获取芽殖酵母荧光延时成像并利用GRAFTS分析单细胞动态

摘要

我们提供了一种简单的实验方案，用于获取酵母细胞生长过程的荧光显微镜视频，以及一个基于图形用户界面的软件包，用于提取单细胞时间序列数据。该分析方法结合了自动化的谱系追踪与分裂时间分配，并整合了可视化检查及对追踪数据的手动校正。

摘要

荧光延时显微镜已成为在单细胞水平研究多种生物学过程的有力工具。特别是，展示基因表达时间依赖性的动态图像可揭示其调控机制的动力学特征；然而，在获取和分析单细胞荧光动态图像方面仍存在诸多技术挑战。本文介绍一种简便的实验方案，利用市售的微流控培养装置获取此类数据，并结合基于 MATLAB 的图形用户界面（GUI）软件包对荧光图像进行定量分析。该软件可实现细胞的分割与追踪，允许用户通过可视化方式校正数据中的错误，并自动分配谱系关系和细胞分裂时间。GUI 还可进一步分析时间序列，生成全细胞荧光轨迹及其一阶和二阶时间导数。尽管该软件最初是为 S. cerevisiae 设计的，但其模块化和多功能性使其只需少量修改即可作为研究其他细胞类型的通用平台。

引言

基因表达的单细胞分析加深了我们对基因调控多个方面的理解。利用流式细胞术或显微镜获取荧光报告基因表达的静态图像，可提供有关单细胞表达分布的有用信息，但缺乏直接揭示基因表达动态所必需的时间序列数据的历史与演化过程。荧光延时显微镜技术则能够同时获得单细胞测量结果及其时间历程。目前已开发出多种实验与分析技术，用于获取并量化荧光报告基因表达的动态影像，从而揭示基因调控的多种特征（参见¹以了解综述），例如细胞间的变异^2,3、细菌持留态形成⁴、转录起始与延伸⁵、转录爆发^6,7、细胞周期依赖性^8,9以及可遗传性¹⁰。然而，获得高质量的单细胞荧光时间序列数据在技术上仍面临重大挑战，包括在可控环境中培养单层细胞，以及对获取的荧光影像进行高通量量化。本文介绍了一种无需具备细胞培养装置制造或软件开发经验即可获取和分析S. cerevisiae荧光影像的实验流程（图1）。

首先，我们详细介绍一种用于生成表达一种或多种荧光报告蛋白的芽殖酵母荧光时间序列影像的示例性实验方案。尽管此前已有研究成功构建并使用了定制的微流控培养室 ^11-13我们使用 CellAsic（美国加利福尼亚州海沃德）生产的商用微流控装置。该系统可将细胞限制在单层生长状态，并实现对灌注环境的持续调控。本文所介绍的显微镜检测方案是一种获取芽殖酵母荧光录像的简便方法，但也可根据任何经修改的实验方案（如定制的培养装置、不同的培养基条件等）进行调整。 等等可替换为产生相似单个酵母细胞荧光影像数据的方法。

