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将Kv通道重构至脂质膜中用于结构与功能研究

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DOI：

10.3791/50436

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2013年7月13日

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了将一种原型电压门控钾通道完全重建到脂质膜中的操作步骤。重建后的通道适用于生化分析、电生理记录、配体筛选以及电子晶体学研究。这些方法可能普遍适用于其他膜蛋白的结构与功能研究。

摘要

为了以简化的方式研究脂质-蛋白质相互作用，必须将膜蛋白整合到具有明确脂质组成的膜中。我们正在研究一种原型电压门控钾离子（Kv）通道中的脂质依赖性门控行为，并已建立了一套详细的方案，用于将这些通道重构至不同的膜系统中。我们的重构方案综合考虑了去垢剂诱导的囊泡融合、蛋白质/去垢剂胶束与脂质/去垢剂混合胶束的融合，以及脂质在蛋白质/去垢剂/脂质胶束和脂质/去垢剂混合胶束之间达到平衡分布的重要性。实验数据表明，通道蛋白在脂质囊泡中的插入方向相对随机，且重构效率极高，在分级分离实验中未观察到可检测的蛋白质聚集体。我们已利用重构的通道确定了其在不同脂质环境中的构象状态，记录了平面脂双层中少量通道的电生理活性，从噬菌体展示肽库中筛选出构象特异性的配体，并支持通道在膜中形成二维晶体。本文所述的重构方法可适用于在脂双层中研究其他膜蛋白，尤其适用于探究脂质对真核生物电压门控离子通道的影响。

引言

细胞通过特定膜蛋白的功能与其环境进行物质和信息交换1。细胞膜中的膜蛋白在膜上发挥泵、通道、受体、膜内酶、连接蛋白以及结构支撑等多种功能。影响膜蛋白的突变与多种人类疾病相关。事实上，许多膜蛋白因其在细胞膜中的重要性和易接近性，已成为主要的药物靶点。因此，理解各种膜蛋白在膜中的结构与功能至关重要，这有助于开发新方法以减轻突变蛋白在人类疾病中造成的有害影响。

脂质包围着整合在双分子层中的所有膜蛋白2, 3。在真核生物膜中，多种不同类型的脂质已知会组织成微区结构4, 5。许多膜蛋白被发现不仅分布于这些微区中，也存在于膜的主体流动相中3, 6。然而，这些微区形成的机制、膜蛋白向微区的靶向运输过程，以及此类分布的生理意义仍不清楚，尽管其重要性显而易见。研究脂质对膜蛋白影响的一个主要技术难题在于，如何将生物化学纯化的膜蛋白可靠地重构到脂质组成精确可控的人工膜系统中，从而使几乎所有重构后的蛋白都具有功能活性7。在过去几年中，我们建立了一系列方法，用于将来自A. pernix的原型电压门控钾离子通道（KvAP）重构到多种膜系统中，以开展结构与功能研究8-10。来自我们团队及其他研究者的数据显示，脂质可能是电压门控离子通道电压感应结构域构象变化的决定因素，并可能影响部分此类通道的结构形态11。接下来，我们将详细描述这些方法，并提供关键的技术要点，以确保他人能够成功重复我们的结果，并将这些方法拓展应用于其他膜蛋白的研究。

