酵母线粒体核样区蛋白 Mgm101 是一种 Rad52 型重组蛋白，能够形成大的寡聚环状结构。本文描述了一种利用麦芽糖结合蛋白（MBP）标签策略，结合阳离子交换层析和尺寸排阻层析来制备可溶性重组 Mgm101 的实验方案。
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摘要
摘要
MGM101 基因在20年前因其在维持线粒体DNA中的作用而被发现。多个研究小组的研究表明，Mgm101蛋白参与线粒体DNA的重组修复过程。最近的研究指出，Mgm101属于Rad52型重组蛋白家族。这类蛋白可形成大的寡聚环状结构，并促进同源单链DNA分子的退火。然而，由于难以获得重组蛋白，Mgm101的表征工作一直受到阻碍。本文描述了一种可靠的重组Mgm101蛋白制备方法。首先在Escherichia coli中表达带有麦芽糖结合蛋白（MBP）标签的Mgm101融合蛋白。该融合蛋白首先通过淀粉亲和层析进行初步纯化。经蛋白酶切释放后，利用阳离子交换层析将Mgm101与MBP分离。再通过分子筛层析获得单一分散状态的Mgm101蛋白。通常可从每升细菌培养物中获得约0.87 mg的Mgm101。所获得的重组Mgm101蛋白中DNA污染极低。制备的样品已成功用于Mgm101的生物化学、结构分析以及单颗粒图像分析。该实验方案也可适用于其他可能在细菌细胞中错误折叠且具有毒性的大型寡聚DNA结合蛋白的制备。
引言
同源重组在双链断裂（DSBs）和链间交联的修复以及从坍塌的复制叉重新启动DNA复制过程中起着重要作用1。在传统的同源重组过程中，核心反应由ATP依赖性重组酶催化，原核生物中的RecA以及真核生物中的Rad51和Dmc1即属于此类重组酶1-3。这些重组酶在单链DNA（ssDNA）上形成核蛋白丝结构，这对于在双链DNA模板中启动同源序列搜索和链侵入至关重要（图1，左图）4-7。除了这种传统机制外，同源重组也可在不依赖RecA/Rad51的途径下进行（图1，右图）。例如，酵母中的Rad52和Rad59蛋白可直接催化由双链DNA断裂经末端切除后暴露的互补单链DNA之间的退火反应。这一重组过程被称为单链退火，通常不涉及与双链DNA模板的同源配对。退火完成后，异源末端由外切核酸酶切除，切口则通过连接酶连接，从而恢复基因组的连续性8-10。通过单链退火机制进行的修复通常会导致直接重复区域之间基因组序列的缺失。
Rad52 属于一类在噬菌体中广泛存在的重组蛋白 11这些蛋白质也被称为单链退火蛋白（Single Strand Annealing Proteins, SSAPs），因其能够促进同源单链DNA分子的退火而得名。目前研究最为清楚的噬菌体SSAPs包括来自噬菌体λ和P22的Redβ和Erf，以及来自前噬菌体的RecT。 rac 以及乳酸菌噬菌体ul36的Sak蛋白。SSAPs在结构上具有典型的β-β-β-α折叠，尽管它们的一级序列相似性几乎无法检测。它们均形成具有10至14重对称性的大型同源寡聚环状结构 体外 12-14这种特征性的高级结构组织的功能意义尚不明确。
我们致力于研究线粒体基因组中同源重组的机制。此前，我们已鉴定出对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）线粒体DNA（mtDNA）维持至关重要的MGM101基因15。MGM101随后被发现与线粒体核样结构相关，并在mtDNA耐受DNA损伤试剂的过程中发挥必需作用16。然而，在过去十年中，Mgm101的研究因难以获得重组Mgm101蛋白而受到阻碍。我们最近通过MBP融合策略，成功地从大肠杆菌（E. coli）中大量表达出可溶性的Mgm101蛋白。这一突破使我们得以证实，Mgm101在生化特性与结构上与Rad52家族蛋白具有相似性17,18。本文报道了一种三步纯化流程，可获得均一的Mgm101蛋白，用于后续的生化与结构分析（图2）。
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方案
先前的研究表明，Mgm101 的前 22 个氨基末端氨基酸残基在导入线粒体后会被切除19。为了在 Escherichia coli 中表达，通过 PCR 扩增缺失前 22 个密码子的 MGM101 开放阅读框，并将其插入到表达载体 pMAL-c2E 的一个修饰版本中，位于编码麦芽糖结合蛋白（MBP）的 malE 序列下游。由此构建出含有 PreScission 蛋白酶切割位点的连接序列的 MBP-Mgm101 融合蛋白（图 3）。首先通过在不含 IPTG 和 X-gal 的培养基上进行蓝白斑筛选，选择 E. coli 转化子以构建质粒。随后将构建好的质粒 pMAL-c2E-MGM101 转入 E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 菌株，并通过筛选氨苄青霉素和氯霉素抗性菌落获得阳性克隆。
1. 表达、诱导、细胞裂解和DNase I处理
