RNAi介导的双基因敲低及蜜蜂（Apis mellifera）味觉感知测量

摘要

在本实验方案中，我们描述了两种在蜜蜂中同时抑制两个基因（双基因敲低）的策略。随后，我们介绍了如何利用吻伸反应（PER）实验来研究双基因敲低对蜜蜂味觉感知的影响。

摘要

本视频演示了利用双链RNA（dsRNA）注射在蜜蜂中同时下调两个基因的新型RNA干扰（RNAi）技术。同时介绍了用于测量味觉感知的喙伸展反应（PER）实验方案。

RNAi介导的基因敲低是一种有效降低靶基因表达的技术。该技术通常用于单个基因的操作，但在检测基因间的相互作用和协同效应方面存在局限性。在本视频的第一部分，我们介绍了两种同时敲低两个基因（称为双基因敲低）的策略。我们展示了这两种策略均能有效抑制两个处于调控反馈回路中的基因——卵黄原蛋白（vg）和超螺旋（usp）。这种双基因敲低方法可用于解析基因之间的相互关系，并可广泛应用于不同昆虫物种中。

本视频的第二部分演示了在蜜蜂经过双重基因敲降处理后，进行喙伸展反应（PER）检测的操作过程。PER检测是测量蜜蜂味觉感知能力的一项标准测试，该能力是预测蜜蜂行为成熟速度的关键指标。蜂巢内蜜蜂的味觉感知能力越强，表明其行为发育程度越高，通常表现为更早开始采集行为，并倾向于专一性地采集花粉。此外，PER检测还可用于判断蜜蜂的代谢状态，如饱腹或饥饿状态。最后，将PER检测与不同气味刺激配对以训练蜜蜂的方法，也广泛应用于蜜蜂学习与记忆的研究中。

引言

RNA干扰（RNAi）是一种基于RNA的转录后基因沉默机制，存在于多种真核生物中。RNAi过程由内源性或外源性的双链RNA（dsRNA）前体触发。dsRNA会激活核糖核酸酶蛋白Dicer，该蛋白结合并切割dsRNA，产生小片段（20-25 bp）。随后，这些dsRNA的小片段通过Argonaute蛋白引导RNA诱导沉默复合物（RISC）识别并切割互补的mRNA，其中Argonaute蛋白是RISC的催化组分¹。在哺乳动物中，长度超过30 nt的dsRNA会激活抗病毒反应（干扰素反应，IFN），导致RNA转录本的非特异性降解²。然而，由于昆虫缺乏这种干扰素反应，长dsRNA在昆虫中已被证明具有高效性和特异性³。

长片段双链RNA（dsRNA）已被用于在不同昆虫物种中下调靶基因的表达。蜜蜂是最早利用dsRNA揭示发育和行为中多个重要基因功能的昆虫之一^4,5。在蜜蜂中已采用多种dsRNA递送方法：饲喂dsRNA可有效下调蜜蜂幼虫中靶基因的表达⁶，而注射dsRNA则是蜜蜂胚胎⁴和成虫^7,8基因沉默的有效手段。

通过向昆虫施用dsRNA所表现出的基因敲低效应是短暂且局部的。研究表明，向腹部注射dsRNA或向胸部注射dsRNA均能有效抑制昆虫腹部脂肪体细胞中靶基因的表达^9,10。将dsRNA注入腹部和胸部体腔后，脂肪体细胞可从细胞所处的血淋巴中摄取dsRNA¹⁰。然而，无论是腹部注射还是胸部注射，均无法靶向其他器官（如卵巢和脑）中的基因。为了靶向蜜蜂脑中的基因，已有研究实施了向脑内直接注射dsRNA的方法，该方法可有效影响局部脑区中靶基因的表达¹¹。本文仅记录在成年蜜蜂中更为常用的腹部dsRNA注射方法。

RNAi 主要用于靶向单个基因，是揭示基因功能的有力工具。然而，任何基因都不是孤立存在的，而是处于复杂的调控网络之中。理解一个生物过程的关键在于解析基因之间的相互作用，这需要同时操控多个基因，而不仅仅是单个基因的敲低。在哺乳动物细胞系中，科学家已通过递送系统成功实现了对两个或三个基因的同步抑制。 ¹² 或多重microRNA（miRNA）发夹结构设计 ¹³但在昆虫中，多重基因敲降仍未得到验证。本文中，我们介绍了可实现双重基因敲降的不同注射策略。我们靶向两个基因：卵黄原蛋白（vg)，编码卵黄蛋白前体，以及ultraspiracle（usp）该基因编码一种幼年激素（JH）的假定受体，可能作为转录因子介导对幼年激素的响应 ¹⁴ 在蜜蜂中，Vg 和 JH 通过反馈环路相互调控 ¹⁵ 并参与蜜蜂行为调控 ⁹. 通过双重基因敲低，我们同时干扰 Vg 和 JH 通路，揭示二者如何共同影响蜜蜂的行为与生理，以及它们之间的相互作用机制 vg，usp 以及 JH 相互作用 ⁹.