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方案

1. KvAP 通道的表达与纯化（图 1）

  1. 准备工作——第0天
    1. 用去离子水（diH₂O）冲洗用于细菌培养的玻璃烧瓶2O）和 MilliQ H2O (MQH2以去除普通洗碗过程中残留的洗涤剂。
    2. 在2.8 L锥形瓶中分装1,000 ml LB培养基（此处以总共两升培养液为例），高压灭菌。低硬度水对转化细菌的成功培养至关重要。
    3. 在500 ml锥形瓶中高压灭菌100 ml LB培养基
    4. 将200 ng含有KvAP基因（带凝血酶切割位点）和His标签的pQE60质粒转化至60 μl XL1-Blue感受态细胞中6 在其C末端添加标签，将细菌接种于两个含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37 °C培养箱中培养14–16小时。
  2. KvAP表达——第1天
    1. 过夜培养后观察平板上细菌菌落的形态。菌落直径通常仅为0.2–0.5 mm，数量较多。应避免选择那些具有较大菌落且周围环绕大量卫星菌落的平板。
    2. 向每块过夜培养的LB-琼脂平板中加入5.0 ml LB培养基，刮下菌落。将菌液转移至装有100 ml已灭菌LB培养基的500 ml三角瓶中。加入氨苄青霉素至终浓度为100 μg/ml，于37 °C培养约1小时，或直至OD600达到0.60。
    3. 同时，将两瓶各装有1.0 L培养基的烧瓶放入37 °C摇床培养箱中预热培养基，并准备20 ml BaCl2 （1.0 M；每1.0 L培养液中终浓度为10 mM），2.0 ml 0.4 M IPTG（异丙基-硫代-β-半乳糖苷），以及2.0 ml 溶于水的100 mg/ml氨苄青霉素储备液。
    4. 小培养准备就绪后，加入10 ml BaCl2，将1.0 ml氨苄青霉素储存液和50 ml来自步骤1.2.2的小量培养物加入预热的LB培养基中。OD600应约为0.05。注意由于水的高硬度以及LB培养基中的反离子可能导致的沉淀现象。Ba2+ 已知可结合钾通道的孔区并阻断离子电流，从而降低通道在细菌中高水平表达所导致的毒性。
    5. 每小时测量一次 OD600，直至达到 0.70，随后每十五分钟测量一次，直至达到 0.8 至 0.9。在我们的实验条件下，通常需要约 5 小时达到 0.8。
    6. 加入0.40 mM IPTG以启动通道蛋白的诱导表达，将培养物在37 °C、225 rpm振荡条件下继续培养4.0小时。
    7. 在4,000 × g、4.0 °C条件下，使用1.0升离心瓶离心15分钟收集细菌。尽可能将上清液倾倒至废液杯中，向沉淀中加入10 ml 1.0 M Na-磷酸盐缓冲液以沉淀所有Ba2+，然后加入少量漂白剂以杀死细菌。将收集的细菌置于离心瓶中，放入4.0 °C冷室的冰中过夜保存。
  3. KvAP蛋白的纯化（第2天和第3天）； 图 1B)
    1. 将细菌沉淀重悬于每1.0 L培养物15 ml的IMAC裂解缓冲液中。加入约1.0 U的DNase I，以及浓度均为1.0 μg/ml的三种蛋白酶抑制剂：亮抑酶肽（leupeptin）、抑肽酶（aprotinin）和抑胃酶肽A（pepstatin A）。对于两升培养物，总体积约为35 ml。
    2. 将重悬的细菌置于冰中盛放的金属烧杯内，总超声处理时间为10分钟。使用微探针超声仪，在4.0 °C的冷室中以5秒开启、10秒关闭的循环模式进行，输出功率设为40%。该输出功率通过实验确定，以确保大部分细菌被裂解，同时溶液中产热不明显。
    3. 将0.50 g去垢剂n-癸基-β-D-麦芽糖苷（DM；Anatrace公司生产的Sol-Grade级，干燥粉末）加入超声处理后的细胞裂解液中，室温（RT）下持续水平振荡（约100 rpm）孵育混合物3.5小时，以尽可能提取更多的通道蛋白。需确保去垢剂粉末在30–50分钟内完全溶解。
    4. 去垢剂提取后，在室温下以20,000 × g离心30分钟，从裂解液中去除细胞碎片。在等待离心完成的同时，按照下述说明制备基于His标签的LC（低压液相色谱）柱 方框 1.
    5. 将步骤1.3.4中的上清液上样至预装的IMAC柱i固定的 metal离子 a亲和力 c层析柱，流速为1-2 ml/min，由蠕动泵驱动。或者，可将提取的His标签蛋白与IMAC树脂孵育，进行批次结合。
    6. 用5个柱体积的IMAC洗涤缓冲液和10个柱体积含20 mM咪唑的IMAC洗涤缓冲液冲洗IMAC树脂。使用在线UV监测器确保洗涤彻底。
    7. 用含有300 mM咪唑的IMAC洗脱缓冲液洗脱KvAP蛋白。大部分结合的KvAP蛋白在通过层析柱的6 ml洗脱缓冲液中被洗脱下来。将凝血酶（每2–3 mg蛋白加入1.0 U）加入合并的洗脱组分中，并在室温下孵育过夜，以切割His标签。6 标签
    8. 次日，将凝血酶消化后的蛋白质溶液用超滤管（截留分子量 = 30K）浓缩至600 μl，用于尺寸排阻FPLC（快速蛋白液相色谱）。离心过程中，每5分钟混匀样品一次，以尽量减少蛋白质聚集。随着蛋白质浓缩，滤膜表面局部浓度升高，有时会出现明显的白色沉淀，可能导致滤膜堵塞。此外，浓缩器底部的蛋白质浓度较高（约5–10 mg/ml）会导致颜色偏褐色，充分混匀有助于最大限度减少样品损失。
    9. 使用预先用FPLC平衡缓冲液平衡的Superdex 200柱对浓缩的KvAP进行层析。通常，DM中的四聚体KvAP通道峰在12.3 ml的保留体积处洗脱。在约13.6 ml处有一个较小的拖尾峰，含有少量单体KvAP。我们所用色谱柱的空体积为7.0 ml，样品通常在空体积处产生一个微小峰，其中KvAP蛋白含量极低。咪唑在洗脱末期出现（约24 ml）。合并含有KvAP四聚体的组分，并将蛋白溶液浓缩至0.5 ml。使用估算的消光系数（约1.2E-5.0 M⁻¹cm⁻¹）测定样品浓度。-1 厘米-1，该值是基于芳香族残基数计算得出的KvAP在280 nm处的值（参考文献 12；网址： http://web.expasy.org/protparam/).
      在室温下，溶于去污剂DM中的纯化KvAP蛋白至少可稳定保存一周而无明显蛋白损失。在4 °C条件下，其稳定性可能更长。切勿将去污剂中的蛋白冷冻。建议将溶于DM的蛋白在4 °C保存，而溶于β-OG的蛋白则在室温保存。但我们通常不进行等待，而是在蛋白制备完成后立即进行重建步骤。
    10. 在12%还原型SDS-PAGE凝胶中检测样品。
      上述每个步骤的样品制备方法是将20微升样品与5x SDS上样缓冲液混合表3 用于缓冲液）并补充1.0% β-ME。样品未进行煮沸处理。待凝胶制备完成后，样品通常已在SDS缓冲液中于室温放置超过10分钟。凝胶电泳完成后用考马斯亮蓝染色，野生型KvAP在约26 kDa处显示为单一条带（图1B纯化后的样品在生化上具有均一性，且纯度至少达到95%。

