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4D 多模态成像 鼠伤寒柠檬酸杆菌 小鼠感染

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DOI：

10.3791/50450

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2013年8月13日

 ,  ,  ,  , 
1MRC Centre for Molecular Bacteriology and Infection, Division of Cell & Molecular Biology, Imperial College London, 2Preclinical Imaging, Caliper- A PerkinElmer Company

本文内容

摘要

多模态成像是研究小动物模型中细菌定植的一种有价值的方法。本方案概述了用生物发光的鼠柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium）感染小鼠，并利用融合三维漫射光成像断层扫描与μCT成像技术对细菌定植进行长期监测，从而生成鼠柠檬酸杆菌（C. rodentium）感染的四维动态影像。

摘要

本方案概述了利用集成 μCT 的三维漫透射光成像断层扫描（DLIT-μCT）对生物发光细菌感染进行纵向监测所需的操作步骤，并介绍了如何利用这些数据生成感染周期的四维（4D）动态影像。为构建4D感染动态图并验证IVIS Spectrum CT系统在细菌感染研究中应用DLIT-μCT成像的可靠性，我们采用了可引起小鼠自限性结肠炎的生物发光菌 C. rodentium 进行感染实验。在本方案中，我们详细描述了用生物发光 C. rodentium 感染小鼠的方法，以及通过每日进行非侵入性的DLIT-μCT成像并结合粪便中细菌计数，对定植过程连续监测8天的操作流程。

IVIS Spectrum CT 的使用通过单一成像平台实现了光学成像与 μCT 扫描的无缝共定位。低剂量 μCT 模式能够在感染过程中对小鼠进行多个时间点的成像，从而在不产生累积辐射伪影的情况下，提供生物发光细菌病灶的三维精细解剖定位。重要的是，对感染小鼠进行的 4D 成像为监测细菌定植动态提供了强大的分析工具。 体内

引言

小型动物模型，特别是使用小鼠的模型，通常用于研究细菌致病机制或测试感染的干预策略，例如抗生素、益生菌、益生元和疫苗1-7。小型动物感染实验的主要检测指标包括病原体载量、感染的空间和时间定位，以及感染生物体免疫反应的变化。In vivo 光学成像是传染病研究中的重要工具，可通过使用报告基因（如荧光素酶、荧光蛋白、β-内酰胺酶等）、荧光染料、纳米颗粒或靶向特定蛋白、生物过程或微生物的化学发光探针，来监测多种实验检测指标6。

生物发光成像（BLI）是一种光学成像技术，用于监测病原菌在小动物（如小鼠和大鼠）体内的定植情况3,6,8,9小鼠感染表达荧光素酶的重组细菌，例如 luxCDABE 操纵子来自 Photorhabdus luminescens 这些细菌随后可通过基于CCD的发光检测进行检测 在体 成像系统3,6,9重要的是，只有代谢活跃的微生物才会产生生物发光（BL），这意味着该方法仅能检测到有活力的细菌细胞。 10,11通过二维生物发光成像（2D BLI），根据动物体表发出信号的位置推断生物发光源的位置8BL 病灶的精确定位解剖学位置 体内 必须通过以下方式确定 离体 器官分析3,6,9 相比之下，复合三维漫射光成像断层扫描（DLIT）可用于对生物发光源进行定量的三维重建12DLIT 通过采集使用特定窄带光学滤光片获取的生物发光（BL）图像，并将其输入漫反射光学断层成像三维重建算法来实现。1,7,12,13.

目前，多模态成像技术是实现生物发光焦点真实无创解剖定位的唯一可用方法 体内 无需 离体 分析。最近，我们采用DLIT与μCT成像共配准相结合的方法进行评估 鼠伤寒柠檬酸杆菌 (C. rodentium益生菌预防性处理后的定植动态7. C. rodentium 是一种小鼠特异性的肠道病原体，用于模拟人类感染肠致病性及肠出血性大肠杆菌 大肠杆菌14. C. rodentium 感染可导致结肠炎，通常伴随轻度体重减轻、腹泻、极化的 Th1 免疫反应以及特征性病理改变，包括结肠隐窝增生和附着-抹除样病变形成14此外， C. rodentium 病原机制已通过生物发光成像（BLI）得到深入研究，其在C57BL/6J小鼠中的定植动态也有详实记录，这使得该细菌成为多模态成像研究的理想模式微生物3,4,7.