接下来，我们介绍如何使用基于图形用户界面（GUI）的 MATLAB（Mathworks，Natick，MA）软件包对录像进行分析，该软件包被称为荧光时间序列快速分析图形界面（GUI for Rapid Analysis of Fluorescence Time Series, GRAFTS），用于提取单个细胞的时间序列数据。GRAFTS 在细胞分割与追踪、荧光强度及几何信息提取方面具有与多功能开源软件包 Cell-ID¹⁴ 类似的功能。然而，GRAFTS 提供了若干重要的附加功能。首先，它支持对分割和追踪结果进行便捷的交互式编辑，以验证数据的准确性，而不仅仅是在分析后通过统计门控方式排除异常区域轨迹。此外，该软件可将分析扩展至自动指定出芽酵母的谱系关系及细胞周期中的关键时间点。确定母细胞与子细胞分裂形成两个独立细胞区域的时间，对于在整个细胞周期中获取完整细胞（包括母细胞及其连接的芽体）的测量数据至关重要⁸。该软件套件包含三个模块以完成上述任务。第一个模块基于聚焦与非聚焦明场图像之间的对比度对细胞区域进行分割，并允许用户定义和可视化测试分割参数。第二个模块通过时间序列追踪（采用 Blair 和 Dufresne 基于 Crocker et al. 的 IDL 程序开发的 MATLAB 实现，可访问网址：http://physics.georgetown.edu/MATLAB/）并测量细胞区域，自动分配谱系关系，并支持可视化检查与错误校正。该模块还包含一个简单的绘图 GUI，用于查询单细胞特性。第三个模块用于判定芽体出现和分裂的时间，并输出完整细胞的时间序列数据及其一阶和二阶时间导数（如文献⁹所述）。分析模块将数据输出为以空格分隔的文本文件，以便在用户选定的统计软件中进一步分析。因此，该软件包使用户能够通过图形界面提取高质量的时间序列数据。我们已利用该方法估算了单个出芽酵母细胞在细胞周期进程中实时转录速率的变化⁹。尽管这些模块针对出芽酵母进行了优化，但相关参数或必要时其自由开放的代码可被调整，以适用于其他生物体和图像类型。分割、追踪和谱系分配算法可能因成像方式和具体生物体而异。现有算法可被替换，但仍可保留图形用户界面，以便对任何算法不可避免产生的分割与追踪错误进行直观、用户友好的视觉检查与修正。