2. 离子通道重建

2.1. 脂质体的制备及去垢剂诱导的囊泡融合

在进行脂质制备之前，用氯仿清洗一支14 ml的一次性玻璃试管、一支带螺帽的玻璃管和一支250 μl的玻璃注射器。向试管中倒入约10 ml氯仿。

  1. 棕榈酰-油酰-磷脂酰乙醇胺的制备（POPE）和棕榈酰-油酰-磷脂酰甘油（POPG）脂质体。
    1. 将3.75 mg POPE和1.25 mg POPG（POPE:POPG = 3:1 质量比）溶于氯仿中，转移至预先清洗过的带螺帽玻璃试管中，在持续通入氩气的条件下干燥脂质。当肉眼不可见氯仿时，于室温真空条件下继续干燥1小时。
    2. 向干燥的脂质中加入440 μl低盐缓冲液（10 mM HEPES，pH 7.4）或水，涡旋振荡管子以水合脂质。脂质悬液呈乳白色且浑浊。
    3. 在冰浴中超声处理脂质悬浮液，直至囊泡溶液变为透明（OD410 < 0.2）。 < 0.2).
      通常，对于水或低盐缓冲液中的10 mg/ml POPE/POPG溶液，我们采用超声处理仪以30秒开启、30秒关闭（置于冰上）的方式操作，总时长为15–20分钟。由于超声过程中会产生热量，建议在脂质溶液中添加1.0 mM DTT以最大限度减少脂质氧化，并将超声仪的水浴温度冷却至10 °C或更低。最终的OD410值取决于所用脂质种类；对于某些脂质，可能很难达到如此低的OD值。若出现此情况，通常可使用去垢剂将脂质完全溶解，并进行长时间孵育，以使脂质在含蛋白胶束周围实现良好分布（见下文）。
      为了达到OD410，使用大容量浴式超声仪至关重要 < 0.2. 我们一直使用由 Laboratory Supplies Co., Inc（型号 # G112SPIG，Hicksville，NY）制造的系统。正确超声处理囊泡的关键是确保试管中部的共振中心具有强烈的振动。振动强度随水量变化，因此可进行调节。此外，经验表明，在水中加入少量甘油以增加其黏度，可提高超声处理的效率。
      我们还发现，使用微探针超声波破碎仪直接接触塑料或金属管中的脂质悬浮液，也可获得相同效果。微探针需清洁处理，仅将探针尖端浸入脂质溶液中。由于脂质颗粒会在微探针表面被破碎成小片段，因此必须保持样品低温，并添加适量还原剂以防止不饱和脂质发生氧化。
      在冷冻电子显微镜下，超声处理后的单层囊泡大多数直径为30–50 nm（数据未显示）。这些小型小单层囊泡（SUVs）的曲率极高，微小的扰动就足以诱导其剧烈融合，形成直径为80–200 nm的较大囊泡（见下文）。
    4. 加入50 μl的3.0 M KCl和10 μl的0.50 M DM至混合物中，使最终脂质悬浮液含有300 mM KCl和10 mM DM。在室温下以水平旋转方式孵育溶液2小时，以形成脂质/去污剂混合胶束。孵育结束后，悬浮液应略微变浑浊图2A），这是由于去垢剂诱导了小单层囊泡的融合。
    5. 当蛋白浓度超过 2.0 mg/ml 时，向脂质/去污剂混合物中加入 0.50 mg KvAP 蛋白、50 μl 3.0 M KCl、16 μl 水中配制的 0.50 M DM 储存液以及 10 mM HEPES（pH 7.4），终体积为 1 ml。最终脂质与蛋白的重量比为 10:1，DM 的终浓度为 18 mM。图2A将蛋白质/脂质/去垢剂混合物置于玻璃管中，水平旋转孵育2小时。
      去垢剂浓度的选择取决于去垢剂诱导的囊泡融合与囊泡溶解作用 13当通过强烈超声处理形成囊泡时，其在电镜下的平均直径为30–50 nm。这些囊泡在410 nm处的散射信号非常低。在低浓度下，去垢剂首先插入囊泡中，使囊泡失稳，并诱导去垢剂饱和囊泡的融合（OD410上升；参见 图2A）。囊泡融合导致OD410 nm值升高。对于10 mg/ml的POPE/POPG囊泡，OD410在约15 mM DM时达到峰值。当加入更多去垢剂时，囊泡开始破裂，脂质逐渐分配到去垢剂/脂质混合胶束中。此过程伴随OD410下降至最终的低水平（<0.1).
      由于去垢剂诱导小囊泡融合，在光密度上升阶段存在活跃的融合事件，因此蛋白/去垢剂胶束极有可能主动与已被去垢剂饱和的脂质囊泡发生融合。这正是在制备蛋白/脂质/去垢剂混合物时选择18 mM DM的原因。如果去垢剂浓缩超过4倍，则需要调整DM的用量，使最终浓度仍维持在约18–20 mM。当蛋白得率非常低时，难以准确评估样品中浓缩去垢剂的含量，此时我们倾向于将蛋白与完全溶解的脂质混合，并使用充分平衡的混合物进行重组。据我们经验，若未给予足够时间使脂质在含蛋白和无蛋白的胶束之间达到良好的平衡分布，重组效率将显著下降。我们通常通过两个实验来检测重组效率：1）通过蔗糖密度梯度超速离心检测蛋白是否与囊泡组分共迁移；2）将重组囊泡中的蛋白提取出来，通过凝胶过滤层析分离，检测有多少蛋白（在本实验中为KvAP）仍保持四聚体状态。蛋白/脂质/去垢剂混合物的最低孵育时间为室温下数小时或4°C过夜。
      对于一种在不同去垢剂中保持稳定的新膜蛋白，第一步是研究该去垢剂对脂质的增溶特性，类似于图中所示的方法。 图2A接下来，建议从PC提取物开始，例如 大肠杆菌 极性提取物PC、大豆PC提取物等，因此如果特定蛋白质的功能需要某些磷脂，则这些磷脂可能已包含在提取的脂质混合物中。
  2. KvAP 与去垢剂溶解的 1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）混合制备DOTAP）或 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-琥珀酸酯（狗）——用于重组的脂质完全溶解的示例
    1. 脂质制备方法与POPE/POPG囊泡相同。水合脂质经超声处理形成小单层囊泡所需时间较长（通常为45–60分钟），而POPE/POPG脂质所需时间较短（通常为5–10分钟）。DOGS囊泡可能缓慢相互融合，形成少量油状液滴。
      由于DOTAP和DOGS难以 reproducibly 地制备出高质量的小单层囊泡（SUVs），我们通常在与蛋白质混合前先将这两种脂质完全溶解。
    2. 为了完全溶解DOTAP或DOGS，将超声处理后的囊泡与10 mM DM和40 mM 正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷（β-OG）混合。脂质/去垢剂混合物在4°C下孵育过夜（> 室温下孵育15小时，混合物中不应含有任何微小颗粒或液滴，而应较为澄清。此步骤若未达到完全平衡，将导致大量多层囊泡的形成。
    3. 将KvAP蛋白与去污剂溶解的DOTAP或DOGS按蛋白:脂质比例小于或等于1:10混合。将蛋白/去污剂/脂质混合物置于室温下，以翻转旋转方式孵育2-3小时。