本方案首次概述了一种利用单一多模态成像平台IVIS Spectrum CT，对细菌感染进行DLIT-μCT整合成像的方法，并可生成4D电影，以非侵入方式真实展示该感染的动态过程。

方案

1. 小鼠准备

  1. 购买或繁育本研究所需的足够数量的18-20克C57BL/6J小鼠。
  2. 若小鼠从外部供应商购买，在运输至实验设施后，需使用经高压灭菌的饲料和水对小鼠进行为期1周的适应性饲养，以稳定其肠道微生物群。
  3. 称重、耳缘标记，并按每笼所需数量分笼饲养。
  4. 感染前一天，在实施任何麻醉操作前，检查氧气和异氟烷是否充足，确保能够满足整个操作过程的需要。如有必要，补充异氟烷或更换氧气瓶。随后检查麻醉废气吸收装置的重量，若自首次使用以来增重超过50 g，则应丢弃并更换新的吸收装置。
  5. 使用XGI-8麻醉系统中3%的异氟烷对小鼠进行麻醉，并使用VEET脱毛剂脱毛7分钟。
  6. 注意事项：
    • 彻底脱毛至关重要，尤其是在黑色小鼠中，因为毛发中的黑色素会显著减弱生物发光信号3,15。
    • 小鼠脱毛后通常可持续8-10天不长出新毛；若需进行较长时间的4D多模态成像，应根据需要适时脱毛，以确保成像期间目标区域无毛发覆盖。
    • 小鼠饲养于生物安全二级（BSL-2）防护设施中。

2. 细菌细胞制备

  1. 准备足量的添加卡那霉素[50 μg/ml]的LB（Luria-Bertani）肉汤和琼脂平板-1] 研究所需，并于4 °C保存直至使用。
  2. 感染前一天，解冻一支冻存管中的样本 C. rodentium 菌株ICC180，并立即向15 ml添加卡那霉素（50 μg/ml）的LB肉汤中加入一个冷冻珠-1]，并在37 °C、220 rpm条件下培养过夜。作为培养基污染的对照，另准备一份未接种的15 ml LB肉汤，添加卡那霉素[50 μg/ml]-1]，并在 220 rpm、37 °C 条件下培养。
  3. 次日早晨（约16小时），检查培养基对照是否出现浑浊，以判断是否存在细菌生长。若对照组澄清，则将ICC180菌液转移至离心管中，以4,000 rpm离心。随后用PBS洗涤菌体沉淀，再重悬于1.5 ml PBS中（1/10）th 加入卡那霉素的LB培养基原体积）并充分混匀，以制备细菌接种液。
  4. 为验证在感染小鼠前ICC180已正确培养并具有生物发光性，使用IVIS Spectrum CT系统，按照此前所述方法，通过生物发光成像（BLI）及Living Image 4.3.1向导中的自动设置对接种物进行成像1.
    注意：
    • 菌株ICC180是野生型的生物发光衍生物 C. rodentium ICC1692该细菌菌株具有 luxCDABE操纵子，包含一个插入假基因中的卡那霉素抗性基因 xylE 在染色体中2.
    • 使用标准的无菌技术进行所有细菌培养操作；必要时，购买无菌耗材/试剂或在使用前进行高压灭菌。
    • 在步骤2.4中，生物发光读数（p/s/cm²/steradian）用于评估……2/sr) 可用于在小鼠感染前估算细菌数量。

