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方法文章

果蝇酒精给药装置：FlyBar

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DOI：

10.3791/50442

⸱

2014年5月18日

 ,  ,  , 
1Department of Biological Science, Florida State University, 2Department of Biology and Biochemistry, Biology of Behavior Institute, University of Houston

本文内容

摘要

Drosophila 已成为解析酒精行为反应的细胞与分子机制的重要模式系统。本文介绍了一种在昼夜节律背景下收集酒精敏感性数据的实验方案，该方法可轻松应用于其他实验，且非常适合本科生科研。

摘要

果蝇（Drosophila melanogaster）是酒精研究和昼夜节律生物学中公认的研究模型。最近，我们发现昼夜节律钟调控酒精敏感性，但不影响耐受性的形成。本文中，我们将详细描述我们的实验方案。使用 FlyBar 向果蝇施加酒精。在此装置中，饱和酒精蒸气与加湿空气按设定比例混合，并同时输送至四个试管中的果蝇。果蝇在标准化条件下培养，以最大限度减少重复实验之间的变异。实验通常采用不同基因型或经不同处理的3日龄果蝇，最好匹配两个不同时间点（例如，CT 5 和 CT 17）的果蝇，以便进行直接比较。实验期间，果蝇暴露于预设浓度的酒精蒸气中1小时 ，每5分钟记录一次失去翻正反射（LoRR）或进入镇静状态的果蝇数量。数据可通过三种不同的统计方法进行分析。第一种方法是确定50%果蝇失去翻正反射所需的时间，并通过方差分析（ANOVA）判断不同时间点之间是否存在显著差异。第二种方法是计算在指定分钟数后显示LoRR的果蝇百分比，随后进行方差分析。最后一种方法是使用多元统计方法对整个时间序列数据进行分析。该方案也可用于非昼夜节律相关的实验或不同基因型之间的比较。

引言

黑腹果蝇 展示对酒精的双相行为反应1 与人类对该药物的反应相似2,3初次接触低浓度酒精时，果蝇表现出运动活动增加；随着酒精暴露的持续，这种状态逐渐转变为运动协调能力丧失、姿势控制能力下降以及翻正反射消失（翻正反射消失：LoRR），最终进入镇静状态（即在机械刺激下完全丧失运动反应）。4-9内源性生物钟是酒精敏感性和毒性的强效调节因子，这一点已在小鼠中得到证实。10,11大鼠12和人类13. 近期在 果蝇 研究表明，昼夜节律钟调节急性酒精敏感性，但不调节酒精耐受性1. 可用于的强有力遗传学方法 果蝇 通过突变体研究以及对基因表达时空模式的转基因操控，提供了一个能够快速推进复杂行为背后细胞与分子机制研究的系统。该方法的利用 果蝇 作为一种研究工具，已促进了对酒精神经生物学的深入理解，并可迅速将研究成果转化为哺乳动物的相关应用14-16为了促进对昼夜节律钟调控酒精敏感性分子机制的理解，并在不同昼夜时间点统一测量行为反应，需要建立一种适用于暗红光条件下进行酒精给药的实验方案。 果蝇，酒精可通过食物补充的方式进行长期暴露，或通过酒精蒸气形式给药以实现可靠的急性暴露。本文介绍了一种适用于评估昼夜节律对翻正反射丧失（Loss-of-Righting Reflex, LoRR）调节作用的酒精给药方案1 以及镇静作用。

果蝇在恒定温度下经12小时光照：12小时黑暗（LD）周期同步化后，转移至受控光照条件下继续培养2-5天。 天，具体取决于实验问题。果蝇在一种名为 FlyBar 的装置中暴露于乙醇蒸气。  在此装置中，定量的空气通过水和酒精鼓泡，产生的蒸气随后混合并导入盛有果蝇的样品管中。每隔5 分钟 记录果蝇中未能表现出翻正反射或已进入镇静状态的个体数量。计算每个时间点的LoRR（丧失翻正反射）百分比，并在不同昼夜节律时间点或不同果蝇品系之间进行比较。FlyBar酒精递送系统在酒精给药方面的简便性与可靠性，结合行为学分析的多种选项，为在黑暗条件下开展的昼夜节律实验提供了显著优势。