2.2. 去除去垢剂以形成蛋白脂质体

  1. 透析——缓慢去除具有相对较高临界胶束浓度（CMC ≥ 1.0 mM）的去垢剂，例如 DM 和 β-OG。
    每 1.0 ml 混合物准备 2 升透析缓冲液（表 3）。
    剪取适当长度的透析管（截留分子量 MWCO = 10K；宽 0.70 cm），并用去离子水清洗。检查并确保透析管无泄漏至关重要。对于敏感样品，可先用含 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）和 2.0 mM EDTA 的缓冲液处理透析管，然后在沸水中清洗 3–5 分钟。随后将透析管一端夹紧，并用透析缓冲液冲洗。
    将蛋白-脂质-去垢剂混合物装入透析管中，用夹子夹紧两端，使液面上方空间尽可能小。将装有混合物的透析管放入透析缓冲液中，并使用搅拌板使透析管在溶液中缓慢旋转。每 8 小时更换一次透析缓冲液。首次更换缓冲液后，若原始蛋白-脂质-去垢剂混合物完全澄清，则溶液应变得浑浊。若透析速度过快，透析管底部可能出现白色固体沉淀。建议在更换缓冲液时轻轻揉搓透析管并多次倒置。经过五次缓冲液更换后，脂质体通常已制备完成。
    我们通过将脂质体喷射到脂双层上检测残留去垢剂量。若仍有大量去垢剂残留，脂双层几乎会立即破裂。也可采用比色法或测定脂质体悬液的表面张力来定量残留去垢剂。
  2. 使用聚苯乙烯珠去除低 CMC 去垢剂
    在许多情况下，必须使用低临界胶束浓度（CMC）的去垢剂，例如 DDM（在水中 CMC ~0.17 mM）。利用具有微小疏水孔的珠粒可有效去除此类去垢剂14。
    1. 珠粒的制备。称取 0.5 g 干燥珠粒置于 50 ml Corning 管中，加入 20 ml 甲醇，在浴式超声仪中超声 5 分钟以去除夹带的气泡，5,000 rpm 离心 5 分钟后倾去大部分甲醇。依次用乙醇和 MilliQ 水重复洗涤。洗涤后的珠粒保存于含 20% 乙醇的溶液中，4 °C 储存，使用前需更换至无去垢剂的缓冲液。
    2. 估算待处理的蛋白/脂质/去垢剂混合物中的去垢剂含量，并计算所需珠粒用量以去除去垢剂。对于 DDM 和 DM，其结合能力约为每 10 mg 去垢剂使用 100 mg 珠粒。称取无过量水分的湿珠粒，直接加入蛋白混合物中。珠粒需至少作用 15–20 分钟，使去垢剂浓度降低至稳定水平14–16。为去除 1.0 ml 溶液中相当于 ~18 mM 的 8.7 mg DDM（十二烷基麦芽糖苷），共使用 87 mg 聚苯乙烯珠（如 Bio-Beads SM2），分五等份加入。将蛋白/脂质/去垢剂混合物与每份珠粒在室温下持续翻转混合 20–30 分钟，离心去除珠粒后，将上清转移至下一份珠粒中，重复操作直至完成。
      当去垢剂浓度降至其 CMC 时，我们有意将该步骤延长至一小时，以便溶液中微量的去垢剂促进小脂质体融合为较大的脂质体。
    3. 为在最后一步后进一步去除痕量去垢剂，加入 35 mg Bio-Rad SM2 珠粒，与脂质体在 4 小时内孵育。
      当上述去垢剂去除步骤应用于新蛋白时，通常建议起始蛋白/脂质质量比（wt/wt）约为 1:10。脂质/去垢剂混合物需仔细配制，确保加入足量去垢剂以完全溶解脂质（图 2A）。将脂质-去垢剂混合物在室温下（含 1–2 mM DTT）孵育超过 2 小时，并持续振荡（400 rpm）或翻转混合。当蛋白与脂质混合后，蛋白/脂质/去垢剂混合物应在室温或低温环境中孵育足够长时间（若蛋白稳定，可过夜），以使去垢剂和脂质在含蛋白胶束与无蛋白胶束之间达到相对均匀的分布。此外，若采用 BioBeads 快速去除去垢剂，需明确珠粒的去垢剂结合能力。缓慢去除去垢剂可能有助于确保蛋白获得足够的脂质以维持其完整性，并嵌入相对较大的脂质体中。

