斑马鱼胚胎中脑血管结构的成像与三维重建

摘要

介绍了对幼年斑马鱼脑血管发育进行成像的方法。同时提供了促进三维成像以及利用化学处理手段调控脑血管发育的技术。

摘要

斑马鱼是研究体内发育生物学和病理学的有力工具。in vivo。斑马鱼胚胎体积小且具有相对透明的特性，使其特别适用于心脏和血管发育等过程的直观观察。在最近的几项研究中，利用在血管内皮细胞中表达EGFP的转基因斑马鱼，通过共聚焦显微镜对大脑和视网膜中的复杂血管网络进行成像与分析。本文提供了对表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的斑马鱼胚胎进行制备、处理和成像的方法描述，并进而生成脑血管系统的全面三维重建图像。实验方案包括胚胎处理、共聚焦成像以及能够保持EGFP荧光的固定流程。此外，还提供了一些获取高质量脑血管结构图像的实用技巧，例如在不损伤邻近神经组织的前提下摘除眼球的操作方法。同时讨论了共聚焦成像过程中可能遇到的问题，以及如何利用免费的开源软件，从共聚焦图像序列中生成三维重建图像所需的具体步骤。

引言

斑马鱼为研究发育生物学提供了强大的体系，其胚胎相对透明，适合基于成像的研究¹。几十年来，斑马鱼已被用作脊椎动物发育的模型。包括斑马鱼在内的辐鳍鱼类具有简化的脊椎动物血管系统，该系统在无脊椎动物中没有相应的同源结构。血液从两腔心脏的前腔泵出，经过鳃部进行氧合。来自鳃部的血液汇入背主动脉，再经由逐渐分支为更细小血管的动脉，最终到达器官组织中的毛细血管。在毛细血管中，氧气被释放，二氧化碳被吸收。在毛细血管的静脉端，血液流入越来越大的静脉，最终回流至心脏的后腔，从而开始新一轮循环。

成年斑马鱼一次可产下200个或更多的卵，受精后其发育迅速²。在24小时内，身体轴已充分发育，包括能够收缩并使胚胎在绒毛膜内活动的肌肉。在受精后2至7天（dpf）期间，大多数身体系统逐渐发育，包括眼睛和能够协调向食物游动或避开强光的中枢神经系统。在发育至7 dpf之前，胚胎体积足够小，便于通过显微镜进行观察。表达荧光蛋白的转基因品系可通过共聚焦显微镜或荧光显微镜成像。共聚焦成像可结合开源软件³，对斑马鱼胚胎中完整的血管结构进行三维重建，从而从系统生物学角度揭示血管发育过程。本实验方案有助于研究血管及脑血管复杂性的变化，因其支持对血管网络进行系统水平的分析^4,5。本文提供了一系列方法与资源，以便研究人员能够便捷地采用这些技术，开展需要对斑马鱼胚胎血管结构进行成像的研究。斑马鱼作为动物模型具有成本效益高的优势，结合新兴的成像技术，为研究分子通路在脊椎动物发育与稳态中的促血管生成效应提供了新的平台。

方案

1. 斑马鱼饲养、胚胎制备与处理

1. 在机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导下，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）或其他监管机构/指南的动物护理规范，开展以下斑马鱼实验方案。
2. 可在斑马鱼国际资源中心（ZIRC）获取在特定组织、细胞或器官中表达荧光蛋白的斑马鱼品系。例如，Tg(kdr:EGFP)s843 在血管内皮细胞中表达 EGFP⁶，可用于生成本方案中所示的完整三维血管结构。ZIRC 还提供其他转基因斑马鱼品系。
3. 将成年斑马鱼饲养在可监测 pH、盐度、温度、溶解氧、光照及其他环境因素的适当水产养殖系统中⁷。本实验所用斑马鱼饲养于 Aquaneering Inc. 系统（加利福尼亚州圣地亚哥）中，温度为 28.5 °C，光照周期为 14 小时光照/10 小时黑暗。成年斑马鱼喂食丰年虾和 NRD 4/6 鱼粮（Brine Shrimp Direct，犹他州奥格登）。
4. 应将繁殖年龄的成年雄性和雌性斑马鱼分开放置，以提高交配成功率。
5. 通过将雌鱼（2–4 条）和雄鱼（4–6 条）共同放入底部带网孔的交配容器中，以刺激产卵和受精，网孔大小应足以让卵通过，但成年斑马鱼无法穿过。建议在前一晚设置交配，卵通常在黎明前后产出，此时白天光照周期的强度逐渐增加（模拟黎明）。每隔 15–30 分钟检查一次交配容器底部是否有卵。
6. 使用带网孔的滤器收集卵，并用 E3 缓冲液（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl₂、0.33 mM MgSO₄）清洗。将卵转移至盛有 E3 缓冲液的 100 mm 培养皿中，并置于 28 °C 培养箱中保存。
7. 为研究影响脑血管分支的化学物质，可加入所需浓度的化学试剂。例如，从受精后 24 小时（hpf）开始，使用溶于 DMSO 的 γ-分泌酶抑制剂（GSI IX/DAPT/N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰)]-S-苯基甘氨酸叔丁酯）可诱导新生血管分支⁴。在此时间点，胚胎仍处于卵膜内，许多化学物质可穿透卵膜⁸。若处理条件可能对神经系统或运动功能产生影响，导致胚胎无法自行破膜，则应在 24 至 48 hpf 之间进行去卵膜操作，可使用镊子或蛋白酶 K 完成²。本图所示胚胎的去卵膜操作是用两把尖头镊子轻轻夹住卵膜并撕开实现的。
8. 如需要或希望抑制色素形成，可在 24 hpf 时向 E3 缓冲液中添加 0.003% 的 N-苯硫脲（PTU）。