3. 用生物发光的 C. rodentium 感染小鼠并评估细菌定植情况

  1. 感染前，检查氧气和异氟烷是否充足，足以维持整个操作过程。如有必要，添加更多异氟烷或更换氧气瓶。随后检查麻醉废气吸收器的重量，若自首次使用后增重超过50 g，则应丢弃并更换新的吸收器。
  2. 使用XGI-8麻醉系统，以3%异氟烷对小鼠进行麻醉，以实现人道固定。
  3. 充分混匀细菌接种物，并吸取0.2 ml（约含5 × 109 cfu ICC180）注入注射器中。
  4. 依次将小鼠从麻醉系统中取出，用拇指和食指牢固抓住其颈部后方皮肤进行固定。
  5. 将灌胃针推向口腔顶部，越过舌头，沿食道向下推进，并将细菌接种物注入胃内。
  6. 完成小鼠口服灌胃后，观察其步态和呼吸情况，若出现痛苦迹象，可能提示接种物已误入肺部。对任何接种至肺部的小鼠实施安乐死。
  7. 对未感染小鼠以200 μl PBS进行灌胃，作为溶剂对照，操作方法如步骤3.1–3.6所述。
  8. 为确认口服灌胃操作正确，使用IVIS Spectrum CT系统，按照此前所述方法1，采用生物发光成像（BLI）及Living Image 4.3.1向导中的自动设置，对感染组和假感染组小鼠进行成像。
  9. 通过在PBS中进行系列稀释，并将稀释液三份重复点样于添加卡那霉素[50 μg ml-1]的LB琼脂平板上，测定接种物中可存活细菌的数量。
  10. 计算ICC180 cfu/ml时，选择菌落数约为5–50的稀释度，计数该稀释度下每个点样的菌落数，并记录计数所用的稀释倍数。随后计算三个点样的平均cfu数，将该值乘以稀释因子50（每个点样为原始1 ml样品中的20 μl）以及计数时所用的稀释倍数，得到cfu/ml。
  11. 通过每日采集每只小鼠粪便于预先称重的离心管（使用精密天平称量）中，根据样本重量以PBS按1/10比例稀释（0.1 g ml-1），监测小鼠定植情况。
  12. 通过在PBS中进行系列稀释，并将稀释液三份重复点样于添加卡那霉素[50 μg ml-1]的LB琼脂平板上，测定粪便中可存活细菌的数量。
  13. 按照步骤3.9的方法计算每克粪便中可存活细菌数量，然后将cfu/ml数值乘以PBS中粪便稀释因子（步骤3.10中的0.1 g ml-1），得到cfu/g。
  14. 为确认小鼠接种的是纯ICC180培养物且所有菌落均具有生物发光性，取步骤3.8中的琼脂平板，通过肉眼观察细菌菌落形态，或从平板上挑取代表性菌落进行光学显微镜分析。如有必要，可通过菌株特异性菌落PCR鉴定细菌，以评估培养物纯度。随后，按照步骤3.7所述方法，在IVIS Spectrum CT系统中对平板进行生物发光成像（BLI），并确认平板上100%的菌落均具有生物发光性。
    注意事项：
    • 在步骤3.4中插入灌胃针时，若感到阻力，切勿强行推进，以免接种物进入肺部。应重新插入针头并轻柔尝试。
    • 步骤3.1为可选步骤，是否在麻醉下进行口服灌胃取决于各机构的动物福利政策。
    • 粪便样本必须在采集当天进行涂板。C. rodentium即使在4 °C PBS中过夜仍可生长，将导致cfu/g粪便的定量结果不准确。

4. 感染小鼠的每日复合3D漫射光成像断层扫描结合μCT成像（DLIT-μCT）

动物福利考虑：DLIT-μCT 技术涉及将 DLIT 光学成像与对固定动物进行的快速、低辐射剂量的 μCT 扫描相结合（两只小鼠扫描的辐射剂量约为 23 mGY，单只小鼠扫描约为 53 mGY）。该辐射剂量会随着每次成像过程累积，因此目标是在确保完成研究的前提下，尽可能降低辐射剂量（且始终远低于 LD50/30）。在某些情况下，如果小鼠的常规 BLI 扫描中未见感染迹象，则可省略 μCT 扫描，以进一步减少辐射暴露。尽管辐射剂量已尽可能降低，但在长期研究中，若对辐射暴露存在任何担忧，一旦出现有害症状的初步迹象，或在 μCT 成像阶段结束时，即对小鼠实施安乐死。

