一种结合眼内移植与共聚焦显微镜的新方法，可实现对移植组织内细胞的纵向、无创实时成像，分辨率达单细胞水平 体内我们展示了如何将胰岛移植到小鼠眼球前房。
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摘要
摘要
活体成像已成为生物研究中不可或缺的工具。在此过程中，已发展出多种成像技术，用于非侵入性地研究动物体内的不同生物学过程。然而，现有活体成像方法面临的主要技术局限在于难以同时实现非侵入性、长期纵向成像与单细胞分辨率。本文展示了将样本移植至眼前房如何克服这一重大限制，提供了一个多功能的实验平台，可实现具有细胞分辨率的非侵入性、长期纵向成像 体内我们展示了小鼠体内的移植操作，并采用具有临床相关性的胰岛移植模型提供了代表性结果。该方法不仅能够实现对移植至眼前房的各种组织进行直接可视化观察，还提供了一个通过长期随访和靶组织监测来筛选药物的平台。由于其多功能性，眼前房组织/细胞移植不仅有利于移植治疗的发展，还可拓展至其他领域 体内 用于研究生理和病理生理过程，如信号转导以及癌症或自身免疫性疾病的发生。
引言
活体显微技术的进步揭示了先前未被预测的生理现象 体外 研究1这凸显了在将传统方法获得的研究结果进行转化时所面临的挑战 体外 将方法应用于活体动物。在过去十年中，随着成像技术的不断进步，活体动物组织的可视化水平得到了显著提升2, 3, 4, 5, 6这促使人们迫切需要 体内 可在实验动物模型中应用的成像方法，以实现对目标组织的无创纵向可视化观察。
磁共振成像、正电子发射断层扫描或生物发光等成像技术已实现对体内深层器官/组织的无创成像7-8, 9但这些技术由于背景信号较高且空间分辨率较低，即使使用了高对比度材料或组织特异性发光物质，也无法达到单细胞分辨率。4这随着双光子荧光共聚焦显微镜的出现而得到解决10双光子显微镜实现了活体成像研究，能够以前所未有的细节可视化并量化细胞事件11, 12这促进了对健康与疾病状态下关键生物过程的表征研究13, 14, 15, 16. 尽管早期的活体成像研究主要采用“模拟”方式 体内 离体组织中的条件（例如 淋巴结），其他研究则采用侵入性方法对暴露的目标组织进行成像 原位17, 18, 19, 20, 21其他研究也已采用“窗式观察室模型”来克服侵入性方法及成像分辨率有限所带来的局限性 体内22, 23, 24, 25在窗式培养皿模型中，将带有透明窗口的培养皿通过手术植入动物体内的不同部位（如背部皮肤、耳部皮肤、乳腺脂肪垫、肝脏等）例如 小鼠、大鼠、兔子）。尽管该方法显然能够实现高分辨率 体内 成像需要进行侵入性手术以植入观察窗，且可能无法支持持续数周或数月的纵向成像研究22.
最近的研究表明，将高分辨率共聚焦显微镜与一种微创手术——眼前房（ACE）移植技术相结合，可提供一个“天然的体内窗口”，具有强大且多样的应用潜力。 体内 成像平台26, 27将组织移植到ACE中已在过去几十年中被用于研究多种组织的生物学特性 28, 29, 30；最近与高分辨率成像技术结合，使得能够以单细胞分辨率对胰岛生理进行无创且纵向的研究26, 27该方法已被用于研究动物模型中1型糖尿病发展过程中的自身免疫反应（未发表数据）。此外，还通过分别移植到ACE胰腺芽或单个肾小球，用于研究胰腺发育以及肾脏功能（未发表数据）。最近一项采用该方法的研究进一步证明了其在胰岛移植后免疫反应研究中的应用价值。31重要的是，本研究表明，将组织移植至眼前房可提供一个天然的体内观察窗口，用于实现：（1）对移植组织进行纵向、无创成像 体内; (2) 体内 细胞标记以评估细胞表型和活力 原位（3）对靶组织中浸润的免疫细胞进行实时追踪；以及（4）通过局部给药或眼内注射进行局部干预。
在此，我们演示如何使用胰岛进行眼前房移植。
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方案
以下操作在体视显微镜下分两步进行：第一步是将胰岛加载至套管中，第二步是将其实际移植到肾包膜下腔隙（ACE）。所有动物实验均经迈阿密大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
