获取芽殖酵母荧光延时成像并利用GRAFTS分析单细胞动态

摘要

我们提供了一种简单的实验方案，用于获取酵母细胞生长过程的荧光显微镜视频，以及一个基于图形用户界面的软件包，用于提取单细胞时间序列数据。该分析方法结合了自动化的谱系追踪与分裂时间分配，并整合了可视化检查及对追踪数据的手动校正。

摘要

荧光延时显微镜已成为在单细胞水平研究多种生物学过程的有力工具。特别是，展示基因表达时间依赖性的动态图像可揭示其调控机制的动力学特征；然而，在获取和分析单细胞荧光动态图像方面仍存在诸多技术挑战。本文介绍一种简便的实验方案，利用市售的微流控培养装置获取此类数据，并结合基于 MATLAB 的图形用户界面（GUI）软件包对荧光图像进行定量分析。该软件可实现细胞的分割与追踪，允许用户通过可视化方式校正数据中的错误，并自动分配谱系关系和细胞分裂时间。GUI 还可进一步分析时间序列，生成全细胞荧光轨迹及其一阶和二阶时间导数。尽管该软件最初是为 S. cerevisiae 设计的，但其模块化和多功能性使其只需少量修改即可作为研究其他细胞类型的通用平台。

引言

基因表达的单细胞分析加深了我们对基因调控多个方面的理解。利用流式细胞术或显微镜获取荧光报告基因表达的静态图像，可提供有关单细胞表达分布的有用信息，但缺乏直接揭示基因表达动态所必需的时间序列数据的历史与演化过程。荧光延时显微镜技术则能够同时获得单细胞测量结果及其时间历程。目前已开发出多种实验与分析技术，用于获取并量化荧光报告基因表达的动态影像，从而揭示基因调控的多种特征（参见¹以了解综述），例如细胞间的变异^2,3、细菌持留态形成⁴、转录起始与延伸⁵、转录爆发^6,7、细胞周期依赖性^8,9以及可遗传性¹⁰。然而，获得高质量的单细胞荧光时间序列数据在技术上仍面临重大挑战，包括在可控环境中培养单层细胞，以及对获取的荧光影像进行高通量量化。本文介绍了一种无需具备细胞培养装置制造或软件开发经验即可获取和分析S. cerevisiae荧光影像的实验流程（图1）。

首先，我们详细介绍一种用于生成表达一种或多种荧光报告蛋白的芽殖酵母荧光时间序列影像的示例性实验方案。尽管此前已有研究成功构建并使用了定制的微流控培养室 ^11-13我们使用 CellAsic（美国加利福尼亚州海沃德）生产的商用微流控装置。该系统可将细胞限制在单层生长状态，并实现对灌注环境的持续调控。本文所介绍....

方案

1. 获取单个酵母细胞在微流控腔室中生长的荧光显微镜视频

1. 从新鲜培养的平板中取细胞接种于1 ml SC培养基（含2%葡萄糖及完全氨基酸的合成限定培养基），在30℃滚筒摇床中培养约16小时。 °C. 准备培养物，使其最终 OD_{600 nm} 约为0.1，适用于对数生长期早期的生长。
2. 根据需要稀释起始菌种，并将1 ml转移至新鲜试管中，在新鲜培养基中继续培养6-8小时，直至达到OD_{600 nm} = 0.1。这可使细胞在营养丰富的稳态条件下生长至适合上样到微流控装置的密度。（或者，用实验所需细胞准备的相应步骤替代步骤1.1–1.2。）
3. 从CellAsic公司准备一块Y04C微流控培养板：移除运输溶液，用无菌水冲洗各孔，并使用ONIX灌注系统以6 psi压力将水通过第1至第6孔持续5分钟，以冲洗通道。随后，从加样孔8以6 psi压力通水10秒（加样通道的流速高得多，应单独冲洗）。
4. 移除所有孔中的水，并替换为250 μ入口孔1-6和50中的l SC μ将步骤1.2中的培养液加入细胞加样孔8中。（或者，对于需要在不同条件之间切换的实验，可将所需培养基加入进样孔1-6中。）
5. 将ONIX管道系统密封至培养板，并通过1-6号进样孔以6 psi压力灌注2分钟，启动通道和培养室的预灌注；随后仅使用承载实验起始培养基的进样孔，继续以6 psi压力灌注至少5分钟。此后持续灌注，直至步骤1.7。....

结果

成功执行并分析的实验将获得大多数单个完整细胞的连续时间序列数据，并合理分配芽体出现和分裂时间。例如，我们使用表达由组成型 ADH1 启动子驱动的整合型蓝色荧光蛋白（CFP）的单倍体酵母菌株执行了上述方案，以观察单个细胞中生长和全局表达随时间的变化情况（表4，Y47）。我们进行了时间序列分析，以获得随时间变化的全细胞（图7A）测量值，结果发现体积和表达均呈现出与细胞周期相关的依赖性，这与文献⁹中的发现一致。芽体形成后，总体积（母细胞 + 芽体）的增长速度比芽体出现前更快（与文献^8,16结果一致），而蛋白质浓度或平均荧光强度则略有下降（图7B 和 7C）。总的整合蛋白量（此处为体积 × 浓度）的上升也在出芽后加快（图7D）。与仅分析母细胞区域的结果（图7B&D）相比，这些结果表明在全细胞测量中正确纳入芽体贡献的重要性，并凸显了准确确定芽体形成和分裂时间的必要性。正如我们此前报道的

讨论

上述方案描述了一种简单的方法，可用于获取和分析荧光时间序列数据，且对微流控技术或软件开发经验要求较低。该方法能够获得单个酵母细胞的延时荧光图像，提取相关的细胞大小和表达量数据，校正细胞追踪与谱系分配，并利用市售的微流控培养装置和多功能图形用户界面（GUI）对细胞随时间变化的行为进行分析。尽管此前已有多种方法用于实验操作、图像分割和细胞追踪^11,13,14，但上述流程旨在使这些技术更易于被更广泛的生物学研究群体所采用。虽然本方案针对特定的微流控培养装置进行了优化，但随着即用型微流控培养技术成本降低且可定制性增强，整体分析流程也可适配于类似的装置。本质上，我们所采用的图像分割与区域测量算法与现有方法相似^13,14，但GRAFTS软件增加了对区域追踪和谱系分配进行可视化校正的能力，并能准确标注细胞周期阶段。这两项功能对于精确计算数据序列的时间导数至关重要。

在实验方案中有多个步骤会显著影响最终时间序列数据的质量。最初向培养室接种过多细胞会降低室内的灌注效率（在动力学实验中尤其明显，因为培养室更新时间至关重要），并导致实验过程中细胞过早过度生长.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Y04C 酵母灌流板	CellAsic	Y04C-02
ONIX 微流控灌流平台	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 显微镜	Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 油镜 DIC 物镜	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD 相机	Photometrics
Lumen 200 金属卤化物弧光灯	PRIOR Scientific
三通带通二向色滤光片立方体及激发与发射滤光片组	Chroma Technology Corp	set #89006	用于 YFP (Venus/Citrine)、CFP (Cerulean)、RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 控制器及滤光轮	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		64 位版本处理大型数据文件优于 32 位版本