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方案

1. 果蝇饲养装置（FlyBar）的组装

原理与概述：该系统旨在向果蝇输送可控浓度的酒精蒸气。注：图1展示了FlyBar装置的示意图，其组装过程如下所述分为三个阶段（气流系统的组装、酒精瓶和水瓶的设置、观察管的组装）。简而言之，稳定的气流被分为两部分，分别通过酒精和水进行鼓泡，随后混合，并输送至4个观察管中。

  1. 气流系统的组装
    1. 将一段短的柔性硅胶管连接到建筑物供气系统或水族箱曝气器上，以产生稳定的气流，并通过Y型连接器分流。将第一分支连接至气流调节器，该调节器用于控制通过系统的总气流量（通常情况下，4个观察瓶为1,000 ml/min）。
    2. 在第二根管路上安装一个快速接头，以便在实验开始时可中断气流，而不影响已校准的气流。添加一个Y型连接器，并将每条分支管路连接至各自的气流调节器。
    3. 将管路连接至气流调节器，然后连接两个气流计。
  2. 酒精瓶与水瓶的设置
    1. 在气流计出口处连接柔性管路，并在每段管路末端插入一根带90°弯头的细玻璃管（可使用1 ml玻璃移液管的截段），作为通入酒精瓶和水瓶的进气管。
    2. 将带有两个孔的橡胶塞插入盛有酒精和水的瓶子中。使用水浴将两个瓶子维持在比环境空气温度高2°C的恒定温度。在我们的实验中，环境室温保持在25°C，而水浴温度为27°C。
    3. 将直玻璃移液管作为进气管穿过橡胶塞，并伸入液体中，直至距离瓶底约1 cm处。
    4. 将一段弯头玻璃移液管插入橡胶塞的另一个孔中，使玻璃管末端与塞子内侧底部齐平。将此出气管接入另一段管路中。
    5. 使用Y型连接器合并气流，并用另一段硅胶管将混合后的气流导入一个空的混合烧瓶或瓶子中，该瓶配有插入双孔橡胶塞的弯头玻璃管段。使用另一段硅胶管作为混合气流的出口。
  3. 观察瓶的组装
    1. 将来自混合烧瓶的出口气流分叉2–3次，得到4或8股较小的气流，以便在每次实验中使用多个观察瓶。将柔性硅胶管连接至观察瓶。
    2. 使用空瓶并用带有两个孔的橡胶塞密封，通过玻璃管分别提供酒精蒸气的进气口和出气口，以此搭建观察瓶系统。
    3. 用网状材料覆盖第一根玻璃管的末端，并用一小段柔性塑料管固定网状物。将该管插入第一个孔中，使其延伸至瓶身约一半长度的位置。如有需要，可使用聚四氟乙烯（Teflon）胶带确保密封紧密。
    4. 将第二根玻璃管（末端同样覆盖网状物）插入另一孔中，直至其末端与橡胶塞内侧边缘齐平。
    5. 将观察瓶水平放置在一张白纸上，以在微弱红光条件下最大限度增强果蝇的视觉对比度。
    6. 混合经过酒精鼓泡和经过水鼓泡的气流至适当比例。持续监测气压，并根据需要进行调整，以维持气流的预期混合比例。
      注意：在小房间内并行运行多个Fly Bar实验，甚至单独运行一个实验，都可能导致酒精蒸气明显积聚。为避免在密闭空间内持续释放可能影响研究人员的酒精蒸气，必须建立适当的系统，有效清除实验过程中产生的酒精蒸气。为去除酒精蒸气，可在每个观察瓶伸出的第二根玻璃管上连接一段6–12英寸长的管路，将所有管路捆扎后导向一个漏斗-真空系统。研究人员还应确保实验测试房间具备足够的通风条件。