2. 固定斑马鱼胚胎中脑血管结构的共聚焦成像

1. 用250 mg/L的三卡因甲磺酸盐处死胚胎，然后在4 °C条件下用2–4%多聚甲醛浸泡固定过夜。含荧光胚胎的容器应包裹铝箔。固定完成后，将胚胎保存在4 °C的磷酸盐缓冲液（PBS）中直至成像——EGFP荧光强度约一周后会逐渐减弱，但形态学结构（明场观察）可长期保持。
2. 准备胚胎装片时，首先使用 sharpened tungsten needle（钨针）去除一只眼睛。先切割连接眼球的周围组织，再切断眼肌，最后切断视神经以移除眼球。（注意：若需对两侧成像，则应去除双眼。）
3. 移除眼球后，用一滴3%甲基纤维素将胚胎固定在盖玻片上。调整胚胎方向，使去眼侧朝向盖玻片，并尽可能贴近玻片表面。用甲基纤维素完全覆盖胚胎，以防止成像过程中脱水。
4. 立即使用配备高质量20倍平场复消色差物镜（数值孔径 ≥ 0.75）的倒置共聚焦显微镜对装片后的胚胎进行成像。该配置优于正置显微镜，因后者需将胚胎夹在两片玻璃之间，并压迫胚胎紧贴上层玻璃，易造成形变。
5. 使用中等或较大的孔径设置，以1 µm为步长采集光学切片。也可采用2.5 µm的较大步长，但可能难以准确判断较小结构的空间顺序。较小的孔径可获得更清晰的细节，但扫描时间更长，可能导致EGFP荧光漂白，并限制对胚胎深层组织的成像深度。共聚焦显微镜通常可对胚胎约一半厚度进行有效成像。
6. 若需对整条鱼进行成像，应在开始时即去除双眼（参见步骤3.2中的注释），在完成一侧成像后旋转胚胎，并对另一侧重复步骤2.3–2.5。

3. 胚胎斑马鱼脑血管系统的三维重建

1. 使用 Fiji 发行版³ 开源的 ImageJ（http://fiji.sc），专为 3D 渲染优化，免费提供，兼容 PC、Mac 和 Linux 计算机。
2. 将共聚焦图像序列导入 Fiji，方法是进入 Plugins>LOCI>BioFormats 导入器 ⁹ 然后选择共聚焦文件， 例如 尼康图像序列的 name.ids（图2A)。选择使用 Hyperstack 查看堆栈，颜色模式：灰度，勾选自动缩放，勾选拆分通道。
3. 这些选择将打开四个独立的通道面板；对于EGFP，通常只需使用其中一个，一般是第三个。关闭其余三个面板（红色、蓝色和alpha），保留16位图像，其名称较长，并以C=1结尾图 2A).
4. 通过底部滚动选项卡浏览图像，调节阈值以找到包含目标区域或结构的切片，然后转到图像>调节>阈值（图2C).
5. 在弹出的面板中，将顶部滑块（黑场）向左滑动，使结构在背景上清晰可见，底部滑块（白场）保持原位图 2D). 选择 B&W，选择暗背景。除非每张图像需要不同的调整，否则不要选择“为每张图像计算阈值”，请选择黑色背景。此过程将生成一个新的8位图像。
6. 警告：在 ImageJ 中，阈值设定无法撤销或保存，因此每次需要更改时都必须重新加载共聚焦图像栈。请记录下相关数值，并尝试不同的设置，直至达到理想结果。
7. 转到插件>3D 查看器>阈值设为0，重采样因子设为1（最佳）或2（良好），取消选择红色和蓝色颜色通道，以生成绿色的三维输出；否则将生成白色渲染图像。选择“应用”（非“自动”）图2E).
8. 使用鼠标和键盘控件旋转、旋转和平移3D图像（图 2F).
9. 随时可通过菜单中的“捕获”选项保存静态图像。屏幕上图像框的大小决定了所生成图像的像素尺寸，因此若需获得高分辨率图像，可通过拖动右下角来增大图像框。
10. 通过选择“View”创建旋转的3D动画>记录360度旋转（图2G）。旋转默认步长为2度，但也可更改为5度，例如，这样可显著减小文件大小，但可能导致动画出现卡顿。
11. 将文件保存为多种可用格式之一，以便后续使用媒体播放器查看、上传至互联网或用于 PowerPoint 演示文稿。开源媒体播放器 VLC（http://www.videolan.org/vlc/index.html），免费提供，且对这些视频的处理非常出色。

