本文描述了用于构建人类三维肿瘤组织作为测试系统的方法。这些技术基于脱细胞生物血管化支架（BioVaSc）、原代人类细胞和肿瘤细胞系，可在静态条件下以及流动生物反应器的动态条件下进行培养。
本文内容
摘要
摘要
癌症是全球主要的死亡原因之一。目前的治疗策略主要在二维培养系统中开发，而这些系统无法充分反映体内的生理条件。in vivo。三维生物基质为细胞提供了可自我组织的环境，从而能够研究组织结构和细胞分化。此类支架可接种多种不同类型细胞的混合物，以研究三维环境下的直接细胞-细胞相互作用。为模拟癌症肿瘤的三维复杂性，本研究团队开发了一种三维in vitro肿瘤检测系统。
我们的3D组织检测系统模拟了 体内 恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）模型的构建基于我们开发的脱细胞猪空肠段生物血管化支架（BioVaSc）。在本模型中，我们将经改良的BioVaSc基质重新接种原代成纤维细胞、微血管内皮细胞（mvECs）以及S462肿瘤细胞系。对于静态培养，需去除BioVaSc的血管结构，并将剩余支架一侧切开展开（小肠黏膜下层SIS-Muc），所得基质固定于两个金属环（细胞环）之间。
另一种选择是在流动生物反应器系统中培养接种了细胞的SIS-Muc，使细胞受到剪切应力的作用。在此系统中，生物反应器连接至一个置于自制培养箱内的蠕动泵。计算机通过血压、温度和流速等参数调节动脉氧和营养物质的供应。该装置可实现动态培养，支持压力调控的脉动流或恒定流。
在本研究中，我们成功建立了恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）的静态和动态三维培养系统。在更接近自然的三维环境中模拟肿瘤模型，将有助于在类人模型中发现、测试和验证未来的药物。
引言
新药在获得上市许可之前，必须对其质量、安全性和有效性进行验证。迄今为止，动物实验是药物测试与验证的标准方法。然而，由于物种间的特异性差异，动物实验往往无法全面评估化合物在人体中的效应 1因此，建立可用于研究的人体组织模型非常重要 体外 新药和物质的测试。
我们课题组的研究重点之一是利用生物血管化支架（BioVaSc）2,3构建体外（in vitro）测试模型。BioVaSc 可用作静态或动态的三维基质系统。在静态培养中，将脱细胞猪空肠段（小肠黏膜下层 SIS-Muc）置于金属支架环内，用于细胞重接种。多种细胞（如癌细胞和内皮细胞）均可在该支架上进行培养。
在动态培养中，将BioVaSc连接至生物反应器系统，以在血管网络内或支架表面施加流体作用。目前的生物反应器可施加生物、机械或电刺激，以影响细胞的分化或增殖。 4在组织工程领域的生物反应器，其基本概念是模拟人体内的环境，为细胞提供一个自然的环境，使其能够相互之间以及与其周围的细胞外基质进行相互作用。用于生产 体外 测试系统或移植中，利用合适的载体结构和生物反应器系统来模拟细胞的天然环境至关重要 5因此，必须开发出更复杂且技术要求更高的设备，以完成这些任务。 6.
此外，由于该支架保留了包括供血动脉、静脉以及相连的毛细血管床在内的管状结构，因此还可用于构建血管化模型。所有猪源性细胞需通过化学、机械和酶学方法进行脱细胞处理，并对支架进行γ射线灭菌。随后可利用循环灌注生物反应器，将人微血管内皮细胞重新接种至恢复的管状血管结构中7，该反应器可模拟pH值、温度、压力、营养供给和废物清除等生物力学和/或生物化学参数6。管状结构的再内皮化可在胶原支架内形成类似人源性血管的结构3,7。下一步，可将原腔面（黏膜层）接种人原代细胞，以建立共培养体系3,7,8。
本研究通过在SIS-Muc上共培养肿瘤细胞系与原代基质细胞，并在静态和动态条件下建立三维肿瘤检测系统。
方案
1. BioVaSc 的脱细胞化
- 通过插管的动脉通路和肠腔用PBS冲洗猪空肠节段的血管系统-重复操作直至完全洁净。
- 准备一个直径为200 mm的玻璃罐，配备4个接口，并通过硅胶管连接至蠕动泵（Ismatec）。压力控制单元可进行监测 通过 连接至无菌一次性圆顶的压力传感器（参见 图1).
