超过2分钟，否则会影响注射后的恢复率。第四，切口位置对于注射液体的充分扩散至关重要。视顶盖上方的脑室区域在中线处较宽，向侧方逐渐变窄。因此，实验者应在靠近中线处、端脑区域颅骨板后方稍偏的位置，在颅骨上制作切口。

脑室注射（CVMI）方法的优点之一是操作快速。CVMI是一种快速检测基因功能的方法。与通常需要数月时间才能建立的转基因品系进行功能研究相比，这一特点显得尤为重要和实用。此外，与局部注射或电穿孔相比，CVMI可实现注入液体的均匀分布，从而相对全面地调控基因活性。通过CVMI，可通过配制含有多种吗啉代寡核苷酸的注射混合物，同时敲低多个基因。CVMI还可用于注射不同浓度的特定吗啉代寡核苷酸，因此可用于分析基因功能部分缺失的表型。最后，这种注射模式不会引起毒性，也不会影响动物的存活。

CVMI 技术可拓展应用于其他类型的研究，例如注射调控性肽段、药物、质粒 DNA 或调控性 RNA 分子，以及其他可能影响细胞生理状态的物质。利用本方法可检测多种分子的组合效应，并进行剂量反应分析，从而研究功能部分缺失的表型。凭借这些特性，CVMI 成为成年斑马鱼脑组织中基因表达研究的一种快速且简便的检测手段，并为快速筛选和功能分析提供了可能。

成年斑马鱼的大脑能够沿着整个头尾轴持续产生新的神经元，并且在遭受创伤性损伤后还能够再生。这与哺乳动物大脑形成鲜明对比，后者神经发生能力有限，即使存在，再生能力也相当差。这种广泛的干细胞活性和恢复能力使斑马鱼成为研究中枢神经系统再生所需分子程序的有用模式生物，而这些分子程序目前在很大程度上仍不清楚。因此，探究斑马鱼大脑再生能力的分子基础是一个富有意义的研究领域，可能揭示鱼类与哺乳动物大脑在损伤后反应的根本差异，并为人类再生医学治疗提供新的途径。为了理解脊椎动物大脑可塑性与再生的分子基础，胶质细胞是一个重要的研究方向，因为它们是神经发生的前体细胞3,8,20。因此，利用CVMI技术改变斑马鱼大脑中放射状胶质细胞的基因功能，对于阐明鱼类大脑如何将前体细胞活性与高效的成年神经发生及再生反应相耦合具有关键作用。我们最近已证明多个因子和信号通路在成年斑马鱼大脑再生性神经发生反应中的参与和必要性24,26,27，而这些研究的实现得益于CVMI方法的应用。总体而言，我们从斑马鱼大脑研究中获得的知识有望被用于赋予哺乳动物中对损伤产生反应的胶质细胞以再生能力，从而有助于设计针对人类神经系统疾病和急性损伤的临床治疗策略。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gene Tools, LLC 为本文额外赞助了开放获取出版费用。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由德国研究基金会（SFB 655）和欧盟（Zf-Health）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂/材料
CellTracker Red CMTPXLife Technologies, InvitrogenC34552以1:100稀释度使用，用于测量注射准确性
MESAB（乙基-间-氨基苯甲酸甲磺酸盐）Sigma-AldrichA5040用于鱼类麻醉
培养皿Sarstedt821,472用于注射和成像过程中操作鱼类
磷酸盐缓冲液Life Technologies, GIBCO10010-056作为无菌稀释介质
Vivo morpholinosGene Tools Inc.Customized有关Vivo morpholinos的更多信息，请访问：www.gene-tools.com
设备
带倒钩针头Becton-Dickinson305178用于在颅骨上制造切口
解剖显微镜Olympus, Leica, Zeiss因制造商而异整个注射装置的组成部分
Dumont镊子World Precision Instruments501985用于折断玻璃毛细管的尖端
荧光相机Zeiss, Nikon, Leica因制造商而异用于注射后观察荧光信号
Gillies解剖镊World Precision Instruments501265用于固定鱼类位置
玻璃注射毛细管World Precision InstrumentsTWF10用于显微注射
PicoNozzle套件（显微注射器固定装置）World Precision Instruments5430-12用于显微注射
气动PicoPump（显微注射器）World Precision InstrumentsSYS-PV820用于显微注射
环形照明器；环形导光管Parkland ScientificILL-RLG用于样本照明

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stocum, D. Regenerative Biology and Medicine. , Academic Press. London. (2006).
  2. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
  3. Doetsch, F., Scharff, C. Challenges for brain repair: insights from adult neurogenesis in birds and mammals. Brain Behav. Evol. 58 (5), 306-322 (2001).
  4. Kaslin, J., et al. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
  5. Kizil, C., et al. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev. Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
  6. Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev. Genes Evol. , In Press (2013).
  7. Kempermann, G. Adult Neurogenesis 2: Stem Cells and Neuronal Development in the Adult Brain. , 2nd Edition, Oxford University Press. Oxford. (2010).
  8. Ihrie, R. A., Alvarez-Buylla, A. Cells in the astroglial lineage are neural stem cells. Cell Tissue Res. 331 (1), 179-191 (2008).
  9. Grandel, H., et al. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell. 295 (1), 263-277 (2006).
  10. Chapouton, P., et al. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
  11. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
  12. Byrd, C. A., Brunjes, P. C. Neurogenesis in the olfactory bulb of adult zebrafish. Neuroscience. 105 (4), 793-801 (2001).
  13. Pellegrini, E., et al. Identification of aromatase-positive radial glial cells as progenitor cells in the ventricular layer of the forebrain in zebrafish. J. Comp. Neurol. 501 (1), 150-167 (2007).
  14. Lam, C. S., et al. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish. 238 (2), 475-486 (2009).
  15. Wang, X., et al. Identification of Wnt-responsive cells in the zebrafish hypothalamus. Zebrafish. 6 (1), 49-58 (2009).
  16. Kaslin, J., et al. Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche. J. Neurosci. 29 (19), 6142-6153 (2009).
  17. Ganz, J., et al. Heterogeneity and Fgf dependence of adult neural progenitors in the zebrafish telencephalon. Glia. 58 (11), 1345-1363 (2010).
  18. März, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58 (7), 870-888 (2010).
  19. Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
  20. Kroehne, V., et al. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  21. Ito, Y., et al. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Dev. Biol. 342 (1), 26-38 (2010).
  22. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395(2011).
  23. Morcos, P. A., et al. Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues. Biotechniques. 45 (6), 613-614 (2008).
  24. Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27(2012).
  25. Chapouton, P., et al. her5 expression reveals a pool of neural stem cells in the adult zebrafish midbrain. Development. 133 (21), 4293-4303 (2006).
  26. Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Developmental Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
  27. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  28. Rosen, J. N., et al. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).
  29. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113(2009).
  30. Rikin, A., et al. A reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis. J. Vis. Exp. (42), e2020(2010).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章