  1. 成像前，启动 IVIS Spectrum CT 系统，检查 X 射线安全联锁装置是否正常工作，并确认加热平台温度已达到成像所需温度（37 °C）。随后检查麻醉系统中异氟烷的液位以及麻醉废气吸收剂的重量。如有必要，补充异氟烷；若吸收剂自首次使用后增重超过 50 g，则应丢弃并更换新的吸收剂。
  2. 设置 Spectrum CT，优化 Living Image 4.3.1 软件中自动曝光功能的成像参数，以适用于细菌荧光素酶的成像。选择 编辑 > 首选项 > 采集与自动曝光窗口。然后选择 > 范围值 > 曝光时间（秒），并将 > 最大值设为 300 秒。最后，选择 > 目标计数（最小值） > 生物发光，设置为 10,000 计数。
  3. 将单只小鼠成像平台插入 Spectrum CT，并连接至麻醉气体供应系统。
  4. 打开 X 射线安全联锁装置，并启动 IVIS 系统。
  5. IVIS Spectrum CT 启动完成后，使用 XGI-8 麻醉系统以 3% 异氟烷对小鼠进行麻醉，以实现人道固定。
  6. 为确定是否需要进行 DLIT-μCT 扫描，可在单只小鼠成像平台上按照先前所述方法1，先通过生物发光成像（BLI）对小鼠进行预成像。若获得较强的信号，则该小鼠适用于 DLIT 成像。BLI 扫描完成后，将麻醉状态的小鼠保留在成像平台上，准备进行 DLIT-μCT 成像。
  7. 在 Living Image 软件 4.3.1 中使用成像向导（Imaging Wizard）设置 DLIT-μCT 扫描。成像向导将自动确定 DLIT 成像的视野（FOV）、曝光时间、光圈值（F-stop）和 binning，以及 μCT 成像的视野、曝光时间、滤光片组合和 binning，以获得最佳信噪比。当成像向导提示时，仅选择 560、580、600 和 620 nm 的发射滤光片，并选择单只小鼠的 μCT 扫描模式。然后点击 > 采集，开始成像。
  8. 成像结束后，将麻醉的小鼠送回笼中，从 Spectrum CT 中取出单只小鼠成像平台，并使用 1% Tri-gene 进行消毒。如需防止小鼠间交叉污染，应更换小鼠所处位置的泡沫垫。
  9. 按照步骤 4.1–4.8 所述方法，自感染后第 1 天起每日对小鼠进行 DLIT-μCT 成像，直至感染后第 8 天（P.I.），以获取生成感染过程 4D 动态影像所需的纵向成像数据。
    注意：
    • 在步骤 4.7 中，建议使用 560–620 nm 的发射滤光片对细菌生物发光进行成像。尽管细菌生物发光的峰值波长约为 485 nm，但由于组织光学特性（小鼠组织对蓝/绿光光子的显著衰减），使用橙/红光光子进行三维重建更为重要，因其有助于信号深度的计算。
    • Living Image 4.3.1 中 DLIT 的“自动”曝光设置需进行调整，以优化每组滤光片采集的光子数量及最大成像时间。
    • 仅当研究人员不确定是否存在可检测的生物发光信号时（例如使用新的感染模型时），才需要执行步骤 4.6 中所述的 BLI 预成像。

5. DLIT-μCT成像数据的三维重建

  1. 打开 Living Image 软件 4.3.1 并选择 > 浏览并打开包含 DLIT-μCT 文件的文件夹。
  2. 在Living Image浏览器中打开DLIT-μCT文件，例如 C. rodentium 感染后第1天，点击“Load”加载。
  3. 在工具面板中选择 > 表面形貌 > 裸鼠，调整阈值，然后点击 > 生成表面。如果表面重建成功，三维视图窗口中将显示表面轮廓。
  4. 要在3D视图窗口中查看渲染后的μCT扫描图像，请隐藏表面轮廓（点击） > 三维光学工具与非选择性 > 显示表面对象），或降低表面不透明度（点击 > 3D 光学工具并调节 > 不透明度滑块栏）
  5. 为了提供3D DLIT重建的详细解剖定位，需要调整3D体积数据（μCT扫描），使仅小鼠骨骼可见，并具有最佳对比度。点击 > 3D 多模态工具与选择 > 对数直方图、梯度照明、质量与去噪。最后，将直方图滑块向右调节，观察三维体数据的对比度变化。持续调整数据，直至仅骨骼结构清晰可见。如需要，可更改直方图上传递函数点的颜色。
  6. 接下来选择 > 工具面板中的 DLIT 三维重建，确保仅启用成像细菌荧光素酶所需的 560、580、600 和 620 nm 滤光片组 体内，已选定。点击 > 开始。此时将显示数据预览窗口菜单，呈现以二维成像的小鼠经光谱滤波后的BL信号。这些信号由软件自动设定阈值，但如有需要，可使用菜单底部的选项卡手动调整。阈值用于确定被纳入重建数据的最低信号强度（以图像中最大信号的百分比表示）。
  7. 接下来选择 > 在工具面板中选择DLIT 3D重建，并核对用于DLIT重建的光学参数是否正确。选择 > 属性选项卡，并确保组织属性设置为小鼠组织，源光谱设置为细菌。
  8. 点击 > 重建以执行DLIT重建。
  9. 要生成 DLIT-μCT 三维动画，请点击 > 工具 > 3D动画与选择 > 预设动画 > CCW Y轴和 > 总时长 > 10秒（每秒25帧）。确认3D动画设置正确后，按下 > 将DLIT-μCT三维重建结果以.avi文件格式记录并保存，文件名标注实验名称、分组及时间点，并存放在单独的文件夹中。
    注意：
    • 进行DLIT-μCT数据三维重建时，应使用安装了Living Image 4.3.1及服务包1的计算机，且该计算机需配备适用于运行多模态成像软件的显卡。该软件可下载，其GPU配置要求详见发布说明http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm ).
    • 如果保存后的DLIT-μCT三维重建图像显示为反向，则说明您的计算机正在使用旧版本的显卡驱动程序，可通过从制造商官网下载更新来解决此问题。
    • 在步骤5中，我们展示了生成3D DLIT-μCT重建图像的首选设置。然而，在3D重建过程中，存在多个可调整参数的环节，这些参数未在本方案中讨论。有关使用Living Image 4.3.1进行3D重建的完整指南，请参考制造商提供的使用说明书。
    • 使用多模态成像工具创建三维重建时，必须采用相同的设置，以确保结果具有可比性。此外，在生成DLIT-μCT三维重建时，制作视频应使用相同的帧率（每秒帧数）和总时长（时间长度），否则四维视频的时间进程将不一致。