结果

血管结构的三维重建为斑马鱼发育提供了全面且具有视觉吸引力的观察视角。图1和图2展示了这些方法的典型操作方式。图3显示了在6天龄斑马鱼胚胎中表达EGFP的内皮细胞内血管结构的多个角度图像。当使用纯绿色或白色显示时，信号强度可能难以分辨；伪彩色技术通过查找表呈现图像强度，能够在结构重叠时提供更好的深度感知。在图4中提供了6天龄斑马鱼血管系统伪彩色三维图像的一个示例。对活体胚胎进行荧光成像可用于研究包括眼部和身体运动以及心脏活动在内的生理特征。使用上述方法及所描述的转基因斑马鱼品系，图3和图4展示了代表性实验结果。成像分辨率取决于显微镜的性能，但EGFP信号的亮度足以在大多数商用系统上获得良好的图像质量。三维重建与渲染结果具有一致性，该开源软件中的各项设置均可稳定生成高质量图像。

图1. 眼球去除。A) 一只固定的3天龄胚胎，其眼球旁放置有钨针。从此位置开始在眼球周围切割组织。B) 眼球脱落，随后切断其下方的眼肌和视神经。虚线圆圈指示空的眼窝位置。C) 将同一胚胎翻转后用甲基纤维素封片，完整的眼球朝上。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. 共聚焦图像堆栈的逐步三维重建。A) 在 Fiji 中通过插件>LOCI>Bioformat 打开并加载文件（4104.1.ids）。B) 找到包含感兴趣区域的切片后，选择如图所示的阈值调整功能。C) 使用上方滑块将阈值调整为 214，并点击应用。D) 按照图示调用 3D 查看器。E) 显示一只斑马鱼的三维重建图像，其眼睛结构完整，用于方位参考。F) 图像已进行缩放和旋转。G) 按照图示生成 360 度旋转动画。请点击此处查看该图的高清版本。

图3. 三维重建的不同视角。A) 使用10倍物镜拍摄的6天龄胚胎的内侧视角，口位于右侧，口内无鳃结构。B) 同一胚胎的侧面视角，注意鳍在中间呈环状。C) 使用20倍物镜拍摄的同一胚胎，内侧视角，注意鳃结构的分辨率。D) 使用20倍物镜成像的侧面视角，鳍位于图版右侧边缘。E) 使用20倍物镜成像的前内侧视角，注意口内的鳃结构。F) 使用20倍物镜拍摄的同一胚胎腹部，头部朝右，注意右下角卵黄囊上的血管系统。请点击此处查看该图的高清版本。

图4. 6 dpf胚胎中的信号强度差异。 使用伪彩色查找表显示信号强度的6 dpf胚胎三维重建图像。图中标注了口、脑、鳃和卵黄囊，以提供解剖定位参考。 请点击此处查看该图的高清版本。

图 5. 4 日龄斑马鱼重建血管系统的动态影像。 成像层厚为 2.5 μm，图像来源于胚胎一半的成像。请将血管结构与经 GSI 处理的斑马鱼血管结构（见图 6）进行比较。注意头部血管密度较低，且鳃部较大。（参见“Downloads”下的补充文件“Zfish_spin.avi”）

图6. GSI处理的胚胎在4天龄时血管系统的3D电影。 该鱼从侧面向中线方向以2.5 μm步进成像。请将血管结构与图5所示的对照组4天龄鱼进行比较。弓背及体型较小是经该化学物质处理胚胎的典型特征。（参见“下载”部分的补充文件“GSI-treated_4dpf_fish.avi”）