2. 实验动物的准备

实验原理与概述：对果蝇进行恰当的培养和饲养可减少实验数据的变异性。这通过标准化操作并尽量减少果蝇所受应激来实现。因此，在本实验方案的任何步骤中均不使用麻醉剂（如 CO2 或其他替代物）。此外，为了最大程度降低变异，不同实验及时间点所用果蝇应保持年龄一致，这与其他行为学分析（包括学习与记忆实验）的标准操作一致17。

不同的光暗条件可用于探究昼夜节律钟在乙醇行为反应中的功能。为了确定是否存在昼夜节律，可在特定的明暗循环（LD循环）条件下进行实验，以测定特定授时时间（Zeitgeber Time, ZT）下的表现。ZT 0 代表黎明，定义为LD循环中光照开启的时刻，而ZT 12 则对应光照关闭的时间（采用12小时光照:12小时黑暗的循环）。在恒定条件下，生物钟时间（Circadian time, CT）用于衡量动物在缺乏外界环境信号情况下的内在时间进程。 即 自由运行时间，且与先前的光暗同步周期相关。在野生型中 果蝇在恒定条件下，最初的几天内，CT 反映了之前的 ZT，因为自由运行的昼夜节律周期和节律约为 24 小时。为了测量昼夜节律的调节作用并消除光对行为的急性影响，果蝇首先被驯化于明暗周期（light:dark cycles）中，然后在实验前转移至恒定黑暗条件（DD）。昼夜节律实验在进入 DD 后的第二天进行，以测量特定昼夜时间（Circadian Times, CT）下的表现。

在Drosophila中，持续光照（LL）条件会导致昼夜节律功能障碍，表现为核心昼夜节律基因的分子振荡减弱或消失，并破坏行为节律，表现为无节律的运动活动18-21以及无节律的短期记忆17。该方案已针对昼夜节律研究进行优化，也可根据需要简化用于其他实验。所有昼夜节律实验均在微弱红光条件下进行（实验台上方环境红光< 1 勒克斯；在距离试管约12英寸处使用的小红灯光照强度约为1勒克斯）。

  1. 在 25 °C 下，以 12:12 小时明暗循环条件（LD）饲养果蝇。
  2. 在第 1 天光照期结束时收集新羽化的果蝇，并在含有少量高浓度琼脂食物的培养管中继续于 LD 条件下存放 24 小时，以减少食物黏附。注意：为确保收集到健康且正常发育的果蝇，仅使用在培养瓶中开始羽化后的最初几天内收集的果蝇。
  3. 在第 2 天接近光照期结束时，使用吸虫器收集约 30 只（25–35 只）果蝇，并转移至新的培养管中。
  4. 使用强光源将果蝇驱赶至培养管远端。在此范围内，每管中果蝇的确切数量并不关键，因为行为观察结果将以百分比形式报告，并在每次实验结束时统计果蝇总数。
  5. 将果蝇在 25 °C 下持续置于恒暗条件（DD）中维持两天。
  6. 在实验当天，将所有饲养在非实验行为室环境或其他培养箱中的果蝇提前至少 1 小时转移至实验行为室内。适应环境可减少因温度或湿度变化引起的实验变异性。
  7. 每天在六个时间点（CT 1、5、9、13、17 和 21）进行观察，以检测行为的昼夜节律调控。
  8. 在单次行为实验中比较多个时间点的数据，以增强实验设计的稳健性，并降低单次实验特有的变异性。例如，若使用两个明暗周期相反的培养箱进行同步驯化，则可同时获得 CT 1 和 CT 13 的观察数据。
    注意：上述步骤描述了在恒暗昼夜节律条件下进行行为检测的实验动物准备流程。也可采用不同的明暗条件，以探究生物钟在酒精行为反应中的功能。若需确定是否存在日节律，可在 LD 循环条件下进行实验，以在特定授时时间（ZT）测量行为表现。此外，本方案也可用于在持续光照条件下饲养的果蝇，以开展昼夜节律功能障碍的相关实验。对于在光照条件下饲养果蝇的替代方案，行为检测仍应在黑暗环境中进行。实验前应将果蝇提前转移至黑暗环境中至少 1 小时，以最大限度减少光对行为的急性影响所导致的行为变异性。