方案

1. 获取单个酵母细胞在微流控腔室中生长的荧光显微镜视频

1. 从新鲜培养的平板中取细胞接种于1 ml SC培养基（含2%葡萄糖及完全氨基酸的合成限定培养基），在30℃滚筒摇床中培养约16小时。 °C. 准备培养物，使其最终 OD_{600 nm} 约为0.1，适用于对数生长期早期的生长。
2. 根据需要稀释起始菌种，并将1 ml转移至新鲜试管中，在新鲜培养基中继续培养6-8小时，直至达到OD_{600 nm} = 0.1。这可使细胞在营养丰富的稳态条件下生长至适合上样到微流控装置的密度。（或者，用实验所需细胞准备的相应步骤替代步骤1.1–1.2。）
3. 从CellAsic公司准备一块Y04C微流控培养板：移除运输溶液，用无菌水冲洗各孔，并使用ONIX灌注系统以6 psi压力将水通过第1至第6孔持续5分钟，以冲洗通道。随后，从加样孔8以6 psi压力通水10秒（加样通道的流速高得多，应单独冲洗）。
4. 移除所有孔中的水，并替换为250 μ入口孔1-6和50中的l SC μ将步骤1.2中的培养液加入细胞加样孔8中。（或者，对于需要在不同条件之间切换的实验，可将所需培养基加入进样孔1-6中。）
5. 将ONIX管道系统密封至培养板，并通过1-6号进样孔以6 psi压力灌注2分钟，启动通道和培养室的预灌注；随后仅使用承载实验起始培养基的进样孔，继续以6 psi压力灌注至少5分钟。此后持续灌注，直至步骤1.7。
6. 准备显微镜以进行实验。我们使用一台蔡司Axio Observer.Z1宽场显微镜，配备Photometrics（美国图森市，AZ）生产的Cascade II背照式EMCCD相机，以及PRIOR Scientific（美国罗克兰，MA）的Lumen 200金属卤化物弧光灯作为荧光激发光源，激发光强度衰减至10%以防止光漂白。为最大限度缩短多荧光通道成像所需的切换时间，我们采用一个三通带通二向色镜滤光块，并结合适用于CFP、YFP和RFP的相应激发/发射滤光片（Chroma Technology Corp，美国贝尔洛斯福尔斯，VT；滤光片组89006），将这些滤光片安装于外部高速切换滤光轮（Ludl Electronic Products，美国诺瓦托，CA）中。
7. 在物镜上滴加几滴浸油（如有需要，我们使用 Zeiss Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC 物镜），并将微流控装置牢固地安装在倒置显微镜的载物台上。确保实验过程中载物台上的装置完全不发生位移，有助于在数据分析时提高细胞追踪的准确性。我们通常用胶带将装置固定在载物台支架上以防止其移动。
8. 使用嵌入式位置标记，将焦点对准第一个培养室最左侧的三分之一区域（此处培养室高度最小）。关闭培养基进液孔的流体流动，从细胞加样孔8以6 psi的压力进行每次5秒的脉冲式流体输入。移动载物台，在培养室内寻找细胞。逐步增加加样流体的时间和压力，直至达到理想的细胞密度，但应避免过度加载导致培养室最左侧屏障（新鲜培养基进入处）堵塞。
9. 从含有起始培养基的介质入口孔开始，以6 psi的压力进行灌注。
10. 在 MetaMorph（Molecular Devices，Sunnyvale，CA）或其他显微镜自动化与控制软件中，设置多维采集程序，以在多个载物台位置随时间采集多幅图像。设定时间点的数量及时间间隔。选择若干载物台位置，每个位置约含10个细胞（过多会导致快速拥挤）。我们通常采用5分钟的时间间隔，最多成像16个位置，每个时间点每个位置的采集时间约为11秒。
11. 设置采集程序，使得在每个时间点的每个载物台位置，程序将：使用 MetaMorph 自带的自动对焦方法，基于透射光明场（BF）图像进行对焦（在每个载物台位置开始时，通过自定义编写脚本实现自动对焦，可更精确地控制对焦准确性）；在 +1 位置采集 BF 图像 μm 到焦平面（f.p.）；在 -4 处获取明场离焦（BFOOF）图像 μm 至焦平面（根据需要使用自定义编写的程序在图像间调整焦距）；并在焦平面处，使用针对快速采集且光漂白最小化的优化设置，为每种荧光报告分子采集一幅灰度图像。
12. 如有必要，在培养腔无细胞区域获取每种荧光报告分子的背景和明场校正图像。
13. 在ONIX控制软件中设置实验的流体程序。同时启动MetaMorph中的采集程序和ONIX控制软件中的流体程序。
14. 实验结束时，校正荧光图像中不均匀的背景和阴影（如需要），并可选择将每个视野位置各图像通道的 .tif 文件合并为一个 .stk 动画文件例如 为位置1创建明场、BFOOF、CFP、YFP和RFP视频。