- 用脱细胞化（DZ）溶液填充储液瓶，并检查管路系统中是否存在气泡。
- 用扎带将肠腔与玻璃连接器相连，以实现腔内液体流动。将500 ml DZ溶液泵入红色动脉通路（图1B) 血管系统。每15分钟短暂中断灌流过程，手动挤压以排空整个肠腔。
- 脱细胞过程中，缓冲液的压力应保持在80 - 100 mm Hg之间，以模拟自然血压。
- 用 PBS 清洗 BioVaSc- 直至细胞残余物完全去除（“完全呈白色”）。
- 将BioVaSc完全填充DZ溶液，并在4 °C下于摇床中浸没于DZ溶液中过夜孵育。
- 重复步骤 1.6。
- 将BioVaSc置于DNase溶液中，于4 °C在摇床中孵育过夜。
- 去除DNase溶液，并用洗涤缓冲液冲洗。
- γ-射线辐照灭菌（25 kGy）
2. 不同的细胞类型
2.1 原代人皮肤微血管内皮细胞（mvECs）和成纤维细胞的分离
- 用手术刀将皮肤活检组织（ preferably 包皮）切成 2 - 3 mm 宽的条状，并用 PBS- 溶液冲洗 3 次。
- 用 Dispase 溶液覆盖组织，在 4 °C 下孵育 16 - 18 小时。
- 用两把镊子将表皮与真皮分离，并分别转移至盛有 PBS+ 的培养皿中。
- 用 Versene 冲洗真皮条 1 次。
- 向真皮条中加入 10 ml 胰蛋白酶/EDTA 溶液，在培养箱中孵育 40 分钟。
- 立即加入 1% FCS 终止酶反应。
- 将皮肤条转移至盛有 VascuLife 培养基的培养皿中，用手术刀在每侧刮擦 8 次，施加轻微压力。
- 将所得的细胞悬液通过细胞筛网转移至离心管中，并用 VascuLife 冲洗筛网 3 次。
- 以 1,200 × g 离心 5 分钟，用 VascuLife 重悬细胞沉淀。
- 为分离成纤维细胞，用手术刀将真皮条切成小块。
- 向真皮组织块中加入 10 ml 胶原酶溶液。
- 在培养箱中孵育 45 分钟，然后离心并小心移除上清液。
- 用 DMEM + 10% FCS + % PenStrep 洗涤沉淀 1 次，离心后小心移除上清液。
- 用培养基重悬沉淀，并转移至 T75 培养瓶中，使细胞从组织中生长出来。
2.2 肿瘤细胞系 S462
肿瘤细胞系S462（由柏林夏里特医学院Nikola Holtkamp博士惠赠）源自一名患有遗传性肿瘤易感综合征1型神经纤维瘤病的女性患者的恶性外周神经鞘瘤9。S462细胞在添加了10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。培养基需每2至3天更换一次。细胞需每周传代一次。
3. 肿瘤测试系统：静态培养条件与生物反应器系统中动态培养的比较
- 将管状 SIS-Muc 从一侧切开，并固定在两个金属环之间（细胞环，直径 10 mm，自行构建）。用细胞培养基覆盖 SIS-Muc 过夜。
- 将分离的细胞以特定数量（见下文）接种到 SIS 的一侧或两侧（单培养或共培养体系）。
- 在 SIS 的基底外侧表面（原浆膜侧）接种 8,000 个细胞/cm2 的原代 mvECs，总体积为 100 μl。3 小时后向孔中加满培养基，以确保浸没式培养。
- 让内皮细胞贴壁培养 3 天。将静态培养系统翻转 180°，并转移至 12 孔板中。
- 在 SIS 的顶侧表面（原管腔侧）以 500 μl 总体积接种含有原代皮肤成纤维细胞（8,000 个细胞/cm2）和肿瘤细胞（15,000 个细胞/cm2）的混合细胞悬液。