味觉感知是预测蜜蜂社会行为的一种行为学指标¹⁶。在行为发育方面，具有较高味觉感知能力的巢内蜂行为成熟较快，通常在生命早期就开始外出采集，并偏好收集花粉^16,17。尽管味觉感知背后的调控机制尚不明确，已有研究表明味觉感知与内部能量代谢⁹、激素分泌^18,19以及生物源性胺通路²⁰相关。Vg 和 JH 均是调节味觉感知的重要激素因子^7,21。在实验室中，可通过检测蜜蜂对不同蔗糖溶液的喙伸展反应（PER）来评估其味觉感知的差异。测试时，依次用一滴水接触每只蜜蜂的两根触角，随后使用浓度递增的蔗糖溶液（0.1%、0.3%、1%、3%、10%、30%）进行测试。当水滴或蔗糖溶液接触触角时，若蜜蜂完全伸展出其喙，则记为一次阳性反应。根据个体对各溶液产生阳性反应的次数，即可确定其味觉感知水平¹⁶。然而，PER 方法的应用不仅限于测量味觉感知。PER 还可用于检测蜜蜂的代谢状态，例如饱食与饥饿状态的比较。通常情况下，对蔗糖反应更强的蜜蜂更处于饥饿状态（Wang 和 Amdam，未发表数据）。此外，PER 范式还可用于研究蜜蜂的关联学习与记忆。在此类实验中，蜜蜂将被训练以将蔗糖水的存在与某种气味关联起来。当蜜蜂学会这种关联后，仅呈现该气味即可引发阳性喙伸展反应，而无需再提供蔗糖奖励^22,23。在本视频中，我们将展示如何实施 PER 实验，以评估味觉感知，此前的研究已将该表型与vg 和 usp 双基因敲低相联系⁹。

方案

第一部分：RNAi介导的双基因敲低

1. 双链RNA合成

1. 设计靶向双链RNA的引物 vg, usp 以及一个编码绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）的对照基因（GFP）该序列不在蜜蜂基因组中：引物使用在线免费软件 Primer3 设计http://frodo.wi.mit.edu/).
2. 用于dsRNA合成的 vg，usp 和 GFP：使用 Promega 的 RiboMax T7 RNA 合成系统进行 体外 转录
3. dsRNA 纯化：
   1. 变性与复性：将dsRNA在85 °C加热5分钟，然后在室温下冷却1小时。
   2. DNase I 处理：向每个 dsRNA 反应体系中加入 1 μl DNase I，通过轻弹管壁混匀。37 °C 孵育 15 分钟。
   3. 向每个反应中加入 150 μl 无核酸酶水和 750 μl TRizol-LS，通过轻轻颠倒试管充分混匀。将样品在 30 °C 下孵育 5 分钟。
   4. 向每个样品中加入 200 μl 氯仿，剧烈混合 20 秒。在 4 °C 条件下以 12,000 x g 离心 15 分钟。
   5. 将上清液转移至各新试管中，向每管加入500 μl异丙醇。通过倒置试管混匀。在-20 °C下孵育20分钟。在4 °C下以12,000 x g离心10分钟。
   6. 弃去上清，加入1,000 μl 75%乙醇洗涤沉淀。将离心管在4 °C、7,500 × g条件下离心5 min后，将双链RNA（dsRNA）沉淀室温晾干，再用无核酸酶水溶解沉淀。为确保基因下调效果，dsRNA浓度应约为9–10 μg/μl。

2. 双链RNA腹部注射

对于双基因敲低，有两种策略：1）单次注射：将两个基因的dsRNA混合后注射混合物；2）两日注射：第一天注射靶向一个基因的dsRNA，第二天在同一蜜蜂中注射第二个dsRNA。

1. 将新羽化的蜜蜂置于4 °C冰箱中冷却1-2分钟。当蜜蜂被固定后，用昆虫针将3-4只蜜蜂并排固定在装满固体石蜡的培养皿上，昆虫针应穿过其腹部与胸部之间。
2. 再次将蜜蜂置于4 °C冰箱中冷却，确保蜜蜂完全无法活动，约需1-2分钟。此时蜜蜂应呈现松弛状态。若蜜蜂身体卷曲或扭曲，表明冷却时间过长，应避免此情况。过度冷却会导致高死亡率，但完全固定至关重要，因为任何活动都会扩大伤口并增加死亡风险。
3. 将一次性30 G针头（BD）安装在Hamilton微量注射器上。吸取3 μl的dsRNA，并确保注射器内无气泡。将针头插入腹部侧面，以避免损伤内部器官。缓慢推动注射器推杆，使dsRNA被逐渐吸收。由于dsRNA黏度较高，完全排出需时2-3秒。在完全推下推杆后，将针头在伤口中停留4-5秒。注射后观察蜜蜂3-5秒，若发现血淋巴从伤口渗出，则弃用该蜜蜂。
4. 使用不同颜色标记蜜蜂的胸部，以对应不同的处理组。若采用单次注射策略，此时可在观察1小时后将蜜蜂放回蜂群。若采用两天注射策略，则在注射第一剂dsRNA后，应将蜜蜂放入带有侧壁供蜜的圆柱形网笼中，并置于34 °C、80%湿度的培养箱中饲养。
5. 第二天，按照步骤2.2和2.3操作，将网笼中的蜜蜂冷却并固定在石蜡板上。随后按照步骤2.4所述方法，进行第二剂dsRNA的注射。
6. 让蜜蜂在室温下恢复1小时，然后将其引入蜂群中。