2.3. 蛋白脂质体的保存与质量控制

  1. 囊泡制备完成后，将其分装为每份 50 μl，并通过直接浸入液氮中进行速冻。冷冻后的囊泡储存于 -80 °C 冰箱中。对于生化检测，我们不使用冻存的囊泡，因为冻融循环有时会引入干扰 cysteine 特异性反应的人工假象。对于电生理记录，仅使用在 -80 °C 保存不超过 6 个月的囊泡。
  2. 囊泡在密度梯度中的漂浮（图 2B）
    1. 将 50 μl 囊泡悬液加至蔗糖梯度的上层，蔗糖梯度由 10 mM HEPES 配制的 10%、35% 和 55% 蔗糖溶液组成，每层各 0.3 ml，在 4 °C 下以 200,000 × g 离心 4 小时。加速和减速过程应缓慢进行，以避免破坏各层之间的界面。
    2. 从顶部到底部收集 100 μl 的组分，并在非还原性 SDS-PAGE 上进行电泳分析（图 2B）。KvAP 蛋白可被考马斯亮蓝良好染色，0.5–1.0 微克蛋白的条带清晰可见。KvAP 蛋白应位于 10% 与 35% 蔗糖之间的界面处。在高密度区域未见明显的蛋白质重聚集，表明几乎所有蛋白质均位于膜中。
  3. 检测 KvAP 通道在囊泡中的正确构象。
    我们先前的研究数据表明，单个半胱氨酸突变体（L125C/C247S）KvAP 在正确整合入双分子层后，完全埋藏于膜内，无法被半胱氨酸特异性试剂接触8。我们使用该突变通道验证了重建流程，并通过半胱氨酸特异性试剂 MTS-PEG5000 进行检测。在室温下使用 1.0 μM MTS 试剂对 L125C 位点进行修饰，可在非还原性 SDS-PAGE 凝胶上引起 KvAP 条带 5 kDa 的迁移。成功实施本重建流程后，L125C 突变通道在磷脂膜中应无明显反应，表明几乎所有通道均完整插入双分子层中。作为反应的阳性对照，加入 5.0 mM DM 以使突变通道中几乎所有 L125C 残基均可被 MTS 试剂接触。
    或者，可使用孔道结合毒素（如 charybdotoxin）对四聚体通道进行计数。也可采用基于抗体的结合实验（参见方框 2，其中 Fv 被制备为 KvAP 的构象特异性配体）来定量测定重建囊泡中可结合的位点数量。这些结合实验可与总蛋白的定量测定结果进行比较，以确定重建通道中四聚体所占比例以及具有正确折叠电压感应“桨”（电压感应区 S3/S4）的蛋白比例。
    对于其他待重建的蛋白质，建议引入定量方法以评估重建蛋白中正确折叠的比例。因此，细致的功能检测是建立高质量控制体系以实现成功重建的先决条件。

3. 重建通道蛋白囊泡的应用

3.1. 在黑脂膜中研究离子通道活性的功能实验。

准备所需材料。

  1. 脂质制备
    1. 用氯仿清洗一支玻璃试管、一个带聚四氟乙烯涂层螺旋盖的棕色小瓶以及一套玻璃注射器。用氩气流干燥棕色小瓶。
    2. 将0.75 mg POPE和0.25 mg POPG的氯仿溶液转移至棕色小瓶中，并用氩气蒸发氯仿。
    3. 用0.20 ml戊烷洗涤干燥后的脂质，彻底干燥以去除残留氯仿。最后将脂质溶解于50 μl癸烷中。所得癸烷中的脂质溶液（20 mg/ml）将用于在实验双层杯一侧减薄区域上钻出的150–250微米孔（图3B）上涂抹形成脂双层（图3A）。
  2. 溶液制备
    1. 胞内溶液（反式）：10 mM HEPES/KOH，pH 7.4，15 mM KCl
    2. 胞外溶液（顺式）：10 mM HEPES/KOH，pH 7.4，150 mM KCl
    3. 盐桥：将玻璃毛细管弯成U形桥状，并用溶解于胞外溶液中的1.0%熔融琼脂填充。
      研究发现，反式与顺式溶液之间形成的渗透梯度是驱动囊泡在脂双层上发生融合的主要驱动力17。对于带负电荷的脂质，15 mM CaCl2或带正电荷的多聚精氨酸肽可诱导融合事件的发生。可将促融合脂质（如DOTAP和DOGS等）引入脂质囊泡中，以提高融合事件的发生概率。