- 让细胞贴壁 3 小时，然后加满培养基（浸没式培养，培养基：50% Vasculife + 50% DMEM，添加 10% FCS）。
- 肿瘤测试体系在培养箱中于 37 °C、5% CO2 条件下静态培养额外 14 天。每 2–3 天更换一次培养基。
- 对于动态培养，将 SIS-Muc 固定在两个金属环之间，并按照步骤 3.2.1 所述接种原代 mvECs。3 天后将 SIS-Muc 从金属环上取下，并将膜插入流动反应器中（见 图 2C 和 2D）。使用注射器和套管将原代皮肤成纤维细胞和肿瘤细胞接种到生物反应器内的基质上，让细胞贴壁 3 小时后，再向生物反应器系统中加入培养基。
- 次日可启动动态培养条件，持续介质流动（流速 3.8 ml/min，37 °C，5% CO2）。动态培养维持 14 天，于第 7 天更换培养基。
- 动态测试装置培养于自行构建的培养箱中，该培养箱通过泵提供培养基流动，并维持所需的温度和 CO2 浓度。
4. 分析的表征方法
4.1 接种胶原基质的固定与石蜡包埋
- 进行（免疫）组织学表征时，移除培养基，并用 4% 多聚甲醛固定组织 2 小时。
- 移除 4% 多聚甲醛，将 SIS 从金属插件转移至组织包埋盒中，用水冲洗组织以去除残留固定剂，并进行脱水以备石蜡浸润。
- 在包埋成石蜡块之前，将 SIS 切成 2–3 片，并将其放入盛有石蜡的金属底模中，使切面朝下。将组织包埋盒置于模具上方作为支撑。
- 切取 5 μm 的切片，将其漂浮于 40 °C 的水浴中展平，然后将切片转移至合适的载玻片上。未包被的载玻片用于 H&E 染色，多聚赖氨酸包被的载玻片用于免疫组织化学染色以增强附着性。让切片充分干燥。
- 熔化石蜡，用二甲苯去除石蜡，然后对切片进行再水化，以进行后续染色。
4.2 染色
- 复水后的切片可用苏木精/伊红进行标准化的概览性染色。
- 对于免疫组织化学染色，固定并浸润石蜡的组织切片必须进行抗原修复，以使抗体能够识别并结合其特异性表位。因此，脱蜡并复水的切片需置于含加热柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）的蒸汽锅中处理20分钟。
- 将切片转移至洗涤缓冲液（0.5 M TBS缓冲液 + 0.5% Tween）中，并用PAP笔在切片周围画圈，以减少染色液所需用量。
- 将切片置于湿盒中。为确保辣根过氧化物酶介导的抗原-抗体结合特异性显色，需用3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶活性。
- 将一抗稀释液加至切片上，在室温孵育1小时，随后用洗涤缓冲液小心洗去。
- 检测特异性抗原-抗体结合时，采用Ultra Vision Quanto Detection System HRP DAB（Thermo Scientific），操作按照推荐方案进行。
- 细胞核用苏木精复染1分钟。
- 切片用水溶性封片剂封片，干燥后使用倒置显微镜成像。
结果
如图1B所示，我们对猪空肠节段（长约2 m，直径约20 mm）进行了脱细胞处理，同时保留了毛细血管网络的管状结构。经过化学、酶学和机械方法的脱细胞处理后，获得了由I型和III型胶原组成的支架，可用于三维细胞培养。通过Feulgen染色检测证实该基质的纯度（无DNA残留）（数据未显示）。