2. 使用 MATLAB 中的 FormatData 图形用户界面（图 2）对数据进行格式化和分段以用于追踪

1. 在 MATLAB 中运行 FormatData.m 文件以打开数据输入图形用户界面（GUI）。在界面顶部，指定或浏览包含图像文件的文件夹以设置数据目录，然后使用该界面指定实验中记录的数据类型和图像文件。
2. 在右侧，选择“时间序列”（Time-lapse）旁边的单选按钮，以指定要执行的分析类型。“时间序列”会将图像序列视为时间序列（例如，微流控腔室中细胞生长的动态影像）。“静态”（Static）则将每个图像序列视为从群体中获取的一组快照（例如，在单个载玻片样本的不同位置拍摄的多张图像）。在本 GRAFTS 版本中，多个位置的时间序列数据可被处理，但需为每个位置分别保存为独立文件（见步骤 2.14）。
3. 勾选图像配准（image registration）复选框，以通过移动视频中的每一帧图像来校正载物台移动不精确的问题，从而最小化帧内细胞的表观移动。我们强烈推荐启用此功能，因为它能显著提高细胞追踪效果（减少后续手动轨迹校正的工作量），但会在图像边界因位移而产生需填充的区域，引入随机的“白噪声”像素值。该选项也可在步骤 2.7 查看分割后的明场图像后，或在步骤 2.13 之前的任意时刻选择。
4. 在“数据通道”（Data Channels）面板中，勾选“明场”（Bright Field）复选框。点击右侧的“选择”（Select）按钮以加载明场图像。对于 *.TIF 文件，按住 Shift 键选择对应单个视频的所有明场图像，然后点击“打开”（Open）。对于 *.STK 文件，仅需选择感兴趣的明场图像栈。若图像被成功识别，“数据已识别”（Data Recognized）面板右侧的下拉菜单中将列出文件名。对于 *.TIF 文件，请确保文件名按正确顺序显示（采集时应将文件保存为连续命名格式，如 BF_t001 等）。
5. 勾选“离焦明场”（Bright Field (out of focus)）复选框，并如步骤 2.4 所述点击“选择”按钮加载 BFOOF 文件，文件名将显示在右侧的下拉菜单中。（BFOOF 图像在 63X 下相对于焦平面（f.p.）在 -4 μm 处采集，分割效果良好。）
6. 勾选“细胞掩模”（Cell Mask）复选框。在“掩模来源”（Mask Source）面板中，选择“分割明场”（Segment BF）旁边的单选按钮。点击“参数”（Parameters）按钮以打开分割图形界面。（或者，通过选择“选择掩模文件”（Select Mask File）旁边的单选按钮，点击该按钮，并如步骤 2.4 所述选择掩模视频，以加载预分割的掩模视频。在此情况下，无需 BFOOF 视频，可直接跳至步骤 2.8。）
7. 设置不同的分割参数（点击“参数说明”可查看各参数描述），并通过点击“测试”（Test）来检验分割质量（图 3）。成功分割的区域将以绿色显示，边缘为品红色。请务必使用滑块检查视频中的多个时间点。当分割结果满意后，选择“完成”（Done）以将分割参数返回至 FormatData 图形界面。
8. 勾选“彩色图像”（Color Images）复选框。在文本编辑框中输入第一个荧光图像通道的颜色名称，然后点击“添加并选择”（Add and Select）以如步骤 2.4 所述加载彩色图像文件。颜色名称将被添加至左侧的列表框中，文件名将被添加至右侧的表格中。若加载彩色图像文件时出错，可在左侧列表框中选择对应颜色名称，然后点击“移除颜色”（Remove Color）以删除相关文件。对每个荧光通道重复此操作。
9. 若需要基于某一荧光颜色生成额外的子区域掩模（例如，荧光标记的细胞核 → 核区掩模），请勾选“彩色掩模”（Color Mask）复选框。否则，跳至步骤 2.12。在“彩色掩模来源”（Color Mask Source）面板中，于文本编辑框内输入子区域掩模名称。从“彩色掩模来源”面板的下拉菜单中选择一种颜色（该颜色需已在步骤 6 中添加），然后点击“参数”按钮以打开阈值测试图形界面。
10. 点击“自动阈值”（Auto-threshold）按钮，使用 Otsu 方法自动确定阈值¹⁵，图像将高亮显示高于阈值的保留区域（图 4）。可通过编辑框手动调整阈值。使用滚动条确认阈值适用于所有时间点。确认无误后，点击“完成”（Done）将阈值返回至 FormatData 图形界面。
11. 点击“添加并分割”（Add and Segment）以使用所选彩色图像应用阈值模块生成子区域掩模。彩色掩模名称及其来源将显示在左侧表格中，相关已识别的文件名将出现在右侧表格中。（或者，点击“添加并选择”（Add and Select）以加载预先制作的子区域掩模文件。）
12. 在界面底部，指定或浏览至用作保存目录的目标文件夹。
13. 点击“格式化数据”（Format Data）以读取图像文件（使用 Francois Nedelec 开发的 tiffread2.m 代码，可访问：http://www.mathworks.com/MATLABcentral/fileexchange/10298），处理数据，并在指定文件夹中生成一个 *.mat 文件。该文件将作为 ProcessTimeSeries 图形界面的输入文件。
14. 对每个载物台位置的视频集重复执行步骤 2.4 至 2.13。