脂质双层中KvAP通道的电生理记录

  1. 预先在双层杯圆柱表面钻出的圆孔（直径约0.25 mm）周围涂覆脂质（图3B）。脂质使用实验室自制的毛细研杵进行转移。毛细研杵的圆形头部经过抛光处理，不会划伤杯体表面。将少量脂质由毛细研杵携带后涂抹于双层杯的孔洞周围，并使其自然风干。
  2. 等待1–2分钟，使正癸烷完全挥发。操作时应注意避免脂质溶液进入孔内。
  3. 将杯子插入记录室，插入盐桥，并将电极连接至记录杯的两侧（图4A）。向孔的两侧分别加入顺式（cis）和反式（trans）溶液，建立渗透压梯度，以促进囊泡与脂双层的融合。
  4. 调节杯两侧之间的电位偏移至接近0（通常<2毫伏）。用毛细研杵蘸取少量溶解于正癸烷中的脂质混合物，涂抹于孔上直至形成双层膜。通过记录斜坡脉冲期间的电容电流来检测双层膜的形成。
  5. 等待膜逐渐变薄并趋于稳定。我们通常等待膜电容在3–5分钟内不再发生变化。
    目前普遍认为，在大孔上形成的平面双层膜，其中心区域的厚度接近常规双层膜的厚度（约4.0 nm），而靠近孔边缘处膜逐渐增厚，此处存在一个环状区域，其中大部分正癸烷溶剂残留18, 19。双层膜中心区域不可避免地会残留少量正癸烷。以往对正癸烷与磷脂酰胆碱（PC）体积比的估算显示，在膜变薄后，该比值约为0.35–0.4518, 20–22。对变薄双层膜的电子显微镜观察表明，正癸烷以透镜状结构夹在双层膜的两个单层之间22。这些数据提示，插入脂双层膜中的膜蛋白与直径可达50 nm的微小正癸烷“岛”共存。双层膜中残留的正癸烷还会使膜的比电容降低至0.4–0.5 μF/cm2，这一特性可用于根据实测电容粗略估算变薄双层膜的面积。例如，电容为100 pF的双层膜，其直径约为180 μm的圆形膜。
    对于KvAP通道而言，残留的正癸烷并未影响其电压依赖性门控行为，尽管该通道的功能尚未在无溶剂双层膜中被仔细检验。NaChBac通道和插入BLM中的Kv1.2通道也表现出类似情况23。目前尚不清楚在正癸烷-脂质双层中测得的Kv1.2通道G-V曲线相对于卵母细胞中通道的显著左移是否与残留正癸烷有关23。根据形成双层膜所用脂质的不同，双层膜中残留正癸烷的量可能有所差异。例如，有研究报道，单半乳糖基二酰甘油（MGDG）平面脂膜的形成需要正癸烷，可能是由于锥形MGDG分子之间的缝隙被正癸烷分子填充所致。残留正癸烷是否对所研究的蛋白质产生影响完全是经验性问题，需通过实验验证其影响是否显著。
  6. 一旦膜趋于稳定，立即将含通道的囊泡0.5–1.0 μl通过P2移液器吸头的尖端精准注射至孔的正上方。囊泡将穿过孔洞沉降至杯底。
    在此过程中，多个囊泡会附着于跨孔的膜上。经过足够时间后，部分囊泡与双层膜融合，从而使少量KvAP通道正确插入膜中心区域的平面双层中。囊泡与脂双层的融合过程依赖于渗透压梯度和静电相互作用17, 24。
  7. 为检测双层膜中的KvAP通道功能，从–80 mV的保持电位施加一个+80 mV的短脉冲。由于通道具有快速失活和缓慢恢复的特性，两次脉冲之间需间隔较长时间（对于PE/PG膜中的通道约为120秒）。在POPE/POPG膜中通道的典型电流记录如图3C所示。若电流幅值较小，可再次注射更多囊泡。当电流幅值达到理想水平后，平衡膜两侧溶液的离子浓度。此时通道即可用于电生理实验。