6. 生成小鼠柠檬酸杆菌（C. rodentium）感染的4D电影

  1. 将所有DLIT-μCT 3D重建图像按照正确的实验名称、时间点和分组清晰标注，并存放在易于访问的文件夹中。
  2. 在Windows Live Movie Maker中创建一个新文件，使用第6.1步准备的文件夹中的“工具”选项卡，按感染后第1天（P.I.）开始的时间顺序插入DLIT-μCT重建图像。
  3. 为每个视频的开头添加字幕，描述其对应的时间点，例如“感染后第1天（P.I.）”：选择相应的DLIT-μCT视频，然后选择“主页”>“添加字幕”。屏幕上将出现一个文本框，在其中添加相应的图注。使用软件工具栏中与Microsoft Word类似的选项卡，根据需要调整字体大小、样式、颜色和对齐方式。最后，将字幕移至视频的左上角。
  4. 对所有DLIT-μCT视频重复第7.3步。
  5. 添加标题页，例如“C. rodentium 感染第1–8天”：点击“主页”>“标题”。屏幕上将出现一个文本框，在空白幻灯片上添加相应标题。使用软件工具栏中与Microsoft Word类似的选项卡，根据需要调整字体大小、样式、颜色和对齐方式。
  6. 将项目保存为Movie Maker项目文件（*.mmp），存放在合适的文件夹中，并以视频标题命名。如果需要后续修改视频，此步骤至关重要。
  7. 将视频另存为.wmv文件。点击“Movie Maker菜单”>“保存视频”>“用于计算机”。
  8. 使用文件转换器将Movie Maker文件转换为.avi或其他与您的计算机兼容的合适文件格式。
    注意事项：

结果

用5 × 109 cfu的C. rodentium感染C57BL/6J小鼠是一种已被充分描述的细菌感染模型，可引起自限性胃肠道感染，感染高峰出现在感染后第6至8天，持续3至4周2,14。小鼠免疫系统可将感染限制在肠腔内，因此细菌会持续随粪便排出。通过直接从粪便中计数细菌或生物发光成像，可无创监测C. rodentium在小鼠体内的定植情况2,3。

本论文概述了一种优化的方案，用于在小鼠体内对 C. rodentium 进行三维（3D）和四维（4D）多模态成像，以监测感染过程中细菌的载量和定位。图 1 所示结果展示了成功进行 4D 成像所需的对照条件。在感染小鼠之前，必须确认所用的细菌接种物具有生物发光性（图 1A），并且在通过口服灌胃将发光的 C. rodentium 接种至小鼠后，信号可在动物的胃部被观察到，而不会出现在肺部（图 1B）16。

除了使用生物发光成像监测细菌定植外，对粪便中的细菌数量进行定量也是良好的实验操作；该方法可作为胃肠道黏膜细菌定植情况的间接评估指标。 图2 展示了从8只感染了约5 x 10⁶ CFU的C57BL6/J小鼠中采集的粪便中的典型细菌载量9 cfu ICC180 并于感染后 8 天内进行监测。定植量从感染第 2 天开始上升，至第 6–7 天达到峰值，约为 5 × 1010 cfu/g 这与以往的报道一致2,3,17.