3. 行为观察

原理与概述：以下酒精给药方案经过优化，适用于在暗红光条件下进行观察。两种行为学指标——失去翻正能力（LoRR）和镇静状态——代表了果蝇醉酒过程中的两个不同阶段。LoRR 代表较晚期的醉酒状态，表现为运动能力和姿势控制的丧失；而镇静则衡量的是中毒过程的极晚期终点。不同基因型或昼夜节律的调节可能对这两个指标产生不同影响；因此，建议同时检测两者。简而言之，将果蝇装入试管中，在酒精蒸气暴露期间每 5 分钟记录一次表现出 LoRR 或镇静状态的果蝇数量，并在实验结束时统计果蝇总数。

  1. 开始实验前，让空气通过系统（空气依次通过水瓶和酒精瓶）至少运行10分钟，并利用这段时间校准气流。
  2. 断开快速接头以停止气流。将果蝇装入小瓶中，重新连接气流并启动计时器。注意：如果发现滞留小瓶中的果蝇反应迟钝或死亡，可能表明存在应激条件。通常可通过减少每只滞留小瓶中的果蝇数量，或在配制食物时略微提高琼脂浓度以降低食物黏性来缓解此类情况。为获得准确的行为学分析结果并尽量减少实验间差异，实验前果蝇应保持健康状态。
  3. 为精确计时，使用一个计时器记录酒精暴露的总时间，并使用第二个倒计时器标记每5分钟的时间间隔。
  4. 在小瓶下方放置一张白纸，以增强对比度和果蝇的可见性，尤其是在暗红光条件下。
  5. 实验过程中应定期检查气流，以维持气流稳定。通常情况下，一旦气流达到稳定状态，在整个实验期间将保持稳定。
  6. 在1小时的暴露期内，每5分钟记录一次失去翻正反射的果蝇数量。由于不同基因型和遗传背景的果蝇对酒精的敏感性存在差异，可能需要更频繁地进行评估，或延长实验持续时间。
  7. 将小瓶轻轻从台面上抬起，用手电筒发出的红光照射小瓶后方的白纸。手持红光手电筒与实验小瓶之间的距离应至少保持12英寸（约30厘米），以确保所有在暗红光条件下进行的实验光照强度不超过1 lux。
  8. 使用照度计测量光照强度，为所有实验建立统一的标准。
  9. 通过用力轻敲小瓶，观察果蝇是否能在约4秒内恢复直立姿态，以此判断失去翻正反射（LoRR）的果蝇数量。显示LoRR的果蝇可能仍会活动腿部或翅膀，但无法自行翻转至正常体位。
  10. 实验结束时，统计每只小瓶中果蝇的总数。
    注意：偶尔在将果蝇装入实验小瓶时，可能会有单只果蝇卡在塞子与瓶壁之间。由于操作在黑暗中进行，这种情况不易察觉，因此实验结束后必须统计果蝇总数，以便准确计算百分比。

此外，该方法也可用于测量果蝇的镇静状态，这是一种不同的行为终点。当果蝇失去翻正反射时即处于镇静状态，但达到镇静需要更高的酒精暴露剂量。从行为学上看，镇静表现为果蝇在受到试管剧烈轻敲后仍完全缺乏可观察到的运动活动，并在试管内保持静止不动。对于镇静的判断，应计数在剧烈轻敲试管后仍保持静止且无腿部摆动的果蝇数量。此外，还可将试管左右滚动，以判断单个果蝇是否仍保留抓附反射。