讨论

本文所述方法为研究斑马鱼发育过程中血管系统的可视化提供了基础。活体样本可用于评估生理参数，如心率和每搏输出量，而固定样本则适用于高分辨率共聚焦成像。虽然果蝇（Drosophila）和线虫（C. elegans）可用于全身体成像，但斑马鱼属于脊椎动物，可作为脊椎动物组织的有用模型，包括具有内皮细胞衬里的血管系统。这些研究可整合斑马鱼研究领域已有的大量转基因品系和基因组资源。如本文所述，对胚胎斑马鱼的共聚焦图像进行三维重建与渲染，可实现对血管分支和血管密度的系统生物学研究，而这是在大鼠和小鼠等体型较大的动物模型中无法实现的。此外，由于斑马鱼为非羊膜动物，其胚胎在可调控的环境（E3缓冲液）中发育，研究者可在此环境中轻松添加抑制特定酶或其他影响血管发育过程的化学物质。通过调整化学物质的浓度和处理时间，研究者能够精细优化实验处理条件。

1. 修改与故障排除

对该系统的改进可引入转基因斑马鱼品系，这些品系可在多种组织、器官或特定区域表达EGFP或其他荧光蛋白¹⁰。此外，近期已有针对斑马鱼视网膜新生血管变化的分析方法发表⁵。对于较老胚胎及成年斑马鱼的色素干扰问题，可通过与不产生鳞片色素或视网膜色素的转基因品系杂交来克服。荧光减弱的问题通常源于不适当的固定条件。使用4%多聚甲醛固定1天为最佳条件，而更强的固定剂（如戊二醛、四氧化锇或酒精）可能会破坏EGFP荧光。固定后的胚胎应保存在4 °C的PBS中，并始终避免暴露于直射阳光下。

2. 该技术的局限性

使用本方案生成的3D重建图像的质量和分辨率取决于所获得图像的质量。利用标准共聚焦显微镜，光线仅能穿透胚胎至正中矢状面。这一成像特性限制了对较晚期胚胎及成体样本的成像深度，而更先进的多光子显微成像系统则可实现更深层组织的成像。

3. 相对于现有方法的意义

本方案提供了一种在系统水平上分析包含整个动物的血管网络的方法。以往此类数据的呈现方式通常依赖于并列排列的一系列图像，而三维重建能够更清晰地解析其中的空间关系。

4. 未来应用

成像和组织处理技术的新进展将为这些方法带来诸多新应用，可能包括使较老的胚胎或成体组织变得透明^11-14增强的透明度将显著提高共聚焦和多光子激光对组织的穿透能力。此外，随着相机和光电倍增管速度的不断提升，未来可能实现实时生成鱼类的三维图像，提供一种四维^th 分析维度

5. 关键步骤

本方案中的一个关键步骤是成像前的准备，包括适当的固定处理。固定后应尽快使用具有最佳数值孔径的高质量物镜进行成像。分辨率取决于所用的成像系统，因此通常高质量的成像系统效果更佳。生成三维重建图像对内存要求较高，因此建议使用较新、高端且配备大容量内存和优良图形处理器的计算机。

本文所述的可视化生物学系统已针对在血管内皮细胞中表达EGFP的转基因斑马鱼进行了优化，但这些方法也可适用于在神经元、肌肉、腺体或多种其他细胞群体中表达GFP或其他荧光蛋白的转基因胚胎。使用该系统的主要优势在于能够研究发育期间任意时间点整个胚胎中发生的生物学过程，且既可在固定样本中也可在活体动物中进行观察。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
N – 苯硫脲	Alfa Aesar，货号 #41972		溶于 E3 缓冲液配制成 0.2 M 溶液，4 °C 保存
E3 缓冲液	Sigma		5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2，0.33 mM MgSO4
共聚焦显微镜	Nikon		Nikon TE-2000U 配备 D-EclipseC1 系统
玻璃底培养皿	Mat-Tek
GSI IX/DAPT			N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰)]-S-苯基甘氨酸叔丁酯，EMD Biosciences
24 孔板	Becton-Dickinson，货号 #351147		BD Falcon
移液管	VWR，货号 #414004-001		VWR 一次性移液管
甲基纤维素	Alfa Aesar，货号 #43146		溶于 E3 缓冲液配制成 3% 溶液
NRD 4/6 鱼食	Brine Shrimp Direct		干燥状态
卤虫	Brine Shrimp Direct		活体
钨丝	Small Parts，货号 #TW-016-60		外径 0.016”
三卡因	VWR #101107-950		E3 缓冲液中三卡因甲磺酸盐浓度为 250 mg/L