3.2. 针对囊泡中通道的构象特异性配体筛选

  1. 噬菌体展示文库的引入
    噬菌体展示的20肽库位于丝状噬菌体fd-tet一端的五个pIII蛋白拷贝的N端 25. 文库包含约 1 x 108 不同类型的随机20肽序列，由美国德克萨斯大学西南医学中心Kathlynn Brown博士实验室惠赠 26噬菌体感染进入 E. coli K91使细菌对12 μg/ml四环素具有抗性。
    细菌培养、噬菌体的扩增与滴度测定以及噬菌体克隆测序的详细操作步骤已在McGuire的研究中进行了描述。 等 26 我们将在下一节简要描述基本操作。读者可在McGuire的论文中找到更多细节。本文将重点介绍能够紧密结合于囊泡中重建的离子通道的特定克隆的分离方法图 4A).
    我们筛选的基本原理在于，能够特异性结合重组通道的噬菌体可随囊泡一同被沉淀下来。结合的噬菌体可被扩增，并用于检测脂质膜中的通道蛋白。本研究探讨了KvAP电压感应器在不同脂质膜中的构象变化8 实验表明，通过将脂质从常规磷脂替换为头部区域不含磷酸基团的脂质（本实验中为DOTAP和DOGS），可使电压感受器分别稳定在“激活”或“静息”状态。这两种由脂质决定的构象被用于我们对构象特异性配体的筛选。首先，利用磷脂囊泡中的通道对噬菌体文库进行饱和处理（阴性筛选），随后筛选出能紧密结合DOTAP和DOGS膜中通道的高亲和力结合物（阳性筛选）。
  2. 噬菌体筛选背后的基本操作步骤
    K91细菌在LB培养基中的培养 细菌在37 °C、200 rpm振荡条件下的倍增时间约为20分钟。
    文库扩增： 将噬菌体溶液与OD600为0.4的K91细菌混合。在37 °C孵育15分钟后，将混合物均匀涂布于9.5 × 9.5英寸的琼脂平板上2 含有 12 μg/ml 四环素的琼脂平板，使用大平板可防止生长速率较高的细菌在培养物中占主导地位。当文库多样性较低时，使用直径 10 cm 的培养皿进行筛选和小规模扩增。
    大规模扩增单个克隆： 将少量噬菌体（约1亿）接种至250 ml LB培养基中，加入5 mM MgSO₄4 加入12 μg/ml 四环素，37 °C过夜培养。6,000 rpm离心10分钟收集菌体。收集上清液，并加入0.2体积的沉淀缓冲液（2.5 M NaCl，20% PEG8000）。冰上孵育1.0小时后，于17,000 × g离心30分钟以沉淀所有噬菌体。弃去上清液，加入1.0 ml PBS，冰上孵育30分钟，轻轻重悬沉淀（禁止涡旋）。将悬液转移至新离心管中，14,000 rpm离心2分钟。将上清液转移至另一管中，65 °C水浴孵育15分钟以灭活所有细菌。13,000 rpm离心2分钟，弃去沉淀，分装噬菌体溶液并保存于-80 °C。
  3. 在脂质囊泡中对 KvAP 通道进行噬菌体淘选。
    1. 展示肽段的噬菌体在实验前需要进行扩增和滴定，以确定单位体积内的噬菌体数量。KvAP被重组至POPE/POPG（3:1）并添加0.50% Biotin-DOPE的囊泡中作为阴性对照，而DOGS:biotin-DOPE（199:1；DOTAP囊泡也采用相同比例）则用作筛选靶标。囊泡中KvAP的最终浓度为0.50 mg/ml，脂质浓度为5.0 mg/ml。筛选缓冲液含有500 mM KCl、100 mM HEPES/KOH（pH 7.4）和0.10 mg/ml BSA。
      首次运行时，约1010 噬菌体（每种类型100个拷贝）被稀释至0.050 ml LB培养基中。在后续的筛选步骤中，起始噬菌体数量被调整至10以内6 至 108.
    2. 阴性筛选：
      将稀释后的噬菌体与100 μl NeutrAvidin琼脂糖微珠（每毫升树脂可结合1-2 mg生物素化BSA；Pierce）在1.0 ml淘选缓冲液中的50 μl LB中孵育。孵育10分钟后，以100 × g离心1.0分钟，分离微珠。重复此步骤两次，以去除直接与微珠结合的噬菌体。
      将上一步剩余的噬菌体与50 μl不含蛋白质的空脂质体（POPE/POPG加0.5%生物素化DOPE）混合。向该噬菌体-脂质体混合物中加入已用筛选缓冲液洗涤过的100 μl NeutrAvidin磁珠。室温旋转孵育5分钟后，以100 × g离心30秒去除磁珠。此步骤同样用于DOGS:生物素化DOPE（199:1）的空脂质体，以及含有0.5%生物素化DOPE的POPE/POPG脂质体中的KvAP通道。经上述处理后的上清液即为完全去除非特异性结合噬菌体的预清除噬菌体。在完成前两轮筛选循环后，预清除步骤可仅针对POPE/POPG脂质体中的KvAP通道进行。
    3. 阳性选择
      将完全清除的噬菌体与KvAP通道在DOGS : biotin-DOPE（199:1）囊泡（与DOTAP囊泡处理相同）中于室温下孵育10分钟，同时加入100 μl NeutrAvidin磁珠。孵育后用铺板缓冲液将混合物体积调至15 ml，随后在100 × g条件下离心10分钟。收集磁珠，并用45 ml铺板缓冲液洗涤三次。
    4. 将珠子重悬于500 μl含有5.0 μg/ml生物素的LB培养基中，室温孵育两小时，以释放部分与NeutrAvidin结合的噬菌体（NeutrAvidin对生物素的亲和力低于天然亲和素）。以100 × g离心1分钟分离珠子。将上清液和珠子分别收集至两个不同的离心管中用于滴度测定。
    5. 为扩增所选噬菌体，将上清液或上一步中重悬的磁珠200 μl与500 μl K91菌液（O.D.600 ~ 0.4–0.6，使用前约培养4小时）混合。37 °C孵育15分钟后，取每种混合液50 μl涂布于含四环素的平板，过夜培养。
      在前两个筛选周期中（图4A），收集上一步的全部500 μl上清液和磁珠，将其与5 ml细菌培养物混合，接种于9.5英寸方形培养皿中，以回收并扩增所有噬菌体克隆。此步骤对于回收那些使细菌生长速度较其他噬菌体更慢的噬菌体至关重要。
    6. 平板上的菌落经扩增和滴定后，再进行下一轮淘选和筛选（参见 McGuire， 等, 26).
    7. 检测经正向筛选获得的噬菌体对通道的作用活性。
      经过10-12轮筛选后，检测总扩增噬菌体在由POPE/POPG制备的脂双层中的KvAP通道上的作用。如果有相当比例的阳性克隆，则在100-500 nM浓度下筛选得到的噬菌体应能阻断脂双层中相当比例的通道图4B）因为我们是在筛选处于静息状态的通道蛋白。阳性结果表明，存在能够强烈结合静息状态通道的克隆。经过16轮筛选后，挑选50个阳性菌落进行单菌落测序。通过序列比对筛选出优势噬菌体克隆，扩增后在双分子层中检测其与通道蛋白的结合能力。在确认阳性克隆后，合成这些强阳性克隆所携带的肽段，并在通道蛋白上进行测试，以验证其构象特异性活性。