- 将新鲜转化子接种于10 ml LB培养基（1% Bacto胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl）中，培养基中添加葡萄糖（0.2%）、氨苄青霉素（100 μg/ml）和氯霉素（50 μg/ml）。在37 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。
- 将10 ml预培养物接种至2升上述添加成分的LB培养基中。在37 °C振荡培养，直至OD600达到0.5。
- 加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.3 mM，诱导MBP-Mgm101融合蛋白的表达。在30 °C振荡培养5小时。
- 使用Beckman JA-10转子离心收集细胞（5,500 × g，4 °C，10分钟）。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于30 ml裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4，1 mM EDTA，pH 7.4）中，缓冲液含蛋白酶抑制剂（25 μM亮抑蛋白酶肽，1 μM胃蛋白酶抑制剂A和1 mM PMSF）。
- 在冰上使用超声处理器（Heat Systems；型号W-385）以50%占空比对细胞悬液超声处理20秒，冰上冷却30秒，重复此步骤2次。
- 加入1 ml浓度为2 mg/ml的DNase I储备液。在4 °C轻轻摇动细胞裂解物2小时。
- 调节NaCl至终浓度500 mM。
- 在4 °C以10,000 × g离心30分钟，去除细胞碎片。
2. 使用淀粉亲和层析进行纯化
- 用裂解缓冲液平衡1.5 ml amylose树脂（50%悬浊液）。将平衡后的amylose树脂加入细胞裂解液中，4 °C轻柔摇动过夜。
- 将裂解液-树脂混合物上样至安装于冷室中的Econo-Column层析柱。依靠重力使未结合的蛋白质流过柱体。
- 用300 ml洗涤缓冲液I（20 mM Tris-HCl，pH 7.4；400 mM NaCl；1 mM EDTA，pH 7.4；0.2 mM PMSF）洗涤amylose树脂。
- 用150 ml洗涤缓冲液II（20 mM Tris-HCl，pH 7.4；200 mM NaCl；1 mM EDTA，pH 7.4；0.2 mM PMSF）重复洗涤一次。
- 向柱中加入5 ml洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4；200 mM NaCl；1 mM EDTA，pH 7.4；0.2 mM PMSF，10 mM麦芽糖），4 °C孵育10分钟，收集洗脱液，并重复多次以提高回收率。
- 合并洗脱液，取部分样品进行SDS-PAGE电泳并用考马斯亮蓝染色，以测定MBP-Mgm101的产量和纯度（图4）。
3. PreScission 蛋白酶切割与阳离子交换层析
- 向MBP-Mgm101洗脱液中加入50单位的PreScission蛋白酶。在4 °C下过夜进行切割反应，并在透析缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.4；100 mM NaCl；2 mM DTT；1 mM EDTA，pH 7.4；以及0.2 mM PMSF）中继续透析。
- 通过SDS-PAGE凝胶检测切割反应的效率（图5A）。
- 将切割后的MBP-Mgm101通过多次进样加载到连接于Bio-Rad Biologic DuoFlow FPLC系统的Bio-Scale Mini Macro-Prep High S柱上。
- 通过使用缓冲液A（5 mM NaCl；10 mM Na-磷酸盐，pH 7.2；1 mM PMSF）和缓冲液B（1 M NaCl；10 mM Na-磷酸盐，pH 7.2；1 mM PMSF）配制的5 mM、300 mM、500 mM、750 mM和1,000 mM NaCl阶梯盐浓度梯度，开始阳离子交换层析。流速设定为0.5 ml/min。收集Mgm101组分，并通过SDS-PAGE凝胶检测蛋白纯度（图5B）。
4. 尺寸排阻色谱
- 合并阳离子交换层析所得的蛋白组分。将蛋白在GF平衡缓冲液（20 mM MOPS，pH 7.0；150 mM NaCl；1 mM EDTA，pH 7.4；5 mM 2-巯基乙醇；0.2 mM PMSF）中透析。
- 使用VIVASPIN 15R超滤离心柱在4 °C、3,000 × g条件下离心浓缩蛋白，将体积减少至约1 ml。
- 将Mgm101上样至经色谱缓冲液（20 mM MOPS，pH 7.0；150 mM NaCl；5 mM β-巯基乙醇；1 mM EDTA，pH 7.4；0.2 mM PMSF）预平衡的校准Superose 6制备级柱上。
- 以0.5 ml/min流速的色谱缓冲液开始进行凝胶过滤层析。
- 收集纯化后Mgm101峰对应的组分，并取各组分等分试样上样至12% SDS-PAGE，以检测蛋白的最终纯度。
- 使用VIVASPIN 6超滤柱浓缩蛋白，随后将样品在液氮中快速冷冻，并保存于-80 °C。
- 在6–12个月内使用Mgm101样品进行单链DNA结合实验（图8）以及透射电子显微镜下的结构观察（图9）。