1. 将胰岛装载入导管以进行移植
- 通过以逐渐缩小的圆周旋转培养皿，将胰岛居中。
- 将套管从“储液器”上断开，并将套管及连接管路放置于清洁表面。储液器可使用无滤芯的300 μl一次性塑料移液枪头制作（图1a）。
- 推动脚踏开关，驱动免手持电动注射泵向前推进，排出储液器中的气泡，以确保在吸取胰岛时能形成连续的流体。此操作同时可在注射器内留出空间，以便将胰岛吸入已预装无菌溶液（如生理盐水、PBS或培养基）的储液器中（图1b, c）。
- 使用脚踏开关驱动电动注射泵向后回抽，轻柔地将所需数量的胰岛吸入储液器。胰岛进入储液器时会呈旋涡状，并聚集在底部。
- 通过连接管路将套管重新连接至储液器。
- 将套管尖端放回培养皿中，推动胰岛从储液器经管路进入套管。在回填管路/套管时，轻轻“弹击”（轻敲）管路，确保胰岛保持聚集状态（图1d）。可在所有位于胰岛前方的气泡被完全排出套管之前或之后停止操作。若不确定，建议在胰岛刚进入套管后端时即停止，保留部分前方气泡有助于防止胰岛从ACE装置中反流（回流）。残留气泡将在过夜期间消散。
- 至此，您已准备好将胰岛注入ACE装置（请参见后续步骤）。
2. 胰岛移植至眼前房
- 将麻醉后的小鼠置于体视显微镜下的保温垫上。
- 将小鼠的鼻部放入连接氧气/异氟烷麻醉机的麻醉“面罩”中。该面罩由一个1 ml的一次性塑料移液器吸头（无滤芯）制成，并通过其狭窄端连接麻醉管路（图2a,b）。
- 用非持器手的拇指和食指轻轻拉开待移植眼的眼睑，将眼球轻柔“挤出”，以获得更好的暴露和操作空间（图2c）。此操作需要一定练习，以避免因颈部受压过度而影响小鼠呼吸，或阻碍头部血液回流。
- 使用一次性胰岛素注射器（29–31G）作为手术刀，仅将针尖小心刺入角膜，做单一侧向切口。切口位置应位于角膜顶点与角膜缘之间的中点，以最大限度减少胰岛在注射过程中从眼前房（ACE）反流（图2d）。
- 将预装胰岛的套管经切口小心插入。
- 缓慢将胰岛从套管中推出，并沉积于虹膜表面。为避免因眼前房（ACE）内压力升高导致胰岛反流，应在切口对侧象限以尽可能小的体积进行短暂、间歇性推注。通过在装载套管时将胰岛在管路中压紧，可进一步确保此效果（详见步骤1.6）。
- 缓慢将套管从眼前房（ACE）中撤出。此步骤尤为关键，特别是当注射胰岛体积较大时，眼前房内压力积聚可能导致胰岛反流不可避免。为消除或最小化反流，可在套管仍位于眼前房内时轻轻旋转套管，使多余压力经套管周围的切口释放。在撤出套管时应观察是否有反流迹象，必要时需等待压力下降后再完全撤出套管。
- 用无菌PBS或生理盐水冲洗移植眼。
- 术后前48小时，皮下注射布托啡诺用于镇痛（0.05–0.1 mg/kg）。
- 移植后立即在移植眼上涂抹红霉素眼用抗生素软膏。
- 将动物放回加温的笼盒中，使其从麻醉中恢复。
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结果
定义一次“良好”移植手术的参数有若干项。良好的移植手术在切开时应无出血，如视频中所示。通过仅将手术刀（针头）的尖端刺入ACE，可防止或尽量减少出血。图3a这也有助于防止与虹膜接触或刺穿虹膜，同时确保切口较小，愈合良好，长期不会引起角膜混浊。图3c，d）。成功移植的另一个重要方面是能够将所需数量的胰岛全部移植，避免因胰岛从胆总管反流而导致损失。如方案步骤1.6所述，可通过以尽可能小的体积注射胰岛，以及在适用情况下，于套管从胆总管撤出前使用气泡帮助封闭切口，从而最大限度减少反流。图3b）。此外，将胰岛递送至瞳孔边缘与角膜缘之间的虹膜表面，可使胰岛处于一个极为适宜的位置，便于后续观察和操作。 体内 成像（图3d）。从实际角度来看，将胰岛置于虹膜的这一中间位置，可减少覆盖整个胰岛所需的成像z轴堆栈的厚度（图4）。这在荧光共聚焦/双光子显微镜成像过程中尤为重要 体内 成像时，较薄的z轴堆栈可减少组织对光的散射，从而在成像组织的深层区域实现更优的...