3. 使用 ProcessTimeSeries 图形用户界面随时间追踪细胞及其谱系，并校正编号与谱系分配（图 5）

1. 在 MATLAB 中运行 ProcessTimeSeries.m 文件以打开追踪图形用户界面（GUI）。打开 GUI 后，设置以下参数：
   • “腔室高度”（“文件输入/输出”面板，左上角）——此参数表示细胞被捕获的腔室高度。在根据细胞区域的长轴和短轴近似计算细胞体积为三维椭球体时，该参数被用作约束条件。 ⁸.
   • "μm/像素（“文件输入/输出”面板）——用于校准像素与长度单位的转换系数 μm 距离，以便在图像中计算横截面积和体积 μm² 和 μm³分别。
   • “滤镜”面板（位于“文件输入/输出”面板下方）——设置最小和最大参数以过滤掩膜中的无效区域：“面积”——区域的像素面积；“偏心率”——偏心因子，数值越接近圆形 → 0；“SF”——形状因子，越接近圆形其值越大 → 1.
2. 在“文件输入/输出”面板中点击“加载图像”，并选择由 FormatData 图形用户界面输出的所需 *.mat 数据文件。区域掩膜（以及任何子区域掩膜）将被应用于每个颜色通道，并进行多种不同的测量表1）。然后保存数据文件。（如果从之前的会话中加载文件进入 ProcessTimeSeries，系统将提示是否应从头重新开始分析。注意：这将清除所有已完成的轨迹校正工作，并将数据视为刚从 FormatData 图形界面导出的新数据。若不慎选择重新开始，请立即在 MATLAB 命令窗口中按下 Ctrl+C，以防止已校正的 *.mat 文件被覆盖。）
3. 接下来，追踪细胞。在“追踪细胞”面板（位于“筛选”面板旁）中，设置以下参数：
   • “最大位移”——在被标记为不同细胞之前，细胞在相邻图像之间移动的最大像素距离。位移值越高，算法越能适应细胞的较大移动，但也会增加在密集区域中匹配细胞区域的复杂性。我们从12开始设置，若在追踪过程中出现错误（见步骤3.4），则逐步降低该值。
   • “最小长度”——将细胞轨迹视为有效数据序列所需的最少出现次数。我们使用1以防止删除任何真实轨迹，但如果分割产生短暂的虚假区域轨迹，可增加此值。
   • “帧记忆”——细胞区域可消失并返回后仍被赋予相同编号的最大连续帧数。若其消失的帧数超过“帧记忆”设定值，则在重新出现时将被赋予新的编号。我们设定为2，以允许细胞区域在分割过程中最多连续丢失2帧后仍能被识别为同一区域。
4. 单击“追踪细胞”以利用区域质心逐帧追踪区域（Blair 和 Dufresne 基于 Crocker、Grier 和 Weeks 的 IDL 程序开发的 MATLAB 实现，可从以下网址获取： http://physics.georgetown.edu/MATLAB/），为新出现的芽体分配谱系，并保存数据。谱系通过最小化每帧中候选芽体与潜在母细胞之间的距离自动分配。（如果由于“复杂的组合计算”导致 MATLAB 命令窗口出现错误，可降低“最大位移”参数并重新进行追踪。）根据您的数据情况，在弹出窗口中必要时调整参数。
5. 使用各种图形用户界面工具或快捷键（点击“选定细胞信息”面板上方的按钮，可在弹出窗口中查看）对分割效果较差的区域以及细胞 ID 或谱系分配中的错误进行校正。
   • 滑块，“上一张图像”，“下一张图像”（Ctrl+左/右箭头）——用于显示图像序列中的帧并进行帧间切换。
   • “图像 #”——显示当前图像在左右坐标轴中的帧编号。通过在右侧的“图像 #”编辑框中输入帧编号，可跳转至指定帧。
   • “Delta帧”——显示左右轴之间帧编号的差异Δ = 右侧 - 左侧
   • “隐藏文本”（Ctrl+T）— 在右侧坐标轴中切换是否显示细胞 ID。
   • “隐藏标签”（Ctrl+L）— 在左侧坐标轴上显示或不显示细胞ID之间切换。
   • “掩膜”弹出菜单——可选择在左侧面板中不显示掩膜、显示细胞掩膜或任何用户自定义的子掩膜。
   • “叠加”弹出菜单（Ctrl+1-9）— 选择在左帧中显示明场（BF）和彩色图层。其中，“显示BF”是唯一可在两个轴向上切换明场图层开启或关闭的选项。通过再次在菜单中选择叠加名称，可切换其显示状态（“*”表示该叠加已显示）。Ctrl+1 切换BF叠加，Ctrl+2 至 Ctrl+9 按顺序切换彩色叠加图层。