4. 数据分析

  1. 根据每个小瓶中果蝇的总数，确定在每个评估时间点失去翻正反射（LoRR）的百分比。
  2. 通过计算每份样品在S型曲线线性部分内的50% LoRR值，来估算不同昼夜节律时间点或品系之间的差异（见下文图2）。
  3. 替代性统计方法：
    1. 若计划对不同基因型进行比较，建议使用重复测量方差分析（repeated measures ANOVA）分析整个时间过程，并通过事后检验确定差异具有统计学意义的时间点范围（图3）。对于这些检验，我们倾向于采用显著性水平α值为0.001。该方法既可评估特定暴露时间点的差异，也可评估基因型间曲线斜率的差异。
    2. 可通过图形线性部分（图4）分析在特定酒精暴露时间下对某一反应（如镇静）的敏感性差异。
    3. 可使用标准F检验统计量及事后检验来估算不同品系或昼夜节律时间点之间的差异。

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结果

利用50%丧失翻正反射作为标志物研究酒精敏感性的昼夜节律调节。

一个展示昼夜节律对酒精敏感性调节的代表性示例如下所示 图2. 在6个时间点测量LoRRnd DD天在Canton-S中的时间点以及每个时间点的50% LoRR被确定。分析显示时间点具有显著效应（ANOVA：F5,45=7.39, p<0.001，每个时间点 n=6-10）。Fisher LSD 检验显示 CT1 与 CT5、CT5 与 CT13、CT5 与 CT17、CT5 与 CT21、CT9 与 CT13、CT9 与 CT17，以及 CT9 与 CT21 之间差异具有显著性。该结果与我们先前发表的结果一致1.

野生型与突变型果蝇之间的差异。

第二个示例使用时间序列来展示野生型 Canton-S 果蝇与携带功能缺失突变的果蝇在 LoRR 和镇静反应上的差异 白色 突变...

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讨论

酒精滥用和酒精依赖给社会带来的代价巨大，无论是在人类29还是经济方面30,31。Drosophila 作为一种模型，提供了一个快速且多功能的系统，可用于快速检测大量个体的行为反应，因此已被广泛应用于酒精相关研究5,7,32-34和昼夜节律研究35-37。

本文介绍了一种在昼夜节律条件下对成年果蝇进行可控酒精蒸气暴露的简便实验方案。

在标准化条件下培养的果蝇暴露于酒精蒸气中1 hr 内每 5 分钟记录一次失去翻正反射的果蝇数量 最小。本文所述方案针对昼夜节律实验进行了优化，因其额外需要在恒定条件下进行同步化和饲养。对于常规研究，可通过去除昼夜节律实验所必需的步骤（例如在黑暗中存放至少一天，或在微弱红光条件下进行实验）来简化多个步骤。本方案也可用于以受控方式使大量果蝇暴露于不同浓度的酒精，以便后续进行生物化学或分子分析。为与其他研究保持一致 果蝇 行为学实验，例如学习与记忆观察，即使在非昼...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。 

致谢

本研究的资金由佛罗里达州立大学医学院神经科学项目奖以及佛罗里达州立大学生物科学系的支持提供。  额外资金由酒精饮料制造商研究基金的援助金提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
190度酒精多种品牌
曝气器当地宠物商店我们使用Whisper 60
1/8”硅胶管VWR408060-0030
120° Y型连接器VWR82017-256
快速接头VWR46600-048
塑料管夹Bell-art产品132250000以下两者任选其一
微型空气调节阀McMaster-Carr8727K11以上两者任选其一
微型空气调节阀安装支架McMaster-Carr9891K66
Gilmont 12号流量计VWR29895-242
工具夹McMaster-Carr1722A43用于固定流量计
小瓶VWR89092-722
带两个孔的橡胶塞VWR59585-186适用于小瓶
5 mm Pyrex玻璃管TrikineticsPGT5x65最适配上述橡胶塞
聚四氟乙烯胶带五金店必要时用于在橡胶塞中实现紧密贴合
带两个孔的橡胶塞VWR59582-122适用于我们的瓶子
一次性玻璃移液管VWR53283-768按需截断并加热弯曲
极细尼龙网VWR多种品牌
15瓦灯泡五金店顶部红光照明
摄影用红色安全灯滤光片顶部红光照明
带红色滤光片的迷你手电筒Mag-light

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