3.3. 用于结构测定的膜中KvAP通道的结晶 27-29

  1. 为了稳定通道的构象，使用通道的构象特异性结合剂——33H1 Fv 蛋白，形成 KvAP/Fv 复合物。Fv 蛋白的制备详见方框 2。使用 Superdex 200 柱对复合物进行纯化。在本系统中，该复合物的洗脱体积约为 11.4 ml。
  2. 在初步筛选中，将蛋白与完全溶解于 DM 或 β-OG 中的 DMPC 或 POPC 混合。蛋白/脂质/去垢剂混合物需混合超过 15 小时，以使三种组分在混合胶束中达到热力学平衡。通常我们首先测试三种不同的脂质/蛋白比例（LPR = 0.5、1.5、2.5）和三种不同的 pH 值（6.0、7.0 和 8.0）。透析缓冲液包含 20 mM K-磷酸盐缓冲液、100 mM KCl 和 3.0 mM NaN3。透析缓冲液每 2–3 天更换一次。每隔 2–3 天取少量晶体样品，观察囊泡的形成以及可能的晶体晶格出现情况。
    采用 LPR 与 pH 的简明对照表，以确定蛋白在两种不同类型脂质中的行为。通过负染电镜观察透析样品时，我们希望获得相对较大尺寸（大于 150 nm）的囊泡或膜片。膜中出现的小而规则的图案提示可能为阳性结果，可用于指导后续优化。
    负染电镜：使用碳膜（厚度约 3–5 nm）包被的铜网，在空气中辉光放电以使碳膜表面亲水化。取少量（2–3 微升）晶体悬液滴加至碳膜表面，孵育 0.5–1.0 分钟。用撕边的 Whatman #4 滤纸从侧面吸去多余液体。翻转铜网，将其置于一滴 150 微升染色液（2.0% PTA/KOH，pH 8.0 的水溶液，含 0.5% 海藻糖；或 6.0% 钼酸铵/KOH，pH 6.3–6.5 的水溶液，含 0.5–1.0% 海藻糖）上方，孵育约 15 秒。尽可能吸干铜网表面的液体，待其干燥后插入透射电镜进行观察。在低剂量条件下拍摄囊泡图像，以避免电子束对任何晶体排列造成损伤。
  3. 随后扩大筛选范围，以更小的 LPR 步长进行测试，从而确定最佳 LPR。若蛋白适合结晶，则膜中可能出现微小的蛋白晶格。在这些初步条件基础上，进一步优化结晶条件，包括盐种类与浓度、温度、去垢剂去除的速度与方法、二价阳离子、用于蛋白制备的去垢剂、沉淀剂、脂质组成等。
    优化后的 KvAP∆36/Fv 复合物二维晶体可生长为大片层结构，尺寸从数微米到 20–30 微米不等（图 5A）。在冷冻电镜条件下，晶体显示出清晰的方形晶格，具有如预期的四重对称通道所对应的明显四重对称性（图 5B 和 C）。

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结果

纯化KvAP通道至生化均一性的实验总体流程如图1A所示。图1B中的SDS-PAGE凝胶展示了蛋白表达与纯化过程中各阶段的典型样品。经IMAC纯化后的蛋白纯度已相对较高。KvAP通道的得率约为1.0 mg/升培养液。

脂质囊泡的去垢剂溶解需要针对每一种脂质与去垢剂的组合进行优化。POPE/POPG小单层囊泡被DM溶解的过程如图2A所示，囊泡漂浮实验的结果通常较为明确。梯度组分经SDS-PAGE分析的典型结果如图2B所示。在蔗糖密度梯度中，含有通道蛋白的POPE/POPG囊泡通常富集于10%层与35%层之间的界面处。含有KvAP的DOTAP或DOGS囊泡密度较轻，通常位于5%与10%层之间的界面（轻微渗入10%层）。如果存在较大量的多层囊泡，则通常呈现乳白色，并富集于10%-35%界面下方。我们发现，这种情况通常发生在蛋白-去垢剂-脂质混合物孵育时间不足、未能实现脂质良好分布时。

在平面脂双层中嵌...

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讨论

将KvAP通道重构到不同膜中的方法已在多项研究中被采用8-10。基于确保脂质在去垢剂/脂质混合胶束与蛋白/去垢剂/脂质混合胶束之间充分分布的思路，我们能够实现KvAP几乎完全地重构到由差异显著的脂质组成的膜中。每个四聚体KvAP通道需要约100个脂质分子以完全覆盖其跨膜结构域。关键要求是在去除去垢剂之前，允许足够数量的脂质分子融合进入蛋白/脂质/去垢剂胶束。我们的标准条件（0.5 mg蛋白和5.0 mg脂质）可确保平均每分子蛋白对应约1,000个脂质分子。浮力实验和生物化学实验结果证实，该重构过程几乎完全。将通道插入黑脂膜后进行的电生理记录、利用噬菌体展示肽库对重构通道进行筛选，以及在膜中生长通道的二维晶体，均展示了膜重构技术在多种应用中的成功实现。

KvAP通道的脂质依赖性构象变化以及针对噬菌体展示肽库的筛选，展示了一条通过生化方法筛选通道阻滞剂或通道激活剂的新途径，而无需依赖电生理学手段来维持通道的特定构象8。我们成功筛选出构象特异性结合分子的结果表明，相同策略可用于寻找激活态构象的特异性结合分子。可以预见，将重构于囊泡中的通道用于单...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

姜实验室在KvAP方面的研究得到了洛克菲勒大学Roderick MacKinnon博士实验室的大力支持。特别感谢Kathlynn Brown博士和Michael McQuire在噬菌体筛选实验方面提供的建议和帮助。本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH，项目号GM088745和GM093271，授予Q-XJ）以及美国心脏协会（AHA，项目号12IRG9400019，授予Q-XJ）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胰蛋白胨RPI Corp.T60060
酵母提取物RPI Corp.Y20020
NaClFisherS271-3
Tris 碱RPI Corp.T60040
氯化钾FisherBP366-500
n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷AffymetrixD322S溶剂级
n-辛基-β-D-葡萄糖苷AffymetrixO311分析级
抑肽酶RPI Corp.A20550-0.05
亮抑蛋白酶肽RPI Corp.L22035-0.025
胃蛋白酶抑制剂 ARPI Corp.P30100-0.025
PMSFSIGMAP7626
DNase IRoche13407000
Bio-Bead SM-2Bio-Rad152-3920
HEPESRPI Corp.H75030
POPEAvanti Polar Lipids850757C
POPGAvanti Polar Lipids840457C
DOGSAvanti Polar Lipids870314C
DMPCAvanti Polar Lipids850345C
生物素-DOPEAvanti Polar Lipids870282C
DOTAPAvanti Polar Lipids890890C
NeutrAvidin 琼脂糖微珠Piercenet29200
透析袋Spectrum Laboratories, Inc132-570
戊烷FisherR399-1
癸烷TCI AmericaD0011
MTS-PEG5000Toronto Research CemicalsM266501

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