为了强调评估单只小鼠感染扩散情况的重要性，图1b、图3以及视频1均来自同一只经上述C. rodentium感染的小鼠。通过每日进行DLIT-μCT成像，利用骨骼作为解剖学参考，评估该小鼠体内生物发光细菌的空间分布情况。图3展示了C57BL/6J小鼠在感染ICC180后三个关键时间点（P.I.）的DLIT-μCT重建图像。感染后第3天（P.I.），结肠内可见少量生物发光病灶；至感染后第5天，生物发光强度中度增强，但空间分布变化不大；到感染后第7天，生物发光信号显著增强，且发光病灶已扩散至整个结肠。

视频1是3D DLIT的合集 μCT 感染后第1-8天使用ICC180进行的重建并说明 C. rodentium 感染后第1至2天在近端胃肠道内出现，第3天扩散至结肠。 从感染后第4天到第6天，结肠内的细菌数量持续增加，至感染后第7天达到峰值，此时细菌病灶已覆盖整个结肠。感染后第8天，仅在近端和远端结肠中各存在一个独立的细菌病灶。按时间顺序观察每个时间点的完整三维重建图像，为分析宿主与病原体之间的相互作用提供了强有力的工具，且相较于同一数据集的静态三维图像，更易于解读。

生物发光成像；A：试管；B：小鼠；表示辐射强度水平的颜色标尺；实验结果。
图1. 对A) 发光的C. rodentium ICC180 接种物和B) 经口服灌胃接种200 μl该接种物后的小鼠进行的二维生物发光成像。箭头（>）指示胃中发光的C. rodentium。

细菌定植生长曲线，CFU 对数刻度，感染后天数的数据分析。

图2. C. rodentium 定植动态。 感染后8天内粪便中C. rodentium菌落形成单位的定量分析。

显示随时间追踪水凝胶注射的啮齿类动物光谱成像，分析图表。
图3. 一只小鼠在感染后第3、5和7天通过扩散光成像断层扫描-μCT扫描监测生物发光性 C. rodentium 感染。 箭头（>）表示结肠定植。 点击此处查看大图。

视频 1. 点击此处观看视频。 对一只小鼠从感染后第1天至第8天连续监测获得的鼠柠檬酸杆菌（C. rodentium）感染的4D电影。

讨论

细菌感染的4D电影提供了一种有用的工具，可快速、直观地可视化和解读大量多模态成像数据。该技术有助于详细分析感染在单个小鼠体内扩散的过程，并可用于在纵向研究中探究宿主或细菌基因的缺失，以及特定干预策略对细菌载量、分布和定位的影响7。这些视频还可作为有效的教学辅助工具，并可用于向公众传播科学信息。

本方案中有多个关键步骤可能影响DLIT-μCT成像数据的质量以及构建感染过程4D视频的能力。其中最重要的步骤是成功且均一地用C. rodentium感染小鼠。用于研究的小鼠体重必须在18–20 g之间，且细菌接种物应为新鲜配制，浓度约为5 × 109 cfu，具体操作如前所述2,3。在感染小鼠之前，必须使用Spectrum CT确认接种物具有生物发光活性；接种物配制完成后，在每只小鼠灌胃前都需持续进行均质化处理，以确保各小鼠接受相近的感染剂量。小鼠的DLIT-μCT成像已优化，Living Image 4.3.1软件中的自动曝光功能可自动确定最佳成像参数，使信号显著高于背景噪声。然而，自动曝光功能依赖于用户自定义的设置和参数，这些参数需按照本方案所述进行调整。若未正确设置，将导致图像质量差、收集到的光子数较少，无法清晰显示感染进展，因为Spectrum CT设备出厂时的自动曝光设置是针对表达萤火虫荧光素酶的肿瘤成像而预设的。使用560–620 nm波长范围进行重建可获得模拟数据与实测数据之间最佳的一致性，因此该范围的数据在重建中更为可靠，应优先采用。