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讨论
采用胶原酶消化法分离小鼠胰岛，随后通过密度梯度纯化，方法如前所述33。分离的胰岛在移植前进行过夜培养。尽管此步骤可能并非必需，但建议让胰岛从分离操作中恢复。当移植操作在糖尿病受体中进行时，这一步骤尤为关键，可确保移植存活且功能健全的胰岛。
移植手术在全身麻醉下进行，通过吸入氧气/异氟烷混合气体（1.5–3%）以达到麻醉效果。也可使用其他吸入性或注射性麻醉剂（例如氯胺酮）。若使用注射麻醉，则跳过方案中的步骤2.2。手术过程中需为麻醉动物提供热源，以防止低体温。在某些小鼠中，于通常无血管的角膜上做切口时可能损伤血管。例如，裸鼠的角膜往往存在血管化现象；应尽可能避开血管化区域。每次切口应使用新的注射器。做切口时避免针头刺穿虹膜。为避免与虹膜接触，可将针头斜面朝向虹膜侧。切口后不要干燥或抽吸房水。在“湿润”的角膜上更易于将导管穿过切口；必要时可在角膜上滴加少量无菌PBS或培养基。
术后镇痛可在前48小时通过皮下注射布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg）或首选镇痛药实现。在步骤2.9中，我们在手...
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披露
P-O.B. 是生物技术公司 Biocrine 的创始人之一，该公司计划将眼睛的前房用作商业服务平台。A.C. 是保护该技术专利的发明人之一。
致谢
我们感谢 Camillo Ricordi 博士、Antonello Pileggi 博士、R. Damaris Molano 博士、Stephan Speier 博士和 Daniel Nyqvist 博士富有成效的讨论。同时感谢 Eleut Hernandez 和 Diego Espinosa-Heidmann 提供的技术支持，以及 Mike Valdes 和 Margaret Formoso 在视频录制方面的帮助。Byron Maldonado 负责视频的录制、编辑和最终制作。本研究得到了糖尿病研究所基金会（www.DiabetesResearch.org）的支持，以及美国国立卫生研究院/国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所/国家过敏与传染病研究所（NIH/NIDDK/NIAID）的资助（M.H.A. 获 F32DK083226；A.C. 获 NIH RO3DK075487；P-O.B. 获 U01DK089538）。P-O.B. 还获得了来自卡罗林斯卡学院、瑞典研究理事会、瑞典糖尿病基金会、Erling-Persson 家庭基金会、Knut 和 Alice Wallenberg 家庭基金会、Skandia 保险公司有限公司、VIBRANT（FP7-228933-2）、卡罗林斯卡学院糖尿病战略研究计划、诺和诺德基金会以及 Berth von Kantzow 基金会的额外研究资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 异氟烷（Isoflurane） | Buttler Animal Health Supply | 11695-6775-2 | 99.9% 异氟烷/ml |
| 氯胺酮注射液（Ketaset, Ketamine HCL） | Fort Dodge Animal Health | 0856-2013-01 | 替代性注射用麻醉剂 |
| 布托啡诺盐酸盐（Beprenex, Buprenorphine HCL） | Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. | 12496-075-7-1 | 0.3 mg/ml |
| 红霉素眼膏 USP，0.5% | Akron | 17478-070-35 | 用于移植眼的预防性涂抹 |
| 0.9% 氯化钠（生理盐水） | Hospira Inc. | 0409-7983-03 | 用于静脉注射，无菌 |
| PBS | Gibco | 10010-023 | 1X，无菌 |
| CMRL 1066 培养基 | Cellgro | 98-304-CV | 添加物补充，CIT 改良型，胰岛培养首选培养基 |
参考文献
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