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结果
Mgm101 是一种与 Rad52 相关的线粒体重组蛋白。Rad52 在线粒体 DNA 重组中的作用已被广泛研究（图 1）。重组 Mgm101 可通过三步法进行制备（图 2）。该过程得益于 MBP 标签策略的应用，该策略可使 Mgm101 以可溶形式表达，并随后通过蛋白酶切去除标签而释放出目标蛋白（图 3）。
在常规制备中，经过淀粉亲和层析后，每升细菌培养物可回收约 2-3 mg 的 MBP-Mgm101 融合蛋白。在 SDS-PAGE 凝胶上，MBP-Mgm101 显示为一条主带，大小约为 70 kDa（图 4）。如果在洗脱前对树脂进行了适当的洗涤，则其他蛋白质的污染极少。经 PreScission 蛋白酶切割后，MBP 和 Mgm101 在 SDS-PAGE 上分别显示为 42 kDa 和 28 kDa 的条带（图 5A）。若消化不完全（表现为存在约 70 kDa 的条带），建议使用额外的 PreScissio...
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讨论
从大肠杆菌（E. coli）中表达稳定且具有天然构象的重组Mgm101蛋白一直存在挑战，这可能是由于该蛋白在细菌细胞中不溶所致。在本报告中，我们证明MBP融合策略可使该蛋白达到相对较高的表达水平。我们此前已通过负染透射电子显微镜和凝胶过滤层析技术证实，MBP融合蛋白在体外（in vitro）能够形成均一的寡聚体18。Mgm101蛋白在细菌细胞中的折叠和寡聚化过程可能比在线粒体基质中更慢。未形成寡聚体的Mgm101可能迅速聚集，从而在体内（in vivo）产生毒性。MBP标签可能使Mgm101保持可溶性构象，促进其有效寡聚化，并降低其毒性。
高质量Mgm101制备的一个重要标准是DNA污染尽可能少。A280/A260比值用于估计样品中DNA污染物的水平。通常，该比值>1.4时较易实现，表明样品质量良好，核酸污染物含量<0.75%。若A280/A260比值低于此标准，建议延长DNA酶I的消化时间。未来或许可以进...
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
我们感谢 Stephan Wilkens 在透射电子显微镜方面的帮助。本工作由美国国立卫生研究院资助项目 R01AG023731 支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 表达载体 pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| PreScission 蛋白酶 | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 细胞 | Strategene | #230245 | |
| 亮抑蛋白酶肽（Leupeptin） | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| 胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin） | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| 苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF） | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNase I | Sigma | #DN25-1G | |
| 异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG） | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| 淀粉树脂（Amylose resin） | New England Biolabs | #E8021L | |
| Econo-Column 层析柱 | BIO-RAD | #7372512 | |
| Bio-Scale Mini Macro-Prep High S 柱芯（1 ml） | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R 超滤离心柱（10,000 MWCO） | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Superose 6 prep grade 层析柱 | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 超滤离心柱（5,000 MWCO） | Sartorius Stedium | #VS0611 |
参考文献
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