   • “设置颜色”——用于确定叠加显示的颜色。弹出窗口将提示用户选择要设置的荧光通道，随后颜色调色板将出现，供用户自定义。
   • “修改区域和轨迹”面板——这些控件用于对细胞区域掩模和轨迹信息进行更改：
     • “更新轨迹”（Ctrl+U）——用于重新分配细胞编号。若右侧坐标轴中未选择任何细胞，图形界面将提示输入需更改的细胞编号。当将编号 X 更改为 Y 后，所有后续出现的 X 均会更改为 Y，而当前所有后续出现的 Y 则会切换为 X。（偶尔会出现单个细胞在两个编号之间反复切换的情况，这是由于追踪算法在过度分割区域中尝试兼容多个编号所致，而非“更新编号”功能本身存在错误。）可同时选择多个细胞并批量更改其编号，但 务必为每个分配一个唯一的 ID若要将区域分配给当前文件中不存在的 ID，请输入“0”，系统将自动生成一个 ID。使用 Ctrl+W 可交换两个高亮单元格的 ID。
     • “删除选定轨迹”（Ctrl+D）——用于删除当前右侧坐标轴帧中选定的单个细胞或多个细胞区域。（若未选择细胞，系统将提示输入编号。）若要永久删除某个ID轨迹的所有实例，请勾选“删除选定轨迹”按钮旁的复选框（文本将更改为“删除全部”）。此功能适用于清除持续存在的无效区域，但在执行前请先检查后续帧，确保该ID不会切换至有效的细胞或芽体区域。
     • “合并区域”（Ctrl+A 或 M）——平滑并合并细胞区域。在右侧坐标轴中单击一个或多个细胞以进行选择（选中的区域将变为红色）。对单个区域执行合并操作时，将使用盘状结构元素在形态学上闭合，以填充裂隙或微小缺失部分。对两个或多个相邻区域执行合并时，会将其合并为一个区域，并赋予新区域中最低的 ID 编号。此功能适用于过度分割的区域（常见于细胞具有较大液泡时）。
     • “绘制区域”——使用鼠标在右侧坐标轴中绘制所需区域，双击完成绘制。请输入数据集中尚未使用的唯一ID（介于1至65535之间）。如需取消，请按键盘上的删除键。
   • “谱系追踪”面板——追踪完成后，系统将自动生成谱系分配。当出现新的ID区域时，新细胞ID以粉红色显示，并用红色线条连接至其母区域。那些过大而不可能是芽体或距离潜在母细胞过远的新区域将以绿色显示，并被赋予“NaN”（“非数字”）的母ID（参见 表 2）。在第一个时间点存在的区域，其母细胞ID为“0”。要修正单个细胞的谱系分配，请在文本编辑框中输入母细胞和芽生细胞的ID，然后点击“修正”。要清除某个细胞的母细胞，可将其母细胞ID设为“0”。更快捷的方法是在右侧图像中选择两个区域，然后按Ctrl+F键，系统将自动将较早出现的区域指定为母细胞，较新出现的区域指定为子细胞，并清除该子细胞之前存在的任何母细胞分配。注意：在任何时候点击“计算谱系”都将重新计算所有谱系分配，包括用户先前手动校正过的部分。
   • “选定细胞信息”面板——“获取信息”将显示右侧坐标轴中选定区域的一些测量值。“测量”…允许用户确定显示哪些测量值（并可定义其他操作（如“导出数据”）的默认列表）。可用于确定正确的编号和谱系例如 如果细胞X在时间t有一个芽体，那么在时间t + 5分钟时很可能不会再有另一个芽体。
   • “保存更改”（Ctrl+S）——更新 *.mat 文件以反映用户的修改。请频繁使用此功能（无撤销功能）！
   • “生成图表”——打开 GeneratePlots 图形用户界面。用于快速绘制在 ProcessTimeSeries GUI 右侧坐标轴中高亮显示的单细胞区域、其均值或每帧中所有区域均值的选定变量信息及简单计算结果。该界面可计算粗略的一阶导数，但需确保在左上角指定正确的时间间隔。通过点击“生成图形”可将图表输出为图形文件以供保存。
6. 为正确整理数据：合并任何过度分割的区域；删除未能完整捕获整个细胞的区域；确保母细胞-芽体关系被正确分配（在芽体出现时，两者之间会显示一条红线，此时芽体 ID 呈粉红色，参见 表 2）；并通过修正ID、为该区域指定母细胞、指定无母细胞（“0”）或删除该区域来消除所有绿色ID。在最终分析中，芽体数据将被合并到其母细胞的数据中，因此请勿将芽体区域与其母细胞合并（否则会导致体积估算不准确）。
7. 目视检查每个时间帧的数据，直至感兴趣的最后时间点；若不使用后续帧，则无需检查整个时间序列。
8. 务必保存更改。
9. 对每个阶段位置的 *.mat 文件重复执行步骤 3.1–3.7。