DLIT-μCT 的一个局限性在于，μCT 扫描产生的电离辐射会造成亚致死性辐射损伤，这种损伤在纵向研究中具有累积效应18。亚致死剂量的辐射暴露可能削弱免疫反应，导致内脏器官的 DNA 损伤和细胞凋亡19。最终，如果电离辐射剂量超过其 LD50/30（即30天内导致50%实验动物死亡的剂量），累积的亚致死性辐射损伤可能导致动物死亡；该剂量值因小鼠品系和年龄而异，通常介于5至7 Gy之间18,20,21。尽管部分由电离辐射引起的分子损伤可以修复，但由于研究设计的基本原则是保守估计辐射剂量，因此通常在研究规划中不考虑此类修复效应。相反，研究目标是在实现科学目标的前提下，尽可能使辐射剂量远低于上述安全限值。这一点在本研究中尤为重要，因为感染本身会引发正常的免疫反应，成像频率较高，且转基因小鼠、免疫缺陷小鼠或感染程度较重的动物可能对电离辐射更为敏感。

在设计生成感染过程4D影像的实验时，需要考虑实验的持续时间、在此期间所需的μCT扫描次数，以及所用小鼠品系对电离辐射的LD50/30值。DLIT-μCT的另一个潜在限制因素是所用细菌菌株中报告基因的表达强度，因为这将影响细菌的检测限和成像时间。强烈建议研究人员使用经过验证的、具有完全毒力且针对lux操纵子表达进行了优化以实现最大表达水平的细菌菌株，正如此前在BLI研究中所证实的那样2,3。

当前4D成像设计的一个局限性在于，每部影像由多个独立的DLIT-μCT扫描构成，而这些扫描具有不同的光子缩放比例。如果生物发光（BL）焦点的位置变化或强度变化较为微弱，或存在一个强BL焦点周围伴随多个弱焦点的情况，则可能导致图像难以解读。因此，在进行纵向可视化分析时，保持各时间点之间颜色标尺的一致性至关重要。

感染的4D电影这一概念可应用于任何适当标记的细菌病原体。该技术的未来发展将致力于结合生物发光细菌病原体与可注射的近红外荧光探针，利用荧光成像断层扫描（FLIT）以及扩散光成像断层扫描（DLIT），以促进对宿主感染应答的研究。此外，本方案中仅描述了使用生物发光细菌来创建感染的4D电影。然而，在某些情况下，可能需要使用荧光标记的细菌，例如标记了iRFP的细菌，以便利用生物发光报告系统在感染过程中研究宿主遗传学。重要的是，多模态成像技术（结合DLIT/FLIT与μCT）的使用将使我们能够无创地研究细菌感染过程中的多个参数，这将显著促进科学研究所用动物的“减少、优化与替代”原则的实现，正如NC3R倡议中所述（http://www.nc3rs.org.uk/）。

披露

本文的制作与免费访问由 PerkinElmer 赞助。

作者 Kevin P、Francis、Jeff Meganck 和 Chaincy Kuo 均为 Caliper（珀金埃尔默公司旗下企业）的员工。

所有动物实验均依照1986年《动物科学实验法案》进行，并经当地伦理审查委员会批准。

致谢

帝国理工学院的体内成像设施由英国医学研究理事会（MRC）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物发光的 C. rodentiumFrankel 实验室ICC180Wiles et al., 2004
脱毛膏Boots最佳脱毛时间为 7 分钟。若充分揉搓脱毛膏，脱毛效果更佳。
异氟烷（100% v/v）AbbottB506 
医用氧气BOC MedicalF 型气瓶。注意：需配备合适的减压阀。
LB 肉汤培养基Merck1.10285.0500每升去离子水中加入 25 克。
LB 琼脂培养基Merck1.10283.0500每升去离子水中加入 37 克。
硫酸卡那霉素Sigma (Fluka)60615 
50 ml 聚丙烯锥形 Falcon 管BD (Falcon)352070 
Universal 管Corning (Gosselin)E5633-063 
1 ml 注射器BD (Plastipak)300013 
口服给药针头（16G × 75 mm，弯曲型）Vet TechDE005 
微生物保存管（Cryovial）Pro-Lab DiagnosticsPL.170/Y 
IVIS Spectrum CTCaliper- a PerkinElmer Company133577 Rev A/ Spectrum CT 
6kVA 不间断电源Caliper- a PerkinElmer Company 
XGI-8 麻醉系统Caliper- a PerkinElmer Company118918 
XAF-8 麻醉用活性炭过滤器Caliper- a PerkinElmer Company118999/00 
Living Image v4.3.1 SP1Caliper- a PerkinElmer Company 
台式摇床培养箱New Brunswick ScientificInnova 44 

参考文献

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