注意：基因敲低效果可通过定量反转录PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹法检测。通常，基因敲低效率存在差异，且受多种因素影响。在本研究中，单次注射和连续两天注射后7天可检测到双基因敲低效果。

第二部分：Proboscis 延伸反应（PER）实验

1. 从蜂巢采集蜜蜂

注射后的第6天，从蜂群中采集经处理的蜜蜂，采集时不得使用熏烟器。将蜜蜂收集到金属网笼中，每笼放置3只蜜蜂。

2. 蜜蜂PER实验的固定

将蜜蜂置于4 °C环境中冷却，直至其完全无法活动。将每只蜜蜂垂直固定在专为PER实验设计的塑料管中。用两小片胶带将蜜蜂的腹部固定在管内，头部露出管外。将装有蜜蜂的管子放置在带有两排小型塑料柱的支架上，并为每根管子（蜜蜂）分配一个编号。然后将装有处理后蜜蜂的支架放入培养箱（34 °C，80%湿度）中，保持2小时。

3. 配制一系列蔗糖水溶液

配制0%、0.1%、0.3%、1%、3%、10%和30%的蔗糖水溶液，并将溶液装入带有15–20 G针头的注射器中。

4. PER 实验

先用一滴0%溶液（水）触碰蜜蜂的触角，随后依次使用0.1%、0.3%、1%、3%、10%和30%的蔗糖水溶液进行测试。所有蜜蜂均需先用水进行首次测试，且每种溶液之间至少间隔两分钟。因此，我们通常每次试验至少使用20只蜜蜂。若蜜蜂完全伸展出其喙，则记为一次阳性反应。

5. 数据管理

计算每个个体的味觉反应评分（GRS）总阳性反应数。对数据进行适当的统计学分析。

第3部分. 基因敲低验证

从另一组处理过的7日龄蜜蜂中解剖获取脂肪体。采用标准TRizol方法提取RNA，随后进行DNase I处理²⁴。通过两步法qRT-PCR分析vg和usp基因的表达水平。由于actin基因在蜜蜂不同组织中表达稳定，因此被用作参考基因。本实验使用已发表的实时PCR引物扩增vg和usp基因²⁴。数据采用ΔΔCT法进行分析²⁵。

结果

单次注射和连续两天注射两种策略均显著降低了蜜蜂在注射dsRNA后第六天的vg基因（单因素方差分析，p < 0.001）（图2A）和usp基因（单因素方差分析，p < 0.001）（图2B）的转录水平。与先注射usp、后注射vg（usp/vg）的两天注射方案相比，采用单次注射dsRNA混合物以及先注射vg、后注射usp（vg/usp）的两天注射方案对usp转录本的抑制效果显著更强（事后分析，p_{混合物 vs. usp/vg} = 0.013，p_{vg/usp vs. usp/vg} = 0.019）。

双基因敲低蜜蜂的GRS显著高于GFP<...

讨论

本研究是首次在成年昆虫中同时敲低两个基因的尝试。我们的结果表明，dsRNA 注射的两种策略（单次注射和连续两天注射）均能有效实现双重基因抑制，在将 dsRNA 注射入蜜蜂后第6天即可检测到vg和usp基因的同步沉默效果^8,9。然而，基因敲低效率在不同昆虫物种中存在差异，取决于靶基因的转录水平、蛋白质 turnover 速率以及细胞或器官对 dsRNA 的摄取效率。此外，RNAi 的效果具有剂量依赖性。我们发现，新羽化的蜜蜂能够良好耐受 4 μl 的 dsRNA 注射量，但若注射量超过 4 μl，死亡率则迅速上升。因此，对于需要较高注射体积的实验，连续两天注射策略可能比单次注射更为合适。

本文中我们建立的双基因敲低方法⁹可用于研究两个调控因子的联合效应。此外，本视频中介绍的不同dsRNA注射方法为进一步解析基因间的相互关系提供了更多工具。

例如，Vg 和 JH 处于一个调控蜜蜂生理的反馈环路中 ⁹ 行为成熟 ^26,27...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
GE Healthcare 96 孔板 PCR 珠	GE Healthcare	27-9557-01
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104
RiboMax T7 RNA 合成系统	Promega	P1300
Trizol LS	Invitrogen	10296028
氯仿:异戊醇 24:1	Sigma-Aldrich	C0549
异丙醇	Sigma-Aldrich	I9516
Hamilton 微量注射器	Hamilton	80301
30G BD 一次性针头	BD Biosciences	305106
蔗糖	Sigma-Aldrich	84097
1 ml 注射器	BD Biosciences	30960
立体解剖显微镜	Leica Microsystems	S6D
昆虫针	Fine Science Tools	26000-25
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