4. 导出数据以进行分析

1. 如需简单地按时间导出每个细胞的原始区域测量数据，请点击“Export Data”。在打开的图形用户界面中可选择感兴趣的测量参数，数据将被输出为以空格分隔的 *.txt 文件，变量名称作为列标题。
2. 要分析随时间变化的全细胞时间序列、计算细胞周期信息并进行微分运算，请点击“时间序列分析”。此时将弹出一个窗口，用于选择感兴趣的测量参数并输入分析参数（图6).
3. 输入在图形用户界面中整理的最后一个时间点（此后所有帧将被忽略）。默认的平滑处理和细胞周期分配参数适用于我们以5分钟间隔成像的单倍体和二倍体菌株，但为获得最佳结果，这些参数可能需要调整。（可通过手动确定测试数据集的出芽和分裂时间，并与自动算法的性能进行比较，以验证参数值是否合适。）
4. 当所有参数设置完毕后，点击“Analyze”以：
   1. 为每项原始测量值构建数组，并减去背景（背景定义为每段荧光视频第一帧中非细胞区域的平均强度，也可设定为每个细胞像素的平均自发荧光值）。
   2. 对所选测量值拟合平滑样条曲线，以消除高频测量噪声（如文中所述）。 ⁹).
   3. 根据体积时间序列斜率的变化，自动确定每个细胞的出芽起始时间和细胞分裂时间，如文中所述。 ⁹将每个周期中出芽的测量数据添加到母细胞从出芽到分裂期间的测量数据中，以获得连续的全细胞周期时间序列。同时将计算归一化的细胞周期进程，其范围从分裂到分裂为0到2。
   4. 拟合平滑样条以获取稳定的1^st 和 2^nd 所选测量值的导数。（为了获得定义明确的导数，通过将后续细胞周期的数据进行平移以与前一个周期的终点对齐，从而使时间序列在分裂点处连续。）
   5. 输出所有区域的原始和经平滑处理的时间序列，以及每个测量值对应的全细胞平滑、连续和微分后的时间序列数组。数组的第一个元素为用于背景扣除的颜色索引，第一行其余元素为细胞编号，第一列其余元素为帧编号，其余元素按列存储每个单细胞的时间序列，每一行对应第一列中指定的帧。还将输出类似的细胞周期进程时间序列及谱系信息数组。“LineageArray”数组包含一个表格，每行代表一个母细胞-芽细胞关系，前五列分别为母细胞编号、芽细胞编号、芽区域首次出现的帧、估计出芽帧和估计分裂帧。数据将导出为 *.mat 文件（MATLAB 数据文件）。