图2A 和 2B 显示了由细胞环固定的SIS-Muc静态培养状态。我们将SIS-Muc固定在自行设计的生物反应器中（图2C），用于动态培养。图2D 展示了通过生物反应器腔室的模拟动态流。该生物反应器置于自制的培养箱系统中，并与蠕动泵相连。此装置可实现压力调控的脉动流或恒定流的动态培养。
图3展示了在2D单层培养（图3A）和3D共培养（图3B-3D）条件下静态培养的S462肿瘤细胞系的总体情况。图3B显示了在SIS-Muc的顶侧（原先的内腔面）接种S462肿瘤细胞和原代成纤维细胞，同时在基底外侧（原先的浆膜侧）接种mvEC所形成的三联共培养体系。通过染色细胞类型特异性标志物可区分不同类型的细胞，例如使用血管性血友病因子（von Willebrand factor）标记mvEC（图3C）。p53阳性的S462细胞可与p53阴性的原代成纤维细胞区分开来（图3D），并可分析细胞在三维空间中的分布情况。图4展示了动态培养条件下三联共培养体系的染色结果，其染色方式与图3相对应。
图1. 脱细胞化装置示意图。（A） 用于对BioVaSc进行脱细胞化的生物反应器与泵系统装置，由计算机监控。（B） 置于玻璃容器中的脱细胞化BioVaSc。管腔和动脉入口连接至适配器。.
图2. 不同培养装置的概述。（A）微孔板中静态培养系统的CAD剖面图，（B）用于静态培养的金属插入件，（C）流动生物反应器上盖在动态培养条件下的培养基流动模拟（速度场 [m/sec]），（D）用于动态培养并连接至蠕动泵的流动生物反应器。 点击此处查看高清大图
图3. 静态3D肿瘤模型的免疫组织学表征概览。(A) S462细胞在Permanox载片上静态培养的2D单层培养物的苏木精染色，(B) 静态培养的3D三联培养物的H&E染色，箭头标记内皮细胞，(C) Ⅷ因子相关抗原（von Willebrand factor）的免疫组织学染色，(D) p53的免疫组织学染色。 点击此处查看大图
图 4. 动态三维肿瘤模型免疫组织学表征的总体概述。(A) 动态培养的三维三细胞共培养体系的苏木精-伊红（H&E）染色，箭头指示内皮细胞，(B) 血管性血友病因子（von Willebrand factor）的免疫组织化学染色，(C) p53 的免疫组织化学染色。 点击此处查看高清大图
讨论
在比较肿瘤研究中的二维（2D）与三维（3D）培养系统时，尽管3D系统成本较高，但已被证实能更有效地模拟生物微环境中的条件。研究表明，某些肿瘤细胞在3D培养中的生长速度明显慢于传统的2D培养。 12，这与真实肿瘤中的情况一致。Bissell 及其同事在其研究中表明，致癌性乳腺细胞的行为反映了 体内 情况，包括细胞形态和信号传导，当在基质内的三维培养提供了细胞与细胞外基质（ECM）相互作用时，能更准确地反映。此外，他们通过证明环境相互作用的改变可导致恶性细胞逆转为正常表型，进一步强调了三维条件下细胞外环境的重要性。另外，最重要的是，这些结果在 体内 动物模型 10,11.
直接比较 体内 动物实验和 体外 组织模型揭示了两种系统各自的优点与局限性。其中一种系统的优点是 体外 模型的优势在于允许通过显微镜进行更高质量的实时或固定成像。其局限性在于，它们模拟的是静态或短期条件，而 体内 系统常会进展。当前缺乏血管系统和小分子的正常运输、宿主免疫反应以及其他细胞间相互作用，是其进一步的缺点。 体外 模型 12。因此，3D 体外 本研究中所展示的系统为动物实验提供了极具前景的补充，其更接近人体的生理环境，从而降低了实验结果误读的可能性。仿生学 体内 因此，模型系统将变得更加重要，可用于研究癌症及转移扩散如何依赖于调控肿瘤发生的微环境条件 11.