结果

成功执行并分析的实验将获得大多数单个完整细胞的连续时间序列数据，并合理分配芽体出现和分裂时间。例如，我们使用表达由组成型 ADH1 启动子驱动的整合型蓝色荧光蛋白（CFP）的单倍体酵母菌株执行了上述方案，以观察单个细胞中生长和全局表达随时间的变化情况（表4，Y47）。我们进行了时间序列分析，以获得随时间变化的全细胞（图7A）测量值，结果发现体积和表达均呈现出与细胞周期相关的依赖性，这与文献⁹中的发现一致。芽体形成后，总体积（母细胞 + 芽体）的增长速度比芽体出现前更快（与文献^8,16结果一致），而蛋白质浓度或平均荧光强度则略有下降（图7B 和 7C）。总的整合蛋白量（此处为体积 × 浓度）的上升也在出芽后加快（图7D）。与仅分析母细胞区域的结果（图7B&D）相比，这些结果表明在全细胞测量中正确纳入芽体贡献的重要性，并凸显了准确确定芽体形成和分裂时间的必要性。正如我们此前报道的

讨论

上述方案描述了一种简单的方法，可用于获取和分析荧光时间序列数据，且对微流控技术或软件开发经验要求较低。该方法能够获得单个酵母细胞的延时荧光图像，提取相关的细胞大小和表达量数据，校正细胞追踪与谱系分配，并利用市售的微流控培养装置和多功能图形用户界面（GUI）对细胞随时间变化的行为进行分析。尽管此前已有多种方法用于实验操作、图像分割和细胞追踪^11,13,14，但上述流程旨在使这些技术更易于被更广泛的生物学研究群体所采用。虽然本方案针对特定的微流控培养装置进行了优化，但随着即用型微流控培养技术成本降低且可定制性增强，整体分析流程也可适配于类似的装置。本质上，我们所采用的图像分割与区域测量算法与现有方法相似^13,14，但GRAFTS软件增加了对区域追踪和谱系分配进行可视化校正的能力，并能准确标注细胞周期阶段。这两项功能对于精确计算数据序列的时间导数至关重要。

在实验方案中有多个步骤会显著影响最终时间序列数据的质量。最初向培养室接种过多细胞会降低室内的灌注效率（在动力学实验中尤其明显，因为培养室更新时间至关重要），并导致实验过程中细胞过早过度生长...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Y04C 酵母灌流板	CellAsic	Y04C-02
ONIX 微流控灌流平台	CellAsic	EV-262
Axio Observer.Z1 显微镜	Zeiss
Plan-Apochromat 63x/1.40 油镜 DIC 物镜	Zeiss	440762-9904-000
Cascade II EMCCD 相机	Photometrics
Lumen 200 金属卤化物弧光灯	PRIOR Scientific
三通带通二向色滤光片立方体及激发与发射滤光片组	Chroma Technology Corp	set #89006	用于 YFP (Venus/Citrine)、CFP (Cerulean)、RFP (mCherry/tdTomato)
MAC 5000 控制器及滤光轮	Ludl Electronic Products
MATLAB R2011a	Mathworks		64 位版本处理大型数据文件优于 32 位版本