我们的研究表明，SIS-Muc所提供的3D环境可诱导细胞形成更接近肿瘤组织的结构，而这种现象在常规的2D细胞培养中并未观察到（见图3A）。此外，使用来源于肿瘤活检组织的原代细胞是迈向个体化医学的重要一步，个体化医学旨在根据患者的具体情况确定最佳治疗方案。将从活检材料中分离出的患者特异性原代肿瘤细胞整合入模型，可实现治疗策略的体外测试。此类测试系统可用于多种药物及其组合方案的高通量筛选，从而节省时间和成本。此外，如本研究所示，整合肿瘤相关间质细胞对个体化治疗策略也具有重要意义，因为肿瘤微环境会影响肿瘤的进展13，并可能成为潜在的治疗靶点。
除了个性化方法外，我们的肿瘤模型还可通过引入已建立的致瘤性细胞系，改造为通用型肿瘤测试系统。这种改进在基础研究中具有广阔前景。无论采用哪种药物测试方法，均需要存在血管结构，以评估治疗物质的分布与摄取情况。SIS-Muc基质可实现原代微血管内皮细胞（mvEC）的基底侧接种，用于屏障摄取研究；而对BioVaSc中保留的血管结构进行重新接种，将进一步优化药物递送的研究。
为了构建组织模型，可使用三维可生物降解基质作为不同细胞类型共培养的支架 14. 此类3D基质的应用常受限于缺乏功能性血管化。该问题可通过使用BioVaSc解决，因其保留了血管结构，可重新接种内皮细胞。此外，BioVaSc提供细胞外成分，可促进细胞黏附并支持组织分化。它还能维持生物人工3D组织的长期组织特异性功能 7,8,15功能性血管替代物构建的前提是模拟人体生理和生物力学条件。因此，能够实现这些要求的生物反应器系统 体外对于构建生物肿瘤模型具有极高的研究价值。
将BioVaSc、生物反应器技术与不同类型细胞的共培养相结合，是一种非常有前景的方法，可用于生成具有血管化的肿瘤组织，从而研究与癌症进展相关的机制，如血管生成和转移。我们认为，此类肿瘤模型有望作为动物实验的补充，因其能够提供类似于人类肿瘤生理学的实验体系。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Jan Hansmann（弗劳恩霍夫界面工程与生物技术研究所，斯图加特）在生物反应器及生物反应器培养箱开发过程中提供的技术支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶原酶溶液 | SERVA | 17454 | (500 U/ml) |
| 中性蛋白酶溶液 | Gibco | 17105-041 | (2.0 U/ml) |
| DMEM 高糖培养基 | PAA | G0001,3010 | |
| 脱氧核糖核酸酶（DNase） | ROCHE | 10104159001 | 200 mg 溶于 500 ml PBS+ + 1% 青霉素-链霉素 |
| DZ 溶液 | Roth | 3484.2 | 34 g 脱氧胆酸钠溶于 1 L 超纯水 |
| 胎牛血清（FCS） | LONZA | DE14-801F | |
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| 医用压力传感器 | MEMSCAP | SP844 | |
| 单克隆小鼠抗人血管性血友病因子抗体 | DAKO Cytomation | M0616 | 克隆株 F8/86，0.12 μg/ml |
| 小鼠单克隆抗人 p53 抗体 | DAKO Cytomation | IS616 | 克隆株 DO-7，即用型 |
| 蠕动泵 | Ismatec | ||
| 无菌一次性穹顶装置 | MEMSCAP | 844-28 | |
| 胰蛋白酶/EDTA 溶液 | PAA | L11-003 | 0.05% |
| VascuLife (VEGF-Mv) | Lifeline | LL-0003 | |
| Versene | Gibco